可用于治疗异染性脑白质营养不良的组合物


背景技术：

1.异染性脑白质营养不良(mld)是一种单基因常染色体隐性鞘脂贮积病，其由编码溶酶体酶arsa的基因中的突变引起(von figura等人，2001；gieselmann和krageloh-mann，2010)。arsa缺陷导致其天然底物的累积，所述天然底物是硫酸化半乳糖神经鞘脂(半乳糖神经酰胺-3-o-硫酸酯和半乳糖鞘氨醇-3-o-硫酸酯)，通常称为硫苷脂。除外周神经系统(pns)中的施万细胞和巨噬细胞之外，硫苷脂还在中枢神经系统(cns)中的少突胶质细胞、小胶质细胞和某些类型的神经元的溶酶体内累积(peng和suzuki，1987)。虽然pns和cns是主要受影响的，但硫苷脂贮存也在内脏器官中发生；最值得一提的是，肾脏、肝脏(toda等人，1990)和胆囊(rodriguez-waitkus等人，2011；mcfadden和ranganathan，2015)。
2.mld患者(即，在两个等位基因上均携带突变的那些患者)通常具有其为基于合成底物的测定中对照值的0
–
10％的arsa酶活性。具有单个突变的arsa等位基因和一个正常等位基因的arsa突变携带者是临床上不受影响的，且通常具有其为对照值的大约10％的arsa酶活性，而具有假性缺陷(pd，另一种遗传上不同的arsa缺陷形式)等位基因的无症状个体具有其为健康对照的大约10-20％的arsa酶活性(gomez-ospina，2017)。在临床上，可以基于跨越疾病严重程度的广泛连续谱的症状发病年龄来区分三种形式的mld：快速进展的严重晚期婴儿形式、幼年形式和迟发性缓慢进展的成人形式，分别占mld诊断的50％-60％、20-30％和15-20％(gomez-ospina，2017，wang等人，2011)。婴儿型mld被视为孤儿病。晚期婴儿型mld具有在30个月之前的发病，并且是该疾病的最严重形式。晚期婴儿形式具有统一的临床表现和快速进展的可预测的病程。取决于研究，幼年型mld的特征在于30个月至16岁之间的发病年龄，具有6岁零2个月(kehrer等人，2011a)至10岁(mahmood等人，2010)的发病年龄中值。为了更好地表征临床表型，已描述了幼年型mld患者的子集，称为早期幼年型mld，其具有≤6岁的临床发作，并且与患有晚期婴儿型mld的儿童相比，具有相似，尽管较不快速的初始疾病演变(biffi等人，2008；chen等人，2016；sessa等人，2016)。早期幼年和晚期婴儿表型统称为早发型mld(sessa等人，2016)。在晚期幼年型mld患者(即，症状发作在7-16岁之间的那些患者)中，通常首先发展出行为问题、注意力缺陷或认知下降，有时与步态障碍组合。
3.不存在批准的用于mld的治愈或疾病修正疗法。由于mld由缺陷型arsa引起，因此各种调查方法旨在通过替换受影响的cns神经组织中的功能性arsa来校正生物化学缺陷。酶替代疗法(ert)和造血干细胞移植(hsct)依赖于对arsa缺陷细胞提供正常酶，而基因治疗方法基于野生型arsa在不同细胞类型中的过表达(patil和maegawa，2013)。使用脐带血(ucb)、同种异体外周血干细胞或同种异体骨髓的造血干细胞移植(hsct)的功效取决于mld表型，以及相对于患者疾病状态的干预时机(patil和maegawa，2013；van rappard等人，2015)。骨髓移植(bmt)对于最佳结果需要人白细胞抗原匹配的同胞供体的可用性(boucher等人，2015)，并且携带移植和调理相关并发症的风险，例如移植物抗宿主病(gvhd)、感染和死亡。脐带血(ucb)移植提供了bmt的替代方案，其优点是更快速的可用性、gvhd的风险更低、死亡率更低、完整供体嵌合性的更高比率、以及酶促缺陷的更好校正(batzios和
zafeiriou，2012；martin等人，2013)。然而，bmt在欧洲并非广泛可用的。脑植入是缓慢的，从细胞植入、迁移到cns、分化和恢复酶水平经常需要数月时间。此外，用hsct达到的生理学酶水平可能不足以校正在cns各处的缺陷。这可以解释为什么移植在快速进展性早发型mld中是无效的，并且即使在症状出现之前执行时，也无法校正或稳定疾病的所有方面(de hosson等人，2011；martin等人，2013；boucher等人，2015)。
4.因此，仍然存在关于可以停止或预防这些患者的疾病进展的快速起效疗法的基本未满足的需求。
5.除hsct之外，还存在各种其它基于细胞的方法，其(过)表达arsa并且将酶递送到受影响的细胞并治疗mld的神经系统表现，包括微囊化的重组细胞、少突胶质细胞和神经祖细胞以及胚胎干细胞。这些细胞疗法在动物模型中已显示了相当大的硫苷脂贮存清除率(patil和maegawa，2013)，但仍未在人中进行测试。
6.已尝试了离体慢病毒基因疗法，其通过用人arsa编码慢病毒载体转导自体cd34+细胞，并且将基因校正的细胞重新施用于患者，将造血干细胞移植与基因疗法组合(hsc-gt)(biffi等人，2013)。虽然这种疗法对于在症状出现之前阶段(在年长的患病同胞中诊断后)鉴定的患者很有希望，但它尚未显示在已经有症状的患者中是有效的。不幸的是，大多数新的mld诊断在症状发作后做出，因为新生儿筛查尚不可用，这使其成为对于许多mld患者不太可能的治疗选项。另外，存在清髓调理方案固有的风险，以及与这些整合载体相关的插入诱变的风险。
7.nhp中的药理学-毒理学研究证实了，由于局限于注射部位周围的脑部炎症(脑炎)而显著的剂量限制性毒性(zerah等人，2015)。评价aavrh10介导的arsa基因转移在患有早发型mld的儿童的脑中的安全性和功效的1/2期临床研究正在进行中(nct01801709)(aubourg，2016)，同样地涉及在脑白质的12个部位处的大脑内载体施用(zerah等人，2015)。除了摘要形式之外，该试验的结果尚未公布，其初步报告提示了在预防发作或停止疾病进展方面的功效缺乏(sevin等人，2018)。关于功效缺乏的原因尚未由试验的发起人加以讨论。除aavrh10介导的基因疗法之外，大脑内递送的慢病毒基因疗法也正在募集患有任何形式mld的患者(nct03725670)。
8.酶替代疗法(ert)现在是用于几种溶酶体贮积病(lsd)的护理标准(soc)(sands，2014)，并且依赖于细胞经由6-磷酸甘露糖受体吸收输入的酶的能力(ghosh等人，2003)。在mld中，ert减少了arsa-/-小鼠的肾脏、外周神经和cns中的硫苷脂贮存(matzner等人，2005)。在对人arsa和超正常硫苷脂合成具有免疫耐受性的加重的mld小鼠模型中，仅在早期时间点治疗的小鼠中可见mld症状的改善和硫苷脂贮存的减少，提示了iv施用的ert可能在具有晚期症状的患者中无效(mathes等人，2012)。在同一模型中，重组arsa的连续it输注以绕过bbb(stroobants等人，2011)导致硫苷脂贮存的完全逆转和cns功能障碍的校正，而小鼠中的其它非临床研究导致减少的硫苷脂贮存和改善的功能结果(matzner等人，2009；piguet等人，2012)。然而，在人中，用ert的代谢校正程度不太可能足以及时地阻止早发型mld中出现的快速大脑脱髓鞘(rosenberg等人，2016)。由于bbb限制了大多数大蛋白对cns的接近，因此认为ert很可能仅在直接递送到cns时才有效(abbott，2013)，并且短半衰期将需要频繁施用。这一假设在ert临床试验中得到证实，所述ert临床试验尝试通过频繁的高剂量iv注射(nct00681811)或it注射(giugliani等人，2018)来克服这些局限性。然而，连同
在早发型和晚期幼年型mld中it施用的ert(nct01510028)一起，具有iv施用的ert的晚期婴儿型mld患者中的结果是令人失望的(nct00418561)。
9.基于小分子的治疗可以潜在地克服用于mld的当前疗法的局限性(例如，通过跨越bbb)，并且还可能解决该疾病的不同致病机制。华法林(香豆定)是一种抗凝血剂，其已在晚期婴儿型mld患者的小队列中作为底物还原剂进行测试。不存在对尿硫苷脂水平或脑生物标记物n-乙酰天冬氨酸和肌醇水平的有益作用(patil和maegawa，2013)。
10.与用其它调查方法获得的总体令人失望的非临床结果组合，hsct和hsc-gt的有限益处、限制群体、治疗窗短和相关风险，代表了关于其它可行治疗选项的显著未满足的临床需求，尤其是对于早发型mld患者。
11.期望的是用于治疗与异常arsa基因和/或异染性脑白质营养不良相关的状况的替代治疗学。


技术实现要素：

12.本文提供的是治疗性、重组和复制缺陷型腺相关病毒(raav)，其可用于治疗有需要的受试者的与芳基硫酸酯酶a基因(arsa)突变相关的疾病(例如异染性脑白质营养不良，即mld，或arsa假性缺陷)。raav期望地是复制缺陷型的，并且携带包含以下的载体基因组：反向末端重复(itr)、以及在调控序列的控制下的编码功能性人芳基硫酸酯酶a(harsa)的核酸序列，所述调控序列指导靶细胞中的harsa表达。在某些实施方案中，raav进一步包含其中包装了载体基因组的aavhu68衣壳。在某些实施方案中，载体基因组对于aavhu68衣壳是完全外源的，因为它不含aavhu68基因组序列。
13.在某些实施方案中，功能性harsa具有信号肽和seq id no:2的氨基酸(aa)19至aa507的序列。在某些实施方案中，使用天然harsa信号肽，例如seq id no:2的aa 1至aa 18。在某些实施方案中，信号肽是seq id no:4的aa 1至aa 20。在某些实施方案中，功能性harsa具有seq id no:2或seq id no:4的氨基酸序列。
14.在某些实施方案中，harsa编码序列与seq id no:1的核苷酸(nt)55至nt 1521具有约95％至100％同一性。在某些实施方案中，harsa编码序列是seq id no:1或seq id no:3。在一个进一步的实施方案中，harsa编码序列编码seq id no:2的氨基酸(aa)19至aa 507的序列。在再进一步的实施方案中，harsa编码序列编码seq id no:2或seq id no:4的序列。
15.在某些实施方案中，调控序列包含下述中的一种或多种：衍生自鸡β肌动蛋白(ba)启动子和人巨细胞病毒立即早期增强子(cmv ie)的调控元件(例如，cb7启动子，seq id no:5的nt 198至nt 862)、由鸡ba剪接供体和兔β珠蛋白(rbg)剪接受体元件组成的嵌合内含子(例如，ci，seq id no:5的nt 956至nt 1928)、以及衍生自rbg基因的多聚腺苷酸化(polya)信号(例如，rbg，seq id no:5的nt 3539至nt 3665)。在某些实施方案中，载体基因组具有seq id no:5的核苷酸(nt)1至nt 3883的序列。在某些实施方案中，raav或包含raav的组合物可施用于有需要的受试者，以改善与arsa突变相关的疾病(例如mld)的症状，和/或延迟与arsa突变相关的疾病(例如mld)的进展。
16.在另一个方面，提供了可用于生产raav的生产系统。在该系统中，培养包含以下的细胞：编码aavhu68衣壳蛋白的核酸序列、如本文所述的载体基因组以及足够的aav rep功
能和辅助功能，以允许将载体基因组包装到aav衣壳内。
17.在一个方面，本文提供的是载体，其可用于治疗有需要的受试者的与arsa突变相关的疾病(例如mld)。该载体携带在调控序列的控制下的编码功能性人芳基硫酸酯酶a(harsa)的核酸序列，所述调控序列指导靶细胞中的harsa表达。在某些实施方案中，harsa编码序列与seq id no:1具有约95％至100％同一性。另外或可替代地，功能性harsa蛋白具有seq id no:2的氨基酸序列。在某些实施方案中，harsa编码序列是seq id no:1。在某些实施方案中，载体或包含载体的组合物可施用于有需要的受试者，以改善与arsa突变相关的疾病(例如mld)的症状，和/或延迟与arsa突变相关的疾病(例如mld)的进展。
18.在一个进一步方面，本文提供的是包含如本文所述的raav或载体和水性悬浮介质的组合物。在某些实施方案中，提供了包含制剂缓冲液和如所述的raav或载体的水性组合物。在某些实施方案中，制剂缓冲液包含：人工脑脊液，其包含缓冲盐水以及钠、钙、镁、钾或其混合物中的一种或多种；和表面活性剂。在某些实施方案中，制剂缓冲液包含约0.0005％至约0.001％的表面活性剂。在某些实施方案中，组合物处于7.2至7.8的ph下。
19.在另一个方面，提供了治疗患有与arsa突变相关的疾病(例如mld)的受试者、或改善与arsa突变相关的疾病(例如mld)的症状、或延迟与arsa突变相关的疾病(例如mld)的进展的方法。该方法包括向有需要的受试者施用有效量的如本文所述的raav或载体。在某些实施方案中，载体或raav可经由大池内注射(icm)，例如ct引导的枕下注射到大池内施用于患者。在某些实施方案中，提供了载体或组合物，其可施用于7岁或更年幼、或者6岁或更年幼的患有异染性脑白质营养不良的患者。在某些实施方案中，该方法涉及以单一剂量将raav或载体递送至人患者。
20.本发明的这些方面和其它方面根据本发明的下述详细描述是显而易见的。
附图说明
21.图1提供了改造的harsa编码序列(seq id no:1，即seq id no:3的nt 7至nt 1527和seq id no:5的nt 1968至nt 3488)。
22.图2提供了aav.cb7.ci.harsaco.rbg载体基因组的线性图谱。载体基因组在遍在的cb7启动子的控制下表达改造形式的人arsa(harsaco)。cb7由cmv ie增强子和鸡ba启动子之间的杂合体组成。arsa，芳基硫酸酯酶a；ba，β肌动蛋白；cmv ie，巨细胞病毒立即早期；itr，反向末端重复；polya，多聚腺苷酸化；和rbg，兔β珠蛋白。
23.图3提供了称为penn.aav.cb7.ci.harsaco.rbg.kanr的顺式质粒的线性图谱。ba，β肌动蛋白；bp，碱基对；cmv ie，巨细胞病毒立即早期；harsaco，人芳基硫酸酯酶a(改造的)；itr，反向末端重复；kanr，卡那霉素抗性；ori，复制起点；polya，多聚腺苷酸化；rbg，兔β珠蛋白。
24.图4提供了反式质粒paav2/hu68.kanr的线性图谱。aav2，腺相关病毒血清型2；aavhu68，腺相关病毒血清型hu68；bp，碱基对；cap，衣壳；kanr，卡那霉素抗性；ori，复制起点；rep，复制酶。
25.图5a和5b提供了腺病毒辅助质粒paddeltaf6(kanr)。图5a显示了通过中间体padδf1和padδf5，从亲本质粒pbhg10衍生辅助质粒padδf6。图5b显示了padδf6中的氨苄青霉素抗性基因替换为卡那霉素抗性基因，以生成padδf6(kan)。
26.图6提供了用于生产aavhu68.harsaco载体的制造工艺流程图解。aav，腺相关病毒；aex，阴离子交换；crl，charles river laboratories；ddpcr，微滴式数字聚合酶链反应；dmem，达尔贝科改良伊格尔培养基；dna，脱氧核糖核酸；ffb，最终制剂缓冲液；gc，基因组拷贝；hek293，人胚肾293细胞；itffb，鞘内最终制剂缓冲液；pei，聚乙烯亚胺；sds-page，十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳；tff，切向流过滤；usp，美国药典；wcb，工作细胞库。
27.图7提供了用于aavhu68.harsaco载体的制造工艺流程图解。ad5，腺病毒血清型5；auc，分析超速离心；bds，原料药(bulk drug substance)；bsa，牛血清白蛋白；cz，crystal zenith；ddpcr，微滴式数字聚合酶链反应；e1a，早期区1a(基因)；elisa，酶联免疫吸附测定；fdp，填充药物产品；gc，基因组拷贝；hek293，人胚肾293细胞；itffb，鞘内最终制剂缓冲液；kanr，卡那霉素抗性(基因)；ms，质谱法；ngs，下一代测序；qpcr，定量聚合酶链反应；sds-page，十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳；tcid
50
，50％组织培养物感染剂量；uplc，超高效液相层析；usp，美国药典。
28.图8显示了在aavhu68.cb7.ci.harsaco.rbg载体的侧脑室内施用之后，小鼠的左右大脑半球中的arsa酶活性。六周龄的c57bl6/j野生型小鼠接受aavhu68.cb7.ci.harsaco.rbg载体的单次icv注射到右脑室内，其剂量为1.00x10
10
gc(低剂量)或1.00x10
11
gc(高剂量)(n＝5/组)。年龄匹配的c57bl6/j野生型小鼠将作为对照的pbs icv施用到右脑室内(n＝4)。21天后对小鼠进行尸检，并且基于显色底物4-硝基儿茶酚硫酸酯的水解速率(nmol/mg/hr)，测量左右大脑半球中的arsa酶活性。arsa，芳基硫酸酯酶a(蛋白质)；gc，基因组拷贝；icv，侧脑室内；n，动物数目；pbs，磷酸盐缓冲盐水。关于更多细节，参见实施例2。
29.图9a至9b显示了在aavhu68.cb7.ci.harsaco.rbg载体的侧脑室内施用之后，小鼠的肝脏和血清中的arsa酶活性。六周龄的c57bl6/j野生型小鼠接受aavhu68.cb7.ci.harsaco.rbg载体的单次icv注射到右脑室内，其剂量为1.00x10
10
gc(低剂量)或1.00x10
11
gc(高剂量)(n＝5/组)。年龄匹配的c57bl6/j野生型小鼠将作为对照的pbs icv施用到右脑室内(n＝4)。21天后对小鼠进行尸检，并且基于显色底物4-硝基儿茶酚硫酸酯的水解速率(nmol/mg/hr)，测量图9a血清和图9b肝脏中的arsa酶活性。arsa，芳基硫酸酯酶a(蛋白质)；gc，基因组拷贝；icv，侧脑室内；n，动物数目；pbs，磷酸盐缓冲盐水。
30.图10显示了在小鼠中aavhu68.cb7.ci.harsacoha.rbg的侧脑室内施用之后，arsa递送至脑中的神经元和少突胶质细胞。六周龄的c57bl6/j野生型小鼠接受aavhu68.cb7.ci.harsacoha.rbg的单次icv注射到右脑室内，其剂量为1.00x10
10
gc(低剂量)或1.00x10
11
gc(高剂量)(n＝5/组)。年龄匹配的c57bl6/j野生型小鼠将作为对照的pbs icv施用到右脑室内(n＝5)。21天后对小鼠进行尸检，并获得脑组织。将组织切片并进行免疫染色，以显现arsa(绿色：用异硫氰酸荧光素缀合的二抗检测到的抗ha一抗)和少突胶质细胞(红色：用四甲基罗丹明缀合的二抗检测到的抗olig2一抗)。脑皮层的代表性图像以20x放大率显示，具有500ms的曝光时间。裁剪且放大的视图(底行)显示了来自表达arsa的皮层下白质的少突胶质细胞。arsa，芳基硫酸酯酶a(蛋白质)；gc，基因组拷贝；ha，血凝素；icv，侧脑室内；n，动物数目；olig2，少突胶质细胞转录因子2；pbs，磷酸盐缓冲盐水。
31.图11显示了在aavhu68.cb7.ci.harsaco.rbg的大池内施用之后，非人灵长类动物的脑脊液中的arsa活性水平。成年食蟹猴接受aavhu68.cb7.ci.harsaco.rbg的单次icm施
用，其剂量为3.00x10
12
gc(ld)、1.00x10
13
gc(md)或3.00x10
13
gc(hd)(n＝2/组)。在aavhu68.cb7.ci.harsaco.rbg施用(第0天)后，在第7、14
±
1、21
±
1、35
±
1和42
±
2天时收集csf。arsa活性通过显色底物4-硝基儿茶酚硫酸酯的水解速率(nmol/[hr*ml])进行测量。扣除内源性猕猴arsa活性，其定义为每个个体在icm施用之前的基线arsa活性水平，以获得起因于aavhu68.cb7.ci.harsaco.rbg施用的arsa活性。虚线代表每个个体的基线arsa活性水平。arsa，芳基硫酸酯酶a(蛋白质)；csf，脑脊液；gc，基因组拷贝；hd，高剂量；icm，大池内，ld，低剂量；md，中剂量；n，动物数目。来自图例的箭头用于指示每次试验。
[0032]
图12a和12b提供了在aavhu68.cb7.ci.harsaco.rbg的大池内施用之后，非人灵长类动物的脑脊液和血清中的抗arsa抗体水平。成年食蟹猴在第0天时接受aavhu68.cb7.ci.harsaco.rbg的单次icm施用，其剂量为3.00x10
12
gc(ld)、1.00x10
13
gc(md)或3.00x10
13
gc(hd)(n＝2/组)。未治疗的年龄匹配的食蟹猴充当对照(n＝2)。在aavhu68.cb7.ci.harsaco.rbg施用(第0天)后，在第7、14
±
1、21
±
1、35
±
1和42
±
2天时收集csf。在第7、14
±
1、21
±
1、28
±
1、35
±
1和42
±
2天时收集血清。使用由重组人arsa预包被的平板，对csf(稀释度1:20，图12a)和血清(稀释度1:1000，图12b)执行间接elisa，以测量抗harsa抗体水平(在450nm处的吸光度)。虚线代表未治疗对照中的吸光度平均值。arsa，芳基硫酸酯酶a(蛋白质)；csf，脑脊液；elisa，酶联免疫吸附测定；gc，基因组拷贝；harsa，人芳基硫酸酯酶a；hd，高剂量；icm，大池内，ld，低剂量；md，中剂量；n，动物数目。来自图例的箭头用于指示每次试验。
[0033]
图13a-13l显示了在aavhu68.cb7.ci.harsaco.rbg的大池内施用之后，非人灵长类动物的脑中的人arsa表达。成年食蟹猴接受aavhu68.cb7.ci.harsaco.rbg的单次icm施用，其剂量为3.00x10
13
gc(hd)(n＝2)。未治疗的年龄匹配的食蟹猴充当对照(n＝2)。在aavhu68.cb7.ci.harsaco.rbg施用后42
±
2天，对动物进行尸检，并且获得脑用于使用识别人arsa的抗体的免疫组织化学染色(棕色沉淀物)。显示了关于一只aavhu68.cb7.ci.harsaco.rbg治疗的动物，穿过脑的皮层(图13e、图13f、图13g、图13i和图13j)、海马(图13h)、丘脑(图13k)和小脑(图13l)的代表性切片图像，连同用于信号比较的来自未治疗对照的切片(图13a、图13b、图13c和图13d)。arsa，芳基硫酸酯酶a(蛋白质)；gc，基因组拷贝；hd，高剂量；icm，大池内；n，动物数目。
[0034]
图14a、图14b、图14c、图14d、图14e、图14f、图14g、图14h和图14i提供了在aavhu68.cb7.ci.harsaco.rbg的大池内施用之后，非人灵长类动物的脊髓和背根神经节中的人arsa表达。成年食蟹猴接受aavhu68.cb7.ci.harsaco.rbg的单次icm施用，其剂量为3.00x10
13
gc(hd)(n＝2)。未治疗的年龄匹配的食蟹猴充当对照(n＝2)。在aavhu68.cb7.ci.harsaco.rbg施用后42
±
2天，对动物进行尸检，并且获得颈、胸和腰脊髓以及drg的切片，用于使用识别人arsa的抗体的免疫组织化学染色(棕色沉淀物)。显示了关于一只aavhu68.cb7.ci.harsaco.rbg治疗的动物的切片的代表性图像(图14d、图14e、图14f、图14g、图14h和图14i)，连同用于信号比较的来自未治疗对照的切片(图14a、图14b和图14c)。arsa，芳基硫酸酯酶a(蛋白质)；gc，基因组拷贝；hd，高剂量；icm，大池内；n，动物数目。
具体实施方式
[0035]
本文提供了用于治疗由芳基硫酸酯酶a(arsa)基因中的突变和/或功能性芳基硫酸酯酶a的正常水平方面的缺陷引起的疾病(例如异染性脑白质营养不良(mld))的组合物和方法。在某些实施方案中，还提供的是用于治疗由arsa基因中的突变和/或功能性芳基硫酸酯酶a的正常水平方面的缺陷引起的疾病或症状的组合物和方法。将有效量的重组腺相关病毒(raav)递送给有需要的受试者，所述重组腺相关病毒具有aavhu68衣壳、以及在其中包装的编码功能性人芳基硫酸酯酶a(harsa)蛋白的载体基因组。期望地，这种raav用水性缓冲液进行配制。在某些实施方案中，悬浮液适合于鞘内注射。在某些实施方案中，raav载体称为aavhu68.harsaco，其中harsa编码序列是改造的harsa编码序列(除非另有说明，否则称为“harsaco”或“harsa”，例如seq id no:1的核苷酸(nt)55至nt 1521、seq id no:3、或与其具有至少约95％至约99.9％同一性的序列)。在某些实施方案中，harsaco是seq id no:1。在某些实施方案中，harsaco是seq id no:3。在某些实施方案中，raav载体称为aavhu68.cb7.harsaco，其中改造的harsa编码序列在调控序列的控制下，所述调控序列包括具有巨细胞病毒增强子的鸡β肌动蛋白启动子(cb7；seq id no:16)。在某些实施方案中，组合物经由大池内注射(icm)进行递送。
[0036]
编码进化枝f腺相关病毒(aav)(其在本文中称为aavhu68)的衣壳的核酸序列，用于产生aavhu68衣壳和携带载体基因组的重组aav(raav)。在wo 2018/160582和该详细描述中提供了与aavhu68有关的另外细节。本文所述的aavhu68载体非常适合于将包含改造的harsa编码序列的载体基因组递送至中枢神经系统(cns)和外周神经系统(pns)内的细胞，所述中枢神经系统包括脑、海马、运动皮层、小脑和运动神经元，所述外周神经系统包括脑和脊髓之外的神经和神经节。这些载体可以用于靶向cns和/或pns内的其它细胞，以及某些其它组织和细胞，例如肾脏或肝脏或胆囊。
[0037]
i.芳基硫酸酯酶a(harsa)
[0038]
芳基硫酸酯酶a(arsa)具有水解硫酸脑苷脂的酶促活性(即，下述反应：3-硫酸脑苷脂+h2o＝脑苷脂+硫酸)。已鉴定了人arsa(harsa)蛋白(uniprotkb-p15289，arsa_human)的两种同种型：p51608-1，seq id no:2；和p51608-2，seq id no:15。在本说明书自始至终，除非另有说明，否则提及arsa是harsa。
[0039]
如本文使用的，功能性harsa蛋白指harsa蛋白的同种型、天然变体、变体、多形体或截短，其具有野生型harsa蛋白(例如p51608-1，seq id no:2；或p51608-2，seq id no:15)的酶促活性(即，酶活性)的至少约10％。参见omim#607574(omim.org/entry/607574)、genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl？gene＝arsa和uniprot.org/uniprot/p15289，所述网页各自整体引入本文作为参考。在某些实施方案中，功能性harsa蛋白具有野生型harsa蛋白(例如p51608-1，seq id no:2；或p51608-2，seq id no:15)的酶促活性的至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍或更多。在某些实施方案中，功能性harsa蛋白具有野生型harsa蛋白(例如p51608-1，seq id no:2；或p51608-2，seq id no:15)的酶促活性的约10％至约15％、约10％至约20％、约10％至约25％、约10％至约30％、约10％至约50％、约10％至约75％、约10％至约90％、约10％至约100％、约10％至约3倍、约15％至约20％、约15％至约25％、约15％至约
30％、约15％至约50％、约15％至约75％、约15％至约90％、约15％至约100％、约15％至约3倍、约20％至约25％、约20％至约30％、约20％至约50％、约20％至约75％、约20％至约90％、约20％至约100％、约20％至约3倍、约25％至约30％、约25％至约50％、约25％至约75％、约25％至约90％、约25％至约100％、约25％至约3倍、约50％至约75％、约50％至约90％、约50％至约100％、约50％至约3倍、约75％至约90％、约75％至约100％或约75％至约3倍。测量harsa酶促活性的方法(例如，经由基于合成底物的测定和/或经由硫苷脂加载测定)可以在实施例以及各种出版物中找到，所述出版物例如kreysing等人，high residual arylsulfatase a(arsa)activity in a patient with late-infantile metachromatic leukodystrophy.am j hum genet.1993年8月；53(2):339-46.；lee-vaupel m和conzelmann e.a simple chromogenic assay for arylsulfatase a.clin chim acta.1987年4月30日；164(2):171-80；等人，enzymatic characterization of novel arylsulfatase a variants using human arylsulfatase a-deficient immortalized mesenchymal stromal cells.hum mutat.2017年11月；38(11):1511-1520.doi:10.1002/humu.23306.电子版2017年9月6日；以及francesco morena等人，a new analytical bench assay for the determination of arylsulfatase a activity toward galactosyl-3-sulfate ceramide:implication for metachromatic leukodystrophy diagnosis.anal chem.2014jan 7；86(1):473-81.doi:10.1021/ac4023555.电子版2013年12月11日。
[0040]
在某些实施方案中，功能性harsa蛋白包含(i)信号肽，和(ii)seq id no:2的氨基酸(aa)19至aa 507的氨基酸序列、或与其具有至少约90％(例如，至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.9％)同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，功能性harsa蛋白包含(i)信号肽，和(ii)seq id no:15的氨基酸序列(即，seq id no:2的aa 85至aa 507)、或与其具有至少约90％(例如，至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.9％)同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，功能性harsa蛋白包含(i)信号肽，(ii)seq id no:2的氨基酸(aa)19至aa 444的氨基酸序列、或与其具有至少约90％(例如，至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.9％)同一性的氨基酸序列，和(iii)seq id no:2的aa 448至aa 507的氨基酸序列、或与其具有至少约90％(例如，至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.9％)同一性的氨基酸序列。在一个进一步的实施方案中，(ii)的氨基酸序列可以通过二硫键连接到(iii)的氨基酸序列。可以利用其它化学键，例如共价键和非共价键(包括氢键合、离子键合、疏水键合和范德华键合)。在再进一步的实施方案中，(ii)和(iii)的氨基酸序列之间的连接由所述键的组合形成。在另一个实施方案中，(ii)和(iii)的氨基酸序列之间的连接是肽接头(参见例如，parts.igem.org/protein_domains/linker)。在某些实施方案中，功能性harsa蛋白包含(i)信号肽，(ii)seq id no:2的氨基酸(aa)85至aa 444的氨基酸序列、或与其具有至少约90％(例如，至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.9％)同一性的氨基酸序列，和(iii)seq id no:2的aa 448至aa 507的氨基酸序列、或与其具有至少约90％(例如，至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.9％)同一性的氨基酸序列。在一个进一步的实施方案中，(ii)的氨基酸序列可以通过二硫键连接到(iii)的氨基酸序列。可以利用其它化学键，例如
共价键和非共价键(包括氢键合、离子键合、疏水键合和范德华键合)。在再进一步的实施方案中，(ii)和(iii)的氨基酸序列之间的连接由所述键的组合形成。在另一个实施方案中，(ii)和(iii)的氨基酸序列之间的连接是肽接头(参见例如，parts.igem.org/protein_domains/-linker)。在某些实施方案中，功能性harsa蛋白包含(i)信号肽，和(ii)seq id no:2的氨基酸(aa)23至aa 348的氨基酸序列、或与其具有至少约90％(例如，至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.9％)同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，功能性harsa蛋白包含(i)信号肽，和(ii)seq id no:2的氨基酸(aa)19至aa 448的氨基酸序列、或与其具有至少约90％(例如，至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.9％)同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，功能性harsa蛋白包含(i)信号肽，和(ii)seq id no:2的氨基酸(aa)448至aa 507的氨基酸序列、或与其具有至少约90％(例如，至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.9％)同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，具有指定同一性的功能性harsa蛋白具有其以下的修饰：基于seq id no:2中的编号，在aa 85至aa 507之外，和/或基于seq id no:2中的编号，在aa 29、69、123、125、150、229、281、282中的任何一个或多个之外，和/或在任何harsa保守结构域(例如，具有pfam:pf00884的硫酸酯酶结构域)之外，和/或基于seq id no:2中的编号，在aa 19至aa 444之外，和/或基于seq id no:2中的编号，在aa 448至aa 507之外，和/或基于seq id no:2中的编号，在aa 23至aa 348之外或其任何组合。参见例如，von b
ü
low r等人，crystal structure of an enzyme-substrate complex provides insight into the interaction between human arylsulfatase a and its substrates during catalysis，j mol biol.2001年1月12日；305(2):269-77。
[0041]
在某些实施方案中，功能性harsa蛋白具有seq id no:2的氨基酸序列、或与其具有至少约90％(例如，至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.9％)同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，功能性harsa蛋白具有seq id no:4的氨基酸序列、或与其具有至少约90％(例如，至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.9％)同一性的氨基酸序列。
[0042]
如本文使用的，信号肽(有时称为信号序列、靶向信号、定位信号、定位序列、转送肽、前导序列或前导肽)是存在于大多数新合成的蛋白质的n末端处的短肽(通常长15-30个氨基酸)，所述蛋白质注定朝向分泌途径(blobel g，dobberstein b(dec 1975)."transfer of proteins across membranes.i.presence of proteolytically processed and unprocessed nascent immunoglobulin light chains on membrane-bound ribosomes of murine myeloma".j cell biol.67(3):835
–
51)。这些蛋白质包括位于某些细胞器(内质网、高尔基体或内体)内部、从细胞中分泌或插入大多数细胞膜内的那些蛋白质。在某些实施方案中，信号肽具有seq id no:2的aa 1至aa 18的氨基酸序列、或seq id no:4的aa 1至aa 20的氨基酸序列。在某些实施方案中，信号肽来自另一种蛋白质，其由cns细胞(例如神经元)、pns细胞或另一种细胞(例如肾细胞或肝细胞)分泌。信号肽优选具有人起源或是人信号肽的衍生物，并且长度为约15至约30个氨基酸，优选约17至25个氨基酸、或约18个氨基酸。在某些实施方案中，信号肽是天然信号肽(seq id no:2的氨基酸1至18)。在某些实施方案中，功能性harsa蛋白包含代替天然信号肽的外源前导序列。在另一个实施方案中，信号肽可以来自人il2或突变的信号肽。在另一个实施方案中，人serpinf1分泌信号可以用作
信号肽。当提及功能性harsa蛋白时，在本文所述的各个实施方案中包括此类嵌合harsa蛋白，其包含外源信号肽和harsa的成熟部分(例如，seq id no:2的aa 19至507、seq id no:2的aa 19至aa 444、seq id no:2的aa 85至aa 507、seq id no:2的aa 23至aa 348、或seq id no:2的aa 448至507)。
[0043]
本文提供的是编码功能性harsa蛋白的核酸序列，称为harsa编码序列或arsa编码序列或harsa或arsa。在某些实施方案中，harsa编码序列是修饰的或改造的(harsa或harsaco)。在某些实施方案中，harsa编码序列具有seq id no:1的核苷酸(nt)55至nt 1521的序列、或与其具有至少95％至99.9％同一性的序列。在某些实施方案中，harsa编码序列是seq id no:1的nt 55至nt 1521、或与其具有至少约70％(例如，至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约99.9％)同一性的核酸序列。在某些实施方案中，harsa编码序列是seq id no:1或与其具有至少95％至99.9％同一性的序列。在某些实施方案中，harsa编码序列是seq id no:1、或与其具有至少约70％(例如，至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约99.9％)同一性的核酸序列。在某些实施方案中，harsa编码序列是seq id no:3或与其具有至少95％至99.9％同一性的序列。在某些实施方案中，harsa编码序列是seq id no:3、或与其具有至少约70％(例如，至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约99.9％)同一性的核酸序列。
[0044]
harsa的转录变体(其也是harsa编码序列)可以作为以下ncbi参考序列发现：nm_000487.5、nm_001085425.2、nm_001085426.2、nm_001085427.2、nm_001085428.2、nm_001362782.1、ab448736.1、ak092752.1、ak098659.1、ak301098.1、ak310564.1、ak315011.1、bc014210.2、bi770997.1、bm818814.1、bp306351.1、bq184813.1、bu632196.1、bx648618.1、ca423492.1、cn409235.1、cr456383.1、da844740.1、db028013.1、gq891416.1、ku177918.1、ku177919.1和x52151.1。ncbi参考序列各自整体引入本文作为参考。在某些实施方案中，修饰或改造的harsa编码序列与ncbi参考序列之一共享小于约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.9％的同一性。在某些实施方案中，修饰或改造的harsa编码序列与ncbi参考序列之一共享约50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.9％的同一性。
[0045]
如本文所述的，“核酸”或“核苷酸”可以是rna、dna或其修饰，并且可以是单链或双链的，并且可以选自例如包括以下的组：编码目的蛋白质的核酸、寡核苷酸、核酸类似物，例如肽-核酸(pna)、假互补pna(pc-pna)、锁核酸(lna)等。此类核酸序列包括例如但不限于编码蛋白质的核酸序列，所述蛋白质例如充当转录阻遏物、反义分子、核酶、小抑制性核酸序列，例如但不限于rnai、shrnai、sirna、微小rnai(mrnai)、反义寡核苷酸等。
[0046]
在核酸序列的上下文中，术语“同一性百分比(％)”、“序列同一性”、“序列同一性百分比”或“同一性百分比”，指当就对应性比对时，两个序列中相同的残基。序列同一性比较的长度可以是在基因组的全长，基因编码序列的全长，或根据需要至少约500至5000个核
苷酸的片段上。然而，例如至少约9个核苷酸，通常至少约20至24个核苷酸、至少约28至32个核苷酸、至少约36个或更多个核苷酸的较小片段之间的同一性也可能是需要的。
[0047]
对于蛋白质、多肽的全长、约32个氨基酸、约330个氨基酸、或其肽片段的氨基酸序列或相应的核酸序列编码序列，可以容易地确定同一性百分比。合适的氨基酸片段的长度可以为至少约8个氨基酸，并且可以高达约700个氨基酸。一般地，当提及两个不同序列之间的“同一性”、“同源性”或“相似性”时，“同一性”、“同源性”或“相似性”参考“比对的”序列进行确定。“比对的”序列或“比对”指与参考序列相比，经常含有关于缺失或另外碱基或氨基酸的校正的多个核酸序列或蛋白质(氨基酸)序列。
[0048]
使用各种可公开获得或商购可得的多序列比对程序(multiple sequence alignment programs)中的任一种来执行比对。用于氨基酸序列的序列比对程序是可用的，例如“clustal x”、“clustal omega”“map”、“pima”、“msa”、“blockmaker”、“meme”和“match-box”程序。一般地，这些程序中的任一个以默认设置使用，尽管本领域技术人员可以根据需要更改这些设置。可替代地，本领域技术人员可以利用另一种算法或计算机程序，其至少提供与通过所提及的算法和程序提供的同一性或比对水平。参见例如，j.d.thomson等人，nucl.acids.res.，“a comprehensive comparison of multiple sequence alignments”，27(13):2682-2690(1999)。
[0049]
用于核酸序列的多序列比对程序也是可用的。此类程序的实例包括“clustal w”、“clustal omega”、“cap sequence assembly”、“blast”、“map”和“meme”，其可通过互联网上的网页服务器访问。此类程序的其它来源是本领域技术人员已知的。可替代地，还使用vector nti实用程序。还存在本领域已知的许多算法，其可以用于测量核苷酸序列同一性，包括上述程序中含有的那些算法。作为另一个实例，可以使用fasta
tm
(gcg版本6.1中的程序)比较多核苷酸序列。fasta
tm
提供查询序列和搜索序列之间的最佳重叠区域的比对和序列同一性百分比。例如，可以使用如引入本文作为参考的gcg版本6.1中提供的fasta
tm
，与其默认参数(字长6和用于评分矩阵的nopam因子)，来确定核酸序列之间的序列同一性百分比。
[0050]
ii.异染性脑白质营养不良(mld)
[0051]
本文提供的是可用于治疗疾病或异常状况的raav、载体、方法和组合物，所述疾病或异常状况由芳基硫酸酯酶a(arsa)基因的突变和/或功能性芳基硫酸酯酶a的正常水平方面的缺陷引起，在本文中称为“疾病”，例如异染性脑白质营养不良(mld)。参见例如，omim.org/entry/250100。
[0052]
异染性脑白质营养不良(mld)可以分类成下述类型：早发型mld，其包括婴儿型mld(通常在等于或早于30个月开始)和早期幼年型mld(通常在30个月至6岁之间开始，包括6岁)；幼年型mld，其包括早期幼年型mld和晚期幼年型mld(通常在7岁至16岁之间开始，包括16岁)；和成人型mld(具有晚于16岁的发病)。晚期婴儿型mld患者具有毁灭性的病程，伴随快速且可预测的下降，其在运动和认知损害两者的呈现方面是同质的(kehrer等人，2011a；sessa等人，2016)。这些儿童中的大多数在5岁前死亡，在98个患者中具有4.2年的平均存活和25％的5年存活(mahmood等人，2010)。患有早期幼年型mld(在30个月至6岁之间的症状发作)的儿童的表型非常相似于患有晚期婴儿型mld的儿童的表型，尽管早期幼年型mld患者可能具有较不快速的初始疾病演变(biffi等人，2008；chen等人，2016；sessa等人，2016)。
function measure)(gmfm))，通过成就年龄、丧失年龄、以及维持或获得运动里程碑的儿童百分比评价的运动里程碑(motor milestones)成就(如通过世界卫生组织(world health organization)[who]标准定义的)延迟，认知功能受损(例如，通过贝利婴儿发育量表(bayley scale of infant development)[bsid-iii]，韦氏儿童智力量表(wechsler intelligence scale for children)，第五版[wisc-v]测量的总智商[iq]和子域iq)，寿命增加(与患者相比)，神经系统临床检查(nce)的异常结果，尺神经、腓深神经、正中神经、腓肠神经的神经传导速度(ncv)减少，通过癫痫发作日记记录的更早的发病年龄和更高的癫痫发作频率，行为功能受损(例如，通过文兰适应行为量表(vineland adaptive behavior scales)，第三版(文兰-iii)测量的)，lansky表现指数(lansky performance index)较低，儿童生活质量量表(pediatric quality of life inventory)(例如，pedsql和pedsql-is)降低，和/或护理人员/父母生活质量降低。
[0058]
在某些实施方案中，疾病症状(例如mld症状，与没有mld的健康对照相比)可以包括异常性质(例如生物标记物活性、电生理活性和/或成像参数)和临床观察(例如，粗大和精细运动功能受损、认知和语言发展受损、神经系统检查结果异常、行为和里程碑发展受损、以及护理人员/父母报告的结果和生活质量评价降低)。
[0059]
异常性质包括但不限于产生髓鞘的少突胶质细胞和施万细胞的功能受损、外周神经传导异常、神经传导速度(ncv)缓慢的外周神经病变、显示典型白质(例如，胼胝体压部和顶枕部白质、投射纤维、小脑白质、基底神经节和丘脑)模式(例如，在异常白质内具有正常信号强度条带的辐射条纹的“虎斑模式”，参见例如，gieselmann和krageloh-mann，2010；martin等人，2012；van rappard等人，2015)；u纤维受累和小脑改变、白质脱髓鞘、尤其是额叶中的双侧白质低密度区、以及反映髓鞘丢失的大脑萎缩)的脑磁共振成像(mri)、脑生物标记物n-乙酰天冬氨酸和肌醇的异常水平。
[0060]
临床观察包括但不限于粗大运动障碍，其表现为笨拙、踮脚走路和频繁跌倒；精细运动技能；步态异常；痉挛性轻截瘫或运动失调；神经肌肉困难；神经系统症状(虚弱的迹象、协调性丧失进展为痉挛和尿失禁)；肌张力减退和深部肌腱反射抑制；癫痫发作；痴呆；癫痫；排尿困难；痉挛；喂养困难；四肢疼痛；语言功能受损；认知技能受损；视力和听力受损；丧失先前获得的运动和认知里程碑；学校或工作表现下降、注意力不集中、异常行为、精神症状、智力损害、无法控制的大笑、皮质障碍(例如失用症、失语症、失认症)、酒精或药物使用、资金管理不善、情绪不稳定、不适当情感和神经精神性症状(包括精神病、精神分裂症、妄想和幻觉)。
[0061]
疾病进展指受试者的疾病症状的发病年龄、出现频率、严重程度或复发。疾病进展的延迟通常意指疾病症状的发病年龄升高、出现频率降低、严重程度降低或较少复发。
[0062]
如上文所述的，术语“增加”、“降低”、“减少”、“改进”、“升高”、“下降”、“更高”、“更少”、“更多”、“改善”、“延迟”、“损害”、“异常”、“增厚”或其任何语法变化、或指示变化的任何类似术语，意指与相应的参考(例如，未治疗的对照或没有mld的处于正常状况的受试者)相比，约5倍、约2倍、约1倍、约90％、约80％、约70％、约60％、约50％、约40％、约30％、约20％、约10％、约5％的变动，除非另有说明。
[0063]
本文的组合物和方法对于有症状的早发型患者提供了速效的疾病修正治疗，对于所述患者不存在标准护理(hsct和hsc-gt是无效的)；和/或提供了可以保存或校正cns病理
状态和外周神经功能两者的疗法，其中后者不能通过hsct校正，并且引起进行性精细和粗大运动功能丧失和呼吸衰竭；和/或提供了hsc-gt的替代治疗选项，所述hsc-gt需要严苛的清髓调理，仅在症状发作之前执行时才是有效的，并且无法基本上解决所有患者的外周神经病变。
[0064]
在某些实施方案中，患者接受在没有本文所述的raav、载体、组合物或方法的情况下，他们对于其将不合格的协同疗法。此类协同疗法可能包括酶替代疗法(ert)，以及经由脐带血(ucb)、同种异体外周血干细胞或同种异体骨髓的造血干细胞移植(hsct)。
[0065]
任选地，免疫抑制协同疗法可以用于有需要的受试者中。用于此类协同疗法的免疫抑制剂包括但不限于糖皮质激素、类固醇、抗代谢物、t细胞抑制剂、大环内酯类(例如雷帕霉素或雷帕霉素类似物)和细胞生长抑制剂，包括烷化剂、抗代谢物、细胞毒性抗生素、抗体或对亲免素有活性的试剂。免疫抑制剂可以包括氮芥、亚硝基脲、铂化合物、氨甲蝶呤、硫唑嘌呤、巯基嘌呤、氟尿嘧啶、更生霉素、蒽环、丝裂霉素c、博来霉素、光神霉素、il-2受体-(cd25-)或cd3-定向抗体、抗-il-2抗体、环孢素、他克莫司、西罗莫司、ifn-β、ifn-γ、阿片类物质或tnf-α(肿瘤坏死因子-α)结合剂。在某些实施方案中，免疫抑制疗法可以在基因疗法施用之前或之后0、1、2、3、4、5、6、7天或更多天起始。此类免疫抑制疗法可以涉及一种、两种或更多种药物(例如糖皮质激素、泼尼松龙(prednelisone)、霉酚酸酯(mmf)和/或西罗莫司(即，雷帕霉素))的施用。此类免疫抑制药物可以以相同剂量或调整剂量施用于有需要的受试者一次、两次或更多次。此类疗法可能涉及在同一天时，两种或更多种药物(例如泼尼松龙、霉酚酸酯(mmf)和/或西罗莫司(即，雷帕霉素))的共施用。这些药物中的一种或多种可以在基因疗法施用后以相同剂量或调整剂量继续。根据需要，此类疗法可以为约1周(7天)、约60天或更长时间。在某些实施方案中，选择不含他克莫司的方案。
[0066]
iii.表达盒
[0067]
本文提供的是也称为表达盒的核酸序列，其包含编码功能性harsa蛋白的harsa编码序列、以及指导靶细胞中的harsa表达的调控序列。如本文使用的，“表达盒”指这样的核酸分子，其包含编码序列(例如，harsa编码序列)、启动子，并且可以包括关于其的其它调控序列。必需的调控序列与harsa编码序列可操作地连接，其方式允许其在靶细胞中的转录、翻译和/或表达。如本文使用的，“可操作地连接的”序列包括与harsa编码序列邻接的表达控制序列、以及反式或在一段距离处起作用以控制harsa编码序列的表达控制序列两者。此类调控序列通常包括例如启动子、增强子、内含子、kozak序列、多聚腺苷酸化序列和tata信号中的一种或多种。在某些实施方案中，启动子是具有巨细胞病毒增强子(cb7)启动子的鸡β肌动蛋白启动子(例如，seq id no:5的nt 198至nt 862，在本文中也称为hsyn或syn)。然而，在某些实施方案中，可以选择其它启动子或另外的启动子。
[0068]
在某些实施方案中，调控序列指导靶细胞中的harsa表达。在某些实施方案中，靶细胞是神经系统细胞、少突胶质细胞、小胶质细胞、中枢神经系统(cns)细胞、cns中的神经元、外周神经系统(pns)细胞、施万细胞、pns中的巨噬细胞、或内脏器官中的细胞(例如，肾细胞、肝细胞和胆囊细胞)。在某些实施方案中，靶细胞可以是中枢神经系统细胞。在某些实施方案中，靶细胞是兴奋性神经元、抑制性神经元、神经胶质细胞、皮层细胞、额叶皮层细胞、大脑皮层细胞、脊髓细胞中的一种或多种。在某些实施方案中，靶细胞是外周神经系统(pns)细胞，例如视网膜细胞。也可以选择除来自神经系统的细胞外的其它细胞作为靶细
胞，如单核细胞、b淋巴细胞、t淋巴细胞、nk细胞、淋巴结细胞、扁桃体细胞、骨髓间充质细胞、干细胞、骨髓干细胞、心脏细胞、上皮细胞、食道细胞、胃细胞、胎儿切割细胞(fetal cut cell)、结肠细胞、直肠细胞、肝细胞、kindly细胞、肺细胞、唾液腺细胞、甲状腺细胞、肾上腺细胞、乳腺细胞、胰腺细胞、胰岛细胞、胆囊细胞、前列腺细胞、膀胱细胞、皮肤细胞、子宫细胞、宫颈细胞、睾丸细胞或任何其它细胞，其在没有mld的受试者中表达功能性harsa蛋白。参见，genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl？gene＝arsa&keywords＝arsa#expression。
[0069]
在某些实施方案中，调控序列包含遍在启动子，例如cb7启动子。在某些实施方案中，调控元件包含kozak序列、多聚腺苷酸化序列、内含子、增强子和tata信号中的一种或多种。
[0070]
在某些实施方案中，可以包括另外或替代的启动子序列作为表达控制序列(调控序列)的部分，例如定位于所选的5’itr序列和编码序列之间。组成型启动子、调控型启动子[参见例如，wo 2011/126808和wo 2013/04943]、组织特异性启动子、或响应生理学线索的启动子可以用于本文所述的载体中。启动子可以选自不同的来源，例如，人巨细胞病毒(cmv)立即早期增强子/启动子、sv40早期增强子/启动子、jc多瘤病毒(polymovirus)启动子、髓鞘碱性蛋白(mbp)或神经胶质原纤维酸性蛋白(gfap)启动子、单纯疱疹病毒(hsv-1)潜伏期相关启动子(lap)、劳斯肉瘤病毒(rsv)长末端重复(ltr)启动子、神经元特异性启动子(nse)、血小板衍生生长因子(pdgf)启动子、hsyn、黑色素浓缩激素(mch)启动子、cba、基质金属蛋白启动子(mpp)和鸡β肌动蛋白启动子。
[0071]
除启动子之外，表达盒还可以含有一种或多种其它适当的转录起始序列、转录终止序列、增强子序列、有效的rna加工信号例如剪接和多聚腺苷酸化(polya)信号；稳定细胞质mrna的序列，例如wpre；增强翻译效率的序列(即，kozak共有序列)；增强蛋白质稳定性的序列；以及在需要时，增强编码产物的分泌的序列。合适的增强子的一个实例是cmv增强子。其它合适的增强子包括对于所需靶组织适应症适当的那些增强子。在一个实施方案中，调控序列包含一种或多种表达增强子。在一个实施方案中，调控序列含有两种或更多种表达增强子。这些增强子可以是相同的或可以是彼此不同的。例如，增强子可以包括cmv立即早期增强子(seq id no:19)。这种增强子可以存在于彼此定位相邻的两个拷贝中。可替代地，增强子的双重拷贝可以由一种或多种序列分开。在另外一个实施方案中，表达盒进一步含有内含子，例如鸡β肌动蛋白内含子(seq id no:17)。在某些实施方案中，内含子是嵌合内含子(ci)
–
由人β珠蛋白剪接供体和免疫球蛋白g(igg)剪接受体元件组成的杂合内含子。其它合适的内含子包括本领域已知的那些内含子，例如wo 2011/126808中描述的。合适的polya序列的实例包括例如兔珠蛋白polya、sv40、sv50、牛生长激素(bgh)、人生长激素和合成polya。任选地，可以选择一种或多种序列来稳定mrna。此类序列的实例是修饰的wpre序列，其可以在polya序列的上游和编码序列的下游进行改造(参见例如，ma zanta-boussif等人，gene therapy(2009)16:605-619)。在某些实施方案中，不存在wpre序列。
[0072]
任选地，在某些实施方案中，除harsa编码序列之外，还可以包括另一种感兴趣的非aav编码序列，例如肽、多肽、蛋白质、功能性rna分子(例如mirna、mirna抑制剂)或其它基因产物。有用的基因产物可以包括mirna。mirna和其它小干扰核酸经由靶rna转录物切割/降解、或者靶信使rna(mrna)的翻译阻遏来调控基因表达。mirna是天然表达的，通常作为最终的19-25种非翻译的rna产物。mirna通过与靶mrna的3'非翻译区(utr)的序列特异性相互
作用显示出其活性。这些内源性表达的mirna形成发夹前体，其随后被加工成mirna双链体，并且进一步加工成“成熟”的单链mirna分子。这种成熟的mirna引导多蛋白复合物mirisc，其基于其与成熟mirna的互补性来鉴定例如在靶mrna的3
′
utr区域中的靶位点。
[0073]
在某些实施方案中，表达盒可以进一步包含背根神经节(drg)特异性mirna脱靶序列，以调节cns或外周背根神经节中的表达水平。在某些实施方案中，表达盒或载体基因组包含在对于基因产物编码序列3’的非翻译区(utr)中的一种或多种mirna靶序列。在某些实施方案中，存在对于mir-183、mir-182或mir-96特异性的至少一种靶序列。在某些实施方案中，至少两种drg特异性mirna靶序列定位于harsa编码序列5'和3'两者。在某些实施方案中，关于表达盒mrna或dna正链的至少第一mirna靶序列和/或至少第二mirna靶序列的mirna靶序列选自(i)agtgaattctaccagtgccata(mir183，seq id no:20)；(ii)agcaaaaatgtgctagtgccaaa(seq id no:21)，(iii)agtgtgagttctaccattgccaaa(seq id no:22)；以及(iv)agggattcctgggaaaactggac(seq id no:23)。在某些实施方案中，构建体进一步包含至少两个串联重复，其包含至少第一mirna靶序列、以及可以相同或不同的至少第二mirna靶序列。在某些实施方案中，串联mirna靶序列是连续的或由1至10个核酸的间隔区分开，其中所述间隔区不是mirna靶序列。在某些实施方案中，存在定位于harsa编码序列3'的至少两种drg特异性mirna靶序列。在某些实施方案中，至少两个drg特异性mirna串联重复中的第一个的起点在距离harsa编码序列的3'端20个核苷酸内。在某些实施方案中，至少两个drg特异性mirna串联重复中的第一个的起点距离harsa编码序列的3'端至少100个核苷酸。在某些实施方案中，mirna串联重复包含长度200至1200个核苷酸。在某些实施方案中，存在定位于harsa编码序列5'的至少两种drg特异性mirna靶序列。在某些实施方案中，两个或更多个连接的mirna靶序列是连续的，并不被间隔区分开。在某些实施方案中，两个或更多个mirna靶序列由间隔区分开，并且每个间隔区独立地选自(a)ggat；(b)cacgtg；或(c)gcatgc中的一种或多种。在某些实施方案中，定位于mirna靶序列之间的间隔区可以定位于第一个mirna靶序列的3’和/或最后一个mirna靶序列的5’。在某些实施方案中，mirna靶序列之间的间隔区是相同的。
[0074]
参见于2018年12月21日提交的临时美国专利申请号62/783,956、以及于2019年12月20日提交的国际申请号pct/us2019/067872，其在此引入作为参考。在某些实施方案中，在表达盒或载体基因组中不包括mir序列。
[0075]
iv.aavhu68
[0076]
被选择作为用于aavhu68.cb7.ci.harsaco.rbg的衣壳的aavhu68血清型，在氨基酸水平上与aav9具有99％同一性。aavhu68在nhp和小鼠的神经系统中展示与aav9可比较的转导特性。这包括皮层神经元的广泛转导(数据未显示)和产生髓鞘的少突胶质细胞的小子集。另外，aavhu68转导具有轴突投射pns内的运动神经元、以及具有轴突投射脊髓和外周神经内的drg感觉神经元(数据未显示)。在腹角的下运动神经元和drg的感觉神经元中观察到转导。转导的运动神经元具有有助于外周神经的轴突。因此，aavhu68衣壳靶向在mld患者中均受影响的cns和pns中的细胞。另外，虽然新合成的arsa可以直接从反面高尔基体网络转运到溶酶体，但它也可以经由6-磷酸甘露糖受体被分泌并由其它细胞吸收，在所述细胞中，它随后运输到溶酶体。因此，潜在的缺陷可以通过表达arsa酶的raavhu68.harsa进行交叉校正，所述arsa酶供应给缺乏功能性酶的cns的相邻细胞。aavhu68(以前称为aav3g2)通过
基于seq id no:7的编号，在vp1的位置67和157处的两个编码氨基酸，与另一种进化枝f病毒aav9不同。相比之下，其它进化枝faav(aav9、hu31、hu31)具有在位置67处的ala和在位置157处的ala。提供的是新型aavhu68衣壳和/或改造的aav衣壳，其具有基于seq id no:7的编号，在位置157处的缬氨酸(val或v)，以及任选地，基于seq id no:7的编号，在位置67处的谷氨酸(glu或e)。在某些实施方案中，aav衣壳血清型(stereotype)可以选自aavhu31 vp1(seq id no:11和12)或aavhu32vp1(seq id no:13和14)。
[0077]
如本文使用的，当术语“进化枝”涉及aav组时，它指在系统发育上彼此相关的aav组，如使用neighbor-joining算法，通过至少75％(至少1000次重复)的自举值和不大于0.05的泊松校正距离测量值，基于aav vp1氨基酸序列的比对确定的。neighbor-joining算法已在文献中进行描述。参见例如，m.nei和s.kumar，molecular evolution and phylogenetics(oxford university press，new york(2000)。可以用于实现这种算法的计算机程序是可用的。例如，mega v2.1程序实现改良的nei-gojobori方法。使用这些技术和计算机程序，以及aav vp1衣壳蛋白的序列，本领域技术人员可以容易地确定所选的aav是包含在本文鉴定的进化枝之一中，在另一个进化枝中，还是在这些进化枝之外。参见例如，g gao等人，j virol，2004jun；78(10):6381-6388，其鉴定了进化枝a、b、c、d、e和f，并且提供了新型aav的核酸序列，genbank登录号ay530553至ay530629。还参见wo 2005/033321。
[0078]
在某些实施方案中，aavhu68衣壳的进一步特征在于下述中的一种或多种。aavhu68衣壳蛋白包含：通过由核酸序列(其编码seq id no:7的1至736的预测氨基酸序列)表达产生的aavhu68 vp1蛋白，由seq id no:6产生的vp1蛋白，或由与seq id no:6(其编码seq id no:7的1至736的预测氨基酸序列)具有至少70％同一性的核酸序列产生的vp1蛋白；通过由核酸序列(其编码seq id no:7的至少约氨基酸138至736的预测氨基酸序列)表达产生的aavhu68 vp2蛋白，由包含seq id no:6的至少核苷酸412至2211的序列产生的vp2蛋白，或由与seq id no:6的至少核苷酸412至2211(其编码seq id no:7的至少约氨基酸138至736的预测氨基酸序列)具有至少70％同一性的核酸序列产生的vp2蛋白；和/或通过由核酸序列(其编码seq id no:7的至少约氨基酸203至736的预测氨基酸序列)表达产生的aavhu68 vp3蛋白，由包含seq id no:6的至少核苷酸607至2211的序列产生的vp3蛋白，或由与seq id no:6的至少核苷酸607至2211(其编码seq id no:7的至少约氨基酸203至736的预测氨基酸序列)具有至少70％同一性的核酸序列产生的vp3蛋白。
[0079]
aavhu68 vp1、vp2和vp3蛋白通常表达为由相同核酸序列编码的可变剪接变体，所述核酸序列编码全长vp1氨基酸序列(氨基酸1至736)。任选地，vp1编码序列单独用于表达vp1、vp2和vp3蛋白。可替代地，该序列可以与以下中的一种或多种共表达：编码不含vp1独特区域(约aa 1至约aa 137)和/或vp2独特区域(约aa 1至约aa 202)的aavhu68 vp3氨基酸序列(约aa 203至736)的核酸序列、或与其互补的链、相应的mrna或trna(例如，由seq id no:6的约核苷酸(nt)607至约nt 2211转录的mrna)、或与编码seq id no:7的aa 203至736的seq id no:6具有至少70％到至少99％(例如，至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％)同一性的序列。另外或可替代地，vp1编码序列和/或vp2编码序列可以与以下共表达：编码不含vp1独特区域(约aa 1至约aa 137)的seq id no:7的aavhu68 vp2氨基酸序列(约aa 138至736)的核酸序列、或与其互补的链、相应的mrna或trna(例如，由seq id no:6的nt 412至2211转录的mrna)、或与编码seq id no:7的约aa 138至736的
seq id no:6具有至少70％到至少99％(例如，至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％)同一性的序列。
[0080]
如本文所述的，raavhu68具有在表达来自aavhu68核酸序列的衣壳的生产系统中生产的raavhu68衣壳，所述aavhu68核酸序列编码seq id no:7的vp1氨基酸序列，以及任选地另外的核酸序列，例如编码不含vp1和/或vp2独特区域的vp3蛋白。起因于使用单一核酸序列vp1的生产的raavhu68产生了vp1蛋白、vp2蛋白和vp3蛋白的异质群体。更特别地，aavhu68衣壳含有在vp1蛋白内、在vp2蛋白内和在vp3蛋白内的亚群，其具有来自seq id no:7中的预测氨基酸残基的修饰。这些亚群最少包括脱酰胺的天冬酰胺(n或asn)残基。例如，天冬酰胺-甘氨酸对中的天冬酰胺是高度脱酰胺的。
[0081]
在一个实施方案中，aavhu68 vp1核酸序列具有seq id no:6的序列，或与其互补的链，例如相应的mrna或trna。在某些实施方案中，vp2和/或vp3蛋白可以另外或可替代地由与vp1不同的核酸序列表达，例如，以改变所选择的表达系统中vp蛋白的比率。在某些实施方案中，还提供的是编码不含vp1独特区域(约aa 1至约aa 137)和/或vp2独特区域(约aa 1至约aa 202)的seq id no:7的aavhu68 vp3氨基酸序列(约aa 203至736)的核酸序列、或与其互补的链、相应的mrna或trna(例如，seq id no:6的约nt 607至约nt 2211)。在某些实施方案中，还提供的是编码不含vp1独特区域(约aa 1至约aa 137)的seq id no:7的aavhu68 vp2氨基酸序列(约aa 138至736)的核酸序列、或与其互补的链、相应的mrna或trna(例如，seq id no:6的nt 412至2211)。
[0082]
然而，可以选择编码seq id no:7的氨基酸序列的其它核酸序列，用于产生raavhu68衣壳。在某些实施方案中，核酸序列具有seq id no:6的核酸序列，或者与编码seq id no:7的seq id no:6具有至少70％至99％同一性，至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％同一性的序列。在某些实施方案中，核酸序列具有seq id no:6的核酸序列，或者与seq id no:6的约nt 412至约nt 2211(其编码seq id no:7的vp2衣壳蛋白(约aa 138至736))具有至少70％至99％，至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％同一性的序列。在某些实施方案中，核酸序列具有seq id no:6的约nt 607至约nt 2211的核酸序列，或者与seq id no:6的nt 607至约nt 2211(其编码seq id no:7的vp3衣壳蛋白(约aa 203至736))具有至少70％至99％，至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％同一性的序列。
[0083]
设计编码这种aavhu68衣壳的核酸序列在本领域的技术内，所述核酸序列包括dna(基因组或cdna)或rna(例如，mrna)。在某些实施方案中，编码aavhu68 vp1衣壳蛋白的核酸序列在seq id no:6中提供。参见整体引入本文作为参考的wo 2018/160582。在某些实施方案中，aavhu68衣壳使用seq id no:6的核酸序列或至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％的序列产生，所述序列编码具有如本文所述的修饰(例如，脱酰胺的氨基酸)的seq id no:7的vpl氨基酸序列。在某些实施方案中，vpl氨基酸序列在seq id no:7中再现。
[0084]
如本文使用的，当用于指vp衣壳蛋白时，术语“异质的”或其任何语法变动指由元件组成的群体，所述元件不是相同的，例如，具有含有不同修饰的氨基酸序列的vp1、vp2或vp3单体(蛋白质)。seq id no:7提供了aavhu68 vp1蛋白的编码氨基酸序列。当与vp1、vp2和vp3蛋白(可替代地称为同种型)结合使用时，术语“异源的”指衣壳内的vp1、vp2和vp3蛋
白的氨基酸序列中的差异。aav衣壳含有在vp1蛋白内、在vp2蛋白内和在vp3蛋白内的亚群，其具有来自预测的氨基酸残基的修饰。这些亚群最少包括某些脱酰胺的天冬酰胺(n或asn)残基。例如，某些亚群包含在天冬酰胺-甘氨酸对中的至少一个、两个、三个或四个高度脱酰胺的天冬酰胺(n)位置，并且任选地进一步包含其它脱酰胺的氨基酸，其中所述脱酰胺导致氨基酸改变和其它任选的修饰。
[0085]
如本文使用的，除非另有说明，否则vp蛋白的“亚群”指这样的一组vp蛋白，其具有至少一个共同的限定特性，并且由至少一个组成员至少于参考组的所有成员组成。
[0086]
例如，除非另有说明，否则vp1蛋白的“亚群”是至少一(1)个vp1蛋白和少于组装的aav衣壳中的所有vp1蛋白。除非另有说明，否则vp3蛋白的“亚群”可以是一(1)个vp3蛋白到少于组装的aav衣壳中的所有vp3蛋白。例如，vp1蛋白可能是vp蛋白的亚群；vp2蛋白可能是vp蛋白的分开亚群，而vp3是组装的aav衣壳中vp蛋白的再进一步的亚群。在另一个实例中，vp1、vp2和vp3蛋白可能含有具有不同修饰的亚群，所述修饰例如在天冬酰胺-甘氨酸对处的例如至少一个、两个、三个或四个高度脱酰胺的天冬酰胺。
[0087]
除非另有说明，否则高度脱酰胺的指在参考氨基酸位置处与预测氨基酸序列相比，至少45％脱酰胺的、至少50％脱酰胺的、至少60％脱酰胺的、至少65％脱酰胺的、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或最多约100％脱酰胺的(例如，基于seq id no:7(aavhu68)的编号，在氨基酸57处的至少80％的天冬酰胺可以是基于总vp1蛋白脱酰胺的，可以是基于总vp1、vp2和vp3蛋白脱酰胺的)。此类百分比可以使用2d凝胶、质谱法技术或其它合适的技术进行确定。
[0088]
不希望受理论束缚，aav衣壳中的vp蛋白中至少高度脱酰胺残基的脱酰胺被认为在性质中主要是非酶促的，由衣壳蛋白内的官能团引起，所述官能团使所选择的天冬酰胺脱酰胺，以及较小程度的谷氨酰胺残基脱酰胺。大多数脱酰胺的vp1蛋白的有效衣壳组装指示了，这些事件在衣壳组装之后发生，或者各个单体(vp1、vp2或vp3)中的脱酰胺是结构上良好耐受的，并且在很大程度上并不影响组装动力学。vp1独特(vp1-u)区域(～aa1-137)中的广泛脱酰胺，一般被视为在细胞进入之前内部定位的，提示了vp脱酰胺可能在衣壳组装之前发生。n的脱酰胺可能通过其c末端残基的主链氮原子对asn的侧链酰胺基碳原子进行亲核攻击而发生。认为形成了中间体闭环的琥珀酰亚胺残基。然后琥珀酰亚胺残基进行快速水解，以导致最终产物天冬氨酸(asp)或异天冬氨酸(isoasp)。因此，在某些实施方案中，天冬酰胺(n或asn)的脱酰胺导致asp或isoasp，其可以通过琥珀酰亚胺中间体互变，例如，如下文所示的。
[0089][0090]
如本文提供的，vp1、vp2或vp3中的每个脱酰胺的n可以独立地是天冬氨酸(asp)、异天冬氨酸(isoasp)、天冬氨酸酯和/或asp和isoasp的互变共混物、或其组合。可以存在任何合适比率的α-天冬氨酸和异天冬氨酸。例如，在某些实施方案中，该比率可以是10:1至1:10的天冬氨酸/异天冬氨酸、约50:50的天冬氨酸:异天冬氨酸、或约1:3的天冬氨酸:异天冬氨酸、或另一个选择比率。
[0091]
在某些实施方案中，一种或多种谷氨酰胺(q)可以脱酰胺为谷氨酸(glu)，即α-谷氨酸、γ-谷氨酸(glu)或α-谷氨酸和γ-谷氨酸的共混物，其可以通过共同的戊二酰亚胺(glutarinimide)中间体互变。可以存在任何合适比率的α-谷氨酸和γ-谷氨酸。例如，在某些实施方案中，该比率可以是10:1至1:10的α/γ、约50:50的α:γ、或约1:3的α:γ、或另一个选择比率。
[0092][0093]
因此，raav包括在具有脱酰胺氨基酸的vp1、vp2和/或vp3蛋白的raav衣壳内的亚群，其最少包括包含至少一个高度脱酰胺的天冬酰胺的至少一个亚群。另外，其它修饰可能包括特别是在所选的天冬氨酸(d或asp)残基位置处的异构化。在另外其它实施方案中，修饰可能包括在asp位置的酰胺化。
[0094]
在某些实施方案中，aav衣壳含有具有至少4个到至少约25个脱酰胺的氨基酸残基位置的vp1、vp2和vp3亚群，与vp蛋白的编码氨基酸序列相比，所述位置中的至少1％至10％是脱酰胺的。这些中的大多数可能是n残基。然而，q残基也可能是脱酰胺的。
[0095]
在某些实施方案中，raav具有含有vp1、vp2和vp3蛋白的aav衣壳，所述蛋白具有包含在实施例11提供并引入本文作为参考的表中列出的位置处的两个、三个、四个或更多个脱酰胺残基的组合的亚群。raav中的脱酰胺可以使用2d凝胶电泳、和/或质谱法(ms)和/或蛋白质建模技术进行确定。在线层析可以用与具有nanoflex源的q exactive hf(thermo fisher scientific)偶联的acclaim pepmap柱和thermo ultimate 3000rslc系统(thermo fisher scientific)来执行。ms数据使用关于q exactive hf的数据依赖性前20名(top-20)方法获得，从调查扫描(200
–
2000m/z)中动态选择最丰富的尚未测序的前体离子。测序经由更高能量的碰撞解离碎裂来执行，具有用预测性自动增益控制确定的1e5离子的靶值，并且前体的分离用4m/z的窗口执行。在m/z 200处以120,000的分辨率获得调查扫描。关于hcd光谱的分辨率可以设定为在m/z200处30,000，具有最大离子注入时间50ms和标准化碰撞能量30。s-lens rf水平可以设定为50，以给出由来自消化的肽占据的m/z区域的最佳传输。可以从碎片选择中排除具有单一、未分配或六个及更高电荷状态的前体离子。biopharma finder 1.0软件(thermo fischer scientific)可以用于分析所获得的数据。对于肽图谱，使用单条目蛋白质fasta数据库，其中氨基甲酰甲基化设为固定修饰；并且氧化、脱酰胺和磷酸化设为可变修饰，10-ppm质量准确度，高蛋白酶特异性和对于ms/ms谱0.8的置信水平来执行搜索。合适蛋白酶的实例可以包括例如胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶。脱酰胺肽的质谱鉴定是相对简单的，因为脱酰胺对完整分子增加+0.984da的质量(
–
oh和
–
nh2基团之间的质量差异)。通过脱酰胺肽的质量面积除以脱酰胺肽和天然肽的面积总和，来确定特定肽的脱酰胺百分比。考虑到可能的脱酰胺位点的数目，在不同位点处脱酰胺的同量异位种类可能在单个峰中共迁移。因而，源自具有多个潜在脱酰胺位点的肽的碎片离子可以用于定位或区别多个脱酰胺位点。在这些情况下，观察到的同位素模式内的相对强度可以用于特异性地确定不同脱酰胺肽异构体的相对丰度。该方法假定所有异构种类的碎裂效率是相同的且不依赖于脱酰胺的位点。本领域技术人员应理解，可以使用这些说明性方法的多种变体。例如，合适的质谱仪可以包括例如四极杆飞行时间质谱仪(qtof)例如waters xevo或agilent 6530、或轨道阱仪器例如orbitrap fusion或orbitrap velos(thermo fisher)。合适的液相层析系统包括例如来自waters的acquity uplc系统或agilent系统(1100或1200系列)。合适的数据分析软件可以包括例如masslynx(waters)、pinpoint and pepfinder(thermo fischer scientific)、mascot(matrix science)、peaks db(bioinformatics solutions)。另外其它技术可以例如在2017年6月16日在线发表的x.jin等人，hu gene therapy methods，第28卷，第5期，第255-267页中进行描述。
[0096]
除脱酰胺之外，还可能发生并不导致一种氨基酸转换为不同氨基酸残基的其它修饰。此类修饰可以包括乙酰化残基、异构化、磷酸化或氧化。
[0097]
脱酰胺的调节：在某些实施方案中，修饰aav以改变天冬酰胺-甘氨酸对中的甘氨酸，以减少脱酰胺。在其它实施方案中，天冬酰胺更改为不同的氨基酸，例如以较慢速率脱酰胺的谷氨酰胺；或缺乏酰胺基的氨基酸(例如，谷氨酰胺和天冬酰胺含有酰胺基)；和/或缺乏胺基的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸和组氨酸含有胺基)。如本文使用的，缺少酰胺或胺侧基的氨基酸指例如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、胱氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、或色氨酸和/或脯氨酸。如所述的修饰可以在编码的aav氨基酸序列中发现的天冬酰胺-甘氨酸对的一个、两个或三个中。在某些实施方案中，并非在所有四个
天冬酰胺-甘氨酸对中都进行此类修饰。因此，用于减少aav的脱酰胺和/或改造具有较低脱酰胺率的aav变体的方法。另外或可替代地，一个或多个其它酰胺氨基酸可以改变为非酰胺氨基酸，以减少aav的脱酰胺。在某些实施方案中，如本文所述的突变型aav衣壳含有精氨酸-甘氨酸对中的突变，使得甘氨酸改变为丙氨酸或丝氨酸。突变型aav衣壳可能含有一个、两个或三个突变体，其中参考aav天然地含有四个ng对。在某些实施方案中，aav衣壳可能含有一个、两个、三个或四个此类突变体，其中参考aav天然地含有五个ng对。在某些实施方案中，突变型aav衣壳仅含有在一个ng对中的单个突变。在某些实施方案中，突变型aav衣壳含有在两个不同的ng对中的突变。在某些实施方案中，突变型aav衣壳含有在两个不同的ng对中的突变，所述两个不同的ng对定位于aav衣壳中结构上分开的位置中。在某些实施方案中，突变不在vp1独特区域中。在某些实施方案中，突变之一在vp1独特区域中。任选地，突变型aav衣壳不含ng对中的修饰，但含有定位于ng对外部的突变，以使一个或多个天冬酰胺或谷氨酰胺中的脱酰胺降到最低或得到消除。
[0098]
在aavhu68衣壳蛋白中，4个残基(n57、n329、n452、n512)跨越各个批次常规地展示》70％的脱酰胺水平，并且在大多数情况下》90％。另外的天冬酰胺残基(n94、n253、n270、n304、n409、n477和q599)跨越各个批次也展示高达～20％的脱酰胺水平。脱酰胺水平最初使用胰蛋白酶消化进行鉴定，并且用胰凝乳蛋白酶消化进行验证。
[0099]
aavhu68衣壳含有在vp1蛋白内、在vp2蛋白内和在vp3蛋白内的亚群，其具有来自seq id no:7中的预测氨基酸残基的修饰。这些亚群最少包括某些脱酰胺的天冬酰胺(n或asn)残基。例如，某些亚群包含在seq id no:7中的天冬酰胺-甘氨酸对中的至少一个、两个、三个或四个高度脱酰胺的天冬酰胺(n)位置，并且任选地进一步包含其它脱酰胺的氨基酸，其中所述脱酰胺导致氨基酸改变和其它任选的修饰。seq id no:8提供了修饰的aavhu68衣壳的氨基酸序列，说明了可能具有一定百分比的脱酰胺或以其它方式修饰的氨基酸的位置。本文描述了这些修饰和其它修饰的各种组合。
[0100]
如本文使用的，“aav9衣壳”是由多种aav9 vp蛋白组成的自组装aav衣壳。aav9 vp蛋白通常表达为可变剪接变体，其由seq id no:9的核酸序列，或与其具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％同一性的序列编码，所述序列编码genbank登录号：aas99264的vp1氨基酸序列。在某些实施方案中，“aav9衣壳”包括具有与aas99264具有99％同一性或与seq id no:10具有99％同一性的氨基酸序列的aav。还参见us7906111和wo2005/033321。如本文使用的，“aav9变体”包括在例如wo2016/049230、us 8,927,514、us 2015/0344911和us 8,734,809中描述的那些变体。
[0101]
已描述了生成衣壳的方法、关于其的编码序列以及用于产生raav病毒载体的方法。参见例如，gao等人，proc.natl.acad.sci.u.s.a.100(10)，6081-6086(2003)和us 2013/0045186a1。
[0102]
当提及核酸或其片段时，术语“实质同源性”或“实质相似性”指示了，当与另一种核酸(或其互补链)伴随适当的核苷酸插入或缺失进行最佳比对时，在比对序列中存在至少约95％至99％的核苷酸序列同一性。优选地，同源性在全长序列、或其开放读码框片段、或长度为至少15个核苷酸的另一个合适的片段上。合适片段的实例在本文中进行描述。
[0103]
在核酸序列的上下文中，术语“序列同一性”、“序列同一性百分比”或“同一性百分比”，指当就最大对应性比对时，两个序列中相同的残基。序列同一性比较的长度可以是在
基因组的全长，基因编码序列的全长，或根据需要至少约500至5000个核苷酸的片段上。然而，例如至少约9个核苷酸，通常至少约20至24个核苷酸、至少约28至32个核苷酸、至少约36个或更多个核苷酸的较小片段中的同一性也可能是需要的。类似地，对于氨基酸序列，可以在蛋白质的全长或其片段上，容易地确定“序列同一性百分比”。合适地，片段的长度为至少约8个氨基酸，并且可以高达约700个氨基酸。合适片段的实例在本文中进行描述。
[0104]
当提及氨基酸或其片段时，术语“实质同源性”或“实质相似性”指示了，当与另一种氨基酸(或其互补链)伴随适当的氨基酸插入或缺失进行最佳比对时，在比对序列中存在至少约95％至99％的氨基酸序列同一性。优选地，同源性在全长序列，或其蛋白质例如cap蛋白、rep蛋白，或长度为至少8个氨基酸或更期望地至少15个氨基酸的片段上。合适片段的实例在本文中进行描述。
[0105]
术语“高度保守的”意指至少80％同一性，优选至少90％同一性，且更优选超过97％同一性。通过采取由本领域技术人员已知的算法和计算机程序，通过本领域技术人员容易地确定同一性。
[0106]
一般地，当提及两种不同腺相关病毒之间的“同一性”、“同源性”或“相似性”时，“同一性”、“同源性”或“相似性”参考“比对的”序列进行确定。“比对的”序列或“比对”指与参考序列相比，经常含有关于缺失或另外碱基或氨基酸的校正的多个核酸序列或蛋白质(氨基酸)序列。在实施例中，使用公布的aav9序列作为参考点来执行aav比对。使用各种可公开获得或商购可得的多序列比对程序中的任一种来执行比对。此类程序的实例包括“clustal omega”、“clustal w”、“cap sequence assembly”、“map”和“meme”，其可通过互联网上的网页服务器访问。此类程序的其它来源是本领域技术人员已知的。可替代地，还使用vector nti实用程序。还存在本领域已知的许多算法，其可以用于测量核苷酸序列同一性，包括上述程序中含有的那些算法。作为另一个实例，可以使用fasta
tm
(gcg版本6.1中的程序)比较多核苷酸序列。fasta
tm
提供查询序列和搜索序列之间的最佳重叠区域的比对和序列同一性百分比。例如，可以使用如引入本文作为参考的gcg版本6.1中提供的fasta
tm
，与其默认参数(字长6和用于评分矩阵的nopam因子)，来确定核酸序列之间的序列同一性百分比。用于氨基酸序列的多序列比对程序也是可用的，例如“clustal omega”、“clustal x”、“map”、“pima”、“msa”、“blockmaker”、“meme”和“match-box”程序。一般地，这些程序中的任一个以默认设置使用，尽管本领域技术人员可以根据需要更改这些设置。可替代地，本领域技术人员可以利用另一种算法或计算机程序，其至少提供与通过所提及的算法和程序提供的同样的同一性或比对水平。参见例如，j.d.thomson等人，nucl.acids.res.，“a comprehensive comparison of multiple sequence alignments”，27(13):2682-2690(1999)。
[0107]
v.raav
[0108]
本文提供的是治疗性、重组和复制缺陷型腺相关病毒(raav)，其可用于治疗有需要的受试者的与芳基硫酸酯酶a基因(arsa)突变相关或由功能性芳基硫酸酯酶a的正常水平方面的缺陷引起的疾病(例如异染性脑白质营养不良(mld))。raav期望地是复制缺陷型的，并且携带包含以下的载体基因组：反向末端重复(itr)、以及在调控序列的控制下的编码功能性人芳基硫酸酯酶a(harsa)的核酸序列，所述调控序列指导靶细胞中的harsa表达。在某些实施方案中，harsa编码序列包含seq id no:1的核苷酸(nt)55至nt 1521的序列、或
与其具有至少95％至99.9％同一性的编码功能性harsa的序列。在某些实施方案中，载体基因组包含反向末端重复(itr)和如部分iii中所述的表达盒。在一个进一步的实施方案中，raav包含aav衣壳。
[0109]
aav衣壳可以基于靶细胞进行选择。在某些实施方案中，aav衣壳适合于在神经系统(例如，cns或pns)中递送载体基因组。在某些实施方案中，aav衣壳适合于在神经元、神经系统细胞、少突胶质细胞、小胶质细胞、中枢神经系统(cns)细胞、cns中的神经元、外周神经系统(pns)细胞、施万细胞、pns中的巨噬细胞、或内脏器官中的细胞(例如，肾细胞、肝细胞和胆囊细胞)中递送载体基因组。在某些实施方案中，aav衣壳适合于在如本文所述的另一种靶细胞中递送载体基因组。
[0110]
在某些实施方案中，aav衣壳选自cy02衣壳、rh43衣壳、aav8衣壳、rh01衣壳、aav9衣壳、rh8衣壳、rh10衣壳、bb01衣壳、hu37衣壳、rh02衣壳、rh20衣壳、rh39衣壳、rh64衣壳、aav6衣壳、aav1衣壳、hu44衣壳、hu48衣壳、cy05衣壳hu11衣壳、hu32衣壳、pi2衣壳或其变体。在某些实施方案中，aav衣壳是进化枝f衣壳，例如aav9衣壳、aavhu68衣壳、aav-php.b衣壳、hu31衣壳、hu32衣壳或其变体。参见例如，于2015年4月14日公开的wo 2005/033321、wo 2018/160582和us 2015/0079038，其各自整体引入本文作为参考。在某些实施方案中，aav衣壳是非进化枝f衣壳，例如进化枝a、b、c、d或e衣壳。在某些实施方案中，非进化枝f衣壳是aav1或其变体。在某些实施方案中，aav衣壳转导除神经系统细胞外的靶细胞。在某些实施方案中，aav衣壳是进化枝a衣壳(例如，aav1、aav6)、进化枝b衣壳(例如，aav 2)、进化枝c衣壳(例如，hu53)、进化枝d衣壳(例如，aav7)、或进化枝e衣壳(例如，rh10)。仍然可以选择其它aav衣壳。
[0111]
在某些实施方案中，raav包含其中包装了载体基因组的aavhu68衣壳。在某些实施方案中，aavhu68衣壳由编码seq id no:7的预测氨基酸序列的序列产生。
[0112]
关于更多细节，参见部分v。在某些实施方案中，载体基因组对于aavhu68衣壳是完全外源的，因为它不含aavhu68基因组序列。
[0113]
功能性harsa在部分i中进行描述。在某些实施方案中，功能性harsa具有信号肽和seq id no:2的氨基酸(aa)19至aa 507的序列。在某些实施方案中，天然harsa信号肽使用例如seq id no:2的aa 1至aa18。在某些实施方案中，信号肽具有seq id no:4的aa 1至aa 20的氨基酸序列。在某些实施方案中，功能性harsa具有seq id no:2或seq id no:4的氨基酸序列。
[0114]
在某些实施方案中，harsa编码序列与seq id no:1的核苷酸(nt)55至nt 1521具有约95％至100％同一性。在某些实施方案中，harsa编码序列是seq id no:1或seq id no:3。在一个进一步的实施方案中，harsa编码序列编码seq id no:2的氨基酸(aa)19至aa 507的序列。在再进一步的实施方案中，harsa编码序列编码seq id no:2或seq id no:4的序列。关于harsa编码序列的更多细节，参见部分i。
[0115]
在某些实施方案中，调控序列指导神经系统细胞中的harsa表达。在某些实施方案中，调控序列包含遍在启动子，例如cb7启动子。在一个进一步的实施方案中，调控元件包含kozak序列、多聚腺苷酸化序列、内含子、增强子和tata信号中的一种或多种。在某些实施方案中，调控序列包含下述中的一种或多种：衍生自鸡β肌动蛋白(ba)启动子和人巨细胞病毒立即早期增强子(cmv ie)的调控元件(例如，cb7启动子，seq id no:5的nt 198至nt 862)、
由鸡ba剪接供体和兔β珠蛋白(rbg)剪接受体元件组成的嵌合内含子(例如，ci，seq id no:5的nt 956至nt 1928)、以及衍生自rbg基因的多聚腺苷酸化(polya)信号(例如，rbg，seq id no:5的nt3539至nt 3665)。在某些实施方案中，载体基因组具有seq id no:5的核苷酸(nt)1至nt 3883的序列。关于更多细节，参见部分iii。
[0116]
在某些实施方案中，raav或包含raav的组合物可施用于有需要的受试者，以改善与arsa突变相关或由功能性芳基硫酸酯酶a的正常水平方面的缺陷引起的疾病(例如mld)的症状，和/或延迟与arsa突变相关或由功能性芳基硫酸酯酶a的正常水平方面的缺陷引起的疾病(例如mld)的进展。关于更多细节，参见部分ii。
[0117]
在某些实施方案中，如本文所述的raav适合于经由大池内注射(icm)施用于患者，包括经由ct引导的枕下注射到大池内。在某些实施方案中，如本文所述的raav适合于施用于7岁或更年幼的受试者。在某些实施方案中，如本文所述的raav适合于施用于有需要的受试者，以改善异染性脑白质营养不良或与芳基硫酸酯酶a(arsa)基因突变相关的疾病的症状，和/或延迟异染性脑白质营养不良或与芳基硫酸酯酶a(arsa)基因突变相关的疾病的进展。关于更多细节，参见部分ii和部分viii。在某些实施方案中，如本文所述的raav以单一剂量施用。
[0118]
在某些实施方案中，载体基因组是单链aav载体基因组。在某些实施方案中，含有自互补(sc)的aav载体基因组的raav载体可以用于本发明中。
[0119]
必需的调控元件与基因(例如，harsa编码序列)可操作地连接，其方式允许其在吸收raav的细胞中的转录、翻译和/或表达。如本文使用的，“可操作地连接的”序列包括与目的基因邻接的表达控制序列、以及反式或在一段距离处起作用以控制目的基因的表达控制序列两者。此类调控序列通常包括例如启动子、增强子、内含子、polya、自切割接头(例如弗林蛋白酶、弗林蛋白酶-f2a、ires)中的一种或多种。下文的实例利用cb7启动子用于harsa的表达。然而，在某些实施方案中，可以选择其它启动子或另外的启动子。在某些实施方案中，可以包括另外或替代的启动子序列作为表达控制序列(调控序列)的部分，例如定位于所选的5’itr序列和编码序列之间。组成型启动子、调控型启动子[参见例如，wo 2011/126808和wo 2013/04943]、组织特异性启动子、或响应生理学线索的启动子可以用于本文所述的载体中。启动子可以选自不同的来源，例如，人巨细胞病毒(cmv)立即早期增强子/启动子、sv40早期增强子/启动子、jc多瘤病毒(polymovirus)启动子、髓鞘碱性蛋白(mbp)或神经胶质原纤维酸性蛋白(gfap)启动子、单纯疱疹病毒(hsv-1)潜伏期相关启动子(lap)、劳斯肉瘤病毒(rsv)长末端重复(ltr)启动子、神经元特异性启动子(nse)、血小板衍生生长因子(pdgf)启动子、hsyn、黑色素浓缩激素(mch)启动子、cba、基质金属蛋白启动子(mpp)和鸡β肌动蛋白启动子。除启动子之外，载体还可以含有一种或多种其它适当的转录起始序列、转录终止序列、增强子序列、有效的rna加工信号例如剪接和多聚腺苷酸化(polya)信号；稳定细胞质mrna的序列，例如wpre；增强翻译效率的序列(即，kozak共有序列)；增强蛋白质稳定性的序列；以及在需要时，增强编码产物的分泌的序列。合适的增强子的一个实例是cmv增强子。其它合适的增强子包括对于所需靶组织适应症适当的那些增强子。在一个实施方案中，调控序列包含一种或多种表达增强子。在一个实施方案中，调控序列含有两种或更多种表达增强子。这些增强子可以是相同的或可以是彼此不同的。例如，增强子可以包括cmv立即早期增强子(seq id no:19)。这种增强子可以存在于彼此定位相邻的两个拷贝中。
可替代地，增强子的双重拷贝可以由一种或多种序列分开。在另外一个实施方案中，表达盒进一步含有内含子，例如鸡β肌动蛋白内含子(seq id no:17)。在某些实施方案中，内含子是嵌合内含子(ci)
–
由人β珠蛋白剪接供体和免疫球蛋白g(igg)剪接受体元件组成的杂合内含子。其它合适的内含子包括本领域已知的那些内含子，例如wo 2011/126808中描述的。合适的polya序列的实例包括例如sv40、sv50、牛生长激素(bgh)、人生长激素和合成polya。任选地，可以选择一种或多种序列来稳定mrna。此类序列的实例是修饰的wpre序列，其可以在polya序列的上游和编码序列的下游进行改造(参见例如，ma zanta-boussif等人，gene therapy(2009)16:605-619)。在某些实施方案中，不存在wpre序列。
[0120]
在某些实施方案中，除harsa编码序列之外，还可以包括另一种感兴趣的非aav编码序列，例如肽、多肽、蛋白质、功能性rna分子(例如mirna、mirna抑制剂)或其它基因产物。有用的基因产物可以包括mirna。mirna和其它小干扰核酸经由靶rna转录物切割/降解、或者靶信使rna(mrna)的翻译阻遏来调控基因表达。mirna是天然表达的，通常作为最终的19-25种非翻译的rna产物。mirna通过与靶mrna的3'非翻译区(utr)的序列特异性相互作用显示出其活性。这些内源性表达的mirna形成发夹前体，其随后被加工成mirna双链体，并且进一步加工成“成熟”的单链mirna分子。这种成熟的mirna引导多蛋白复合物mirisc，其基于其与成熟mirna的互补性来鉴定例如在靶mrna的3
′
utr区域中的靶位点。
[0121]
载体的aav序列通常包含顺式作用的5'和3'反向末端重复(itr)序列(参见例如，b.j.carter，于“handbook of parvoviruses”，编辑，p.tijsser，crc press，第155 168页(1990))。itr序列的长度为约145个碱基对(bp)。优选地，在分子中使用编码itr的基本上整个序列，尽管这些序列的一定程度的微小修饰是允许的。修饰这些itr序列的能力在本领域的技术范围内。(参见例如，教科书如sambrook等人，“molecular cloning.a laboratory manual”，第2版，cold spring harbor laboratory，new york(1989)；以及k.fisher等人，j.virol.，70:520 532(1996))。本发明中采用的此类分子的实例是含有转基因的“顺式作用”质粒，其中所选择的转基因序列和相关调控元件的侧翼为5'和3'aav itr序列。在一个实施方案中，itr来自与供应衣壳的aav不同的aav。在一个实施方案中，itr序列来自aav2。已描述了5'itr的缩短形式，称为δitr，其中缺失了d序列和末端解离位点(trs)。在其它实施方案中，使用全长aav 5’和3’itr。然而，可以选择来自其它aav来源的itr。当itr的来源来自aav2，且aav衣壳来自另一个aav来源时，所得到的载体可以称为假型的。然而，这些元件的其它配置可能是合适的。
[0122]
在某些实施方案中，构建了载体基因组，其包含5’aav itr-启动子
–
任选的增强子
–
任选的内含子-harsa编码序列
–
polya-3'itr，称为aav.启动子.任选的增强子.任选的内含子.harsa或harsaco.polya。在某些实施方案中，itr来自aav2。在某些实施方案中，存在多于一种启动子。在某些实施方案中，增强子存在于载体基因组中。在某些实施方案中，存在多于一种增强子。在某些实施方案中，内含子存在于载体基因组中。在某些实施方案中，存在增强子和内含子。在某些实施方案中，内含子是嵌合内含子(ci)-由人β珠蛋白剪接供体和免疫球蛋白g(igg)剪接受体元件组成的杂合内含子。在某些实施方案中，polya是sv40polya(即，衍生自猿猴病毒40(sv40)晚期基因的多聚腺苷酸化(polya)信号)。在某些实施方案中，polya是兔β珠蛋白(rbg)polya。在某些实施方案中，载体基因组包含5’aav itr
–
cb7启动子-harsa编码序列-polya
–3’
itr。
[0123]
如本文使用的，载体基因组或包含载体基因组的raav在本文中示出为aav.启动子(任选的).kozak(任选的).内含子(任选的).harsa编码序列(例如，harsa、harsaco).mirna(任选的).polya(任选的).stuffer(任选的)。在某些实施方案中，raav在本文中示出为aav衣壳.启动子(任选的).kozak(任选的).内含子(任选的).harsa编码序列.mirna(任选的).polya(任选的).stuffer(任选的)。
[0124]
在另一个方面，提供了可用于生产raav的生产系统。在该系统中，培养包含以下的细胞：编码aavhu68衣壳蛋白的核酸序列、如本文所述的载体基因组以及足够的aav rep功能和辅助功能，以允许将载体基因组包装到aav衣壳内。在某些实施方案中，载体基因组具有seq id no:5的nt 1至nt 3883的序列。在某些实施方案中，细胞培养物是人胚肾293细胞培养物。在某些实施方案中，aav rep来自不同于aavhu68的aav，例如来自aav2。在某些实施方案中，aav rep编码序列和cap基因在同一核酸分子上，其中任选地存在rep序列和cap基因之间的间隔区。在一个进一步的实施方案中，间隔区是atgacttaaaccaggt(seq id no:24)。
[0125]
为了用于生产aav病毒载体(例如，重组(r)aav)，载体基因组可以携带在任何合适的载体例如质粒上，所述载体被递送至包装宿主细胞。可用于本发明中的质粒可以这样进行改造，使得它们尤其适合于在原核细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞中的体外复制和包装。合适的转染技术和包装宿主细胞是已知的和/或可以由本领域技术人员容易地设计。说明性的生产工艺在图6-7中提供。在某些实施方案中，质粒具有seq id no:5的序列。
[0126]
用于生成和分离适合于用作载体的aav的方法是本领域已知的。一般参见例如，grieger&samulski，2005，adeno-associated virus as a gene therapy vector:vector development，production and clinical applications，adv.biochem.engin/biotechnol.99:119-145；buning等人，2008，recent developments in adeno-associated virus vector technology，j.gene med.10:717-733；以及下文引用的参考文献，所述参考文献各自整体引入本文作为参考。对于将基因包装到病毒粒子内，itr是与包含该基因的核酸分子相同的构建体中顺式所需的唯一aav组分。cap和rep基因可以反式供应。
[0127]
在一个实施方案中，可以通过任何合适的方法，将所选择的遗传元件递送至aav包装细胞，所述方法包括转染、电穿孔、脂质体递送、膜融合技术、高速dna包被的小球、病毒感染和原生质体融合。也可以制备稳定的aav包装细胞。用于制备此类构建体的方法是具有核酸操作技术的人员已知的，并且包括遗传改造、重组改造和合成技术。参见例如，molecular cloning:a laboratory manual，编辑green和sambrook，cold spring harbor press，cold spring harbor，ny(2012)。
[0128]
术语“aav中间体”或“aav载体中间体”指组装的raav衣壳，其缺少在其中包装的所需基因组序列。这些也可以称为“空”衣壳。此类衣壳可能不含表达盒的可检测基因组序列，或仅含有部分包装的基因组序列，其不足以实现基因产物的表达。这些空衣壳对于将目的基因转移到宿主细胞是无功能的。
[0129]
可使用已知的技术生成本文所述的重组腺相关病毒(aav)。参见例如，wo 2003/042397；wo 2005/033321，wo 2006/110689；us 7588772 b2。此类方法涉及培养含有以下的宿主细胞：编码aav衣壳蛋白的核酸序列；功能性rep基因；最少由aav反向末端重复(itr)和转基因组成的表达盒；和足够的辅助功能，以允许将表达盒包装到aav衣壳蛋白内。已描述
了生成衣壳的方法、关于其的编码序列以及用于产生raav病毒载体的方法。参见例如，gao等人，proc.natl.acad.sci.u.s.a.100(10)，6081-6086(2003)和us 2013/0045186a1。
[0130]
在一个实施方案中，提供了用于生产重组aavhu68的生产细胞培养物。此类细胞培养物含有在宿主细胞中表达aavhu68衣壳蛋白的核酸；适合于包装到aavhu68衣壳内的核酸分子，例如，含有aav itr和非aav核酸序列的载体基因组，所述非aav核酸序列编码与调控序列可操作地连接的基因，所述调控序列指导宿主细胞中的基因表达；以及足够的aav rep功能和腺病毒辅助功能，以允许将载体基因组包装到重组aavhu68衣壳内。在一个实施方案中，细胞培养物由哺乳动物细胞(例如，尤其是人胚胎肾293细胞)或昆虫细胞(例如，草地贪夜蛾(spodoptera frugiperda)(sf9)细胞)组成。在某些实施方案中，杆状病毒提供了对于将载体基因组包装到重组aavhu68衣壳内必需的辅助功能。
[0131]
任选地，rep功能由除aavhu68外的aav提供。在某些实施方案中，rep功能的至少部分来自aavhu68。在另一个实施方案中，rep蛋白是除aavhu68rep外的异源rep蛋白，例如但不限于aav1 rep蛋白、aav2 rep蛋白、aav3 rep蛋白、aav4 rep蛋白、aav5 rep蛋白、aav6 rep蛋白、aav7 rep蛋白、aav8 rep蛋白；或rep 78、rep 68、rep 52、rep 40、rep68/78和rep40/52；或其片段；或另一个来源。这些aavhu68或突变型aav衣壳序列中的任一种都可以在外源调控序列的控制下，所述外源调控序列指导其在宿主细胞中的表达。
[0132]
在一个实施方案中，细胞在合适的细胞培养物(例如，hek293或sf9)或悬浮液中进行制造。用于制造本文所述的基因治疗载体的方法包括本领域众所周知的方法，例如生成用于生产基因治疗载体的质粒dna、生成载体和纯化载体。在一些实施方案中，基因治疗载体是aav载体，并且所生成的质粒是编码aav载体基因组和目的基因的aav顺式质粒、含有aav rep和cap基因的aav反式质粒和腺病毒辅助质粒。载体生成过程可以包括方法步骤，例如启动细胞培养、细胞传代、细胞接种、用质粒dna转染细胞、转染后培养基更换为无血清培养基、以及收获含有载体的细胞和培养基。所收获的含有载体的细胞和培养基在本文中称为粗细胞收获物。在再一个系统中，通过用基于杆状病毒的载体的感染，将基因治疗载体引入昆虫细胞内。关于这些生产系统的综述，一般参见例如，zhang等人，2009，adenovirus-adeno-associated virus hybrid for large-scale recombinant adeno-associated virus production，human gene therapy 20:922-929，所述参考文献各自的内容整体引入本文作为参考。制备且使用这些和其它aav生产系统的方法也在下述美国专利中进行描述，所述专利各自的内容整体引入本文作为参考：5,139,941；5,741,683；6,057,152；6,204,059；6,268,213；6,491,907；6,660,514；6,951,753；7,094,604；7,172,893；7,201,898；7,229,823；和7,439,065。
[0133]
粗细胞收获物其后可以经受方法步骤，例如载体收获物的浓缩、载体收获物的渗滤、载体收获物的微流化、载体收获物的核酸酶消化、微流化中间体的过滤、通过层析的粗纯化、通过超速离心的粗纯化、通过切向流过滤的缓冲液交换、和/或配制和过滤，以制备大量载体。
[0134]
在阴离子交换树脂层析之后以高盐浓度的两步亲和层析纯化用于纯化载体药物产品并去除空衣壳。这些方法在wo 2017/160360、于2016年12月9日提交的国际专利申请号pct/us2016/065970及其优先权文件、于2016年4月13日提交的美国专利申请号62/322,071、以及于2015年12月11日提交且名称为“scalable purification method for aav9”的
美国专利申请号62/226,357中更详细地描述，所述专利引入本文作为参考。
[0135]
为了计算空颗粒含量和满颗粒含量，将所选样品的vp3条带体积(例如，在本文的实例中，碘克沙醇梯度纯化制剂，其中基因组拷贝(gc)#＝颗粒#)针对加载的gc颗粒进行标绘。所得到的线性方程(y＝mx+c)用于计算测试制品峰的条带体积中的颗粒数目。然后将每20μl加载的颗粒数目(pt)乘以50，以给出颗粒(pt)/ml。pt/ml除以gc/ml给出颗粒/基因组拷贝的比率(pt/gc)。pt/ml
–
gc/ml给出空pt/ml。空pt/ml除以pt/ml且x100给出空颗粒的百分比。
[0136]
一般地，用于测定空衣壳和具有包装基因组的aav载体颗粒的方法已是本领域已知的。参见例如，grimm等人，gene therapy(1999)6:1322-1330；sommer等人，molec.ther.(2003)7:122-128。为了测试变性的衣壳，方法包括使处理的aav原液经受sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳，其由能够分离三种衣壳蛋白的任何凝胶组成，例如，在缓冲液中含有3-8％tris-乙酸的梯度凝胶，然后运行凝胶直到样品材料分开，并且将凝胶印迹到尼龙或硝酸纤维素膜上，优选尼龙。然后将抗aav衣壳抗体用作与变性的衣壳蛋白结合的一抗，优选抗aav衣壳单克隆抗体，最优选b1抗aav-2单克隆抗体(wobus等人，j.virol.(2000)74:9281-9293)。然后使用二抗，其与一抗结合并且含有用于检测与一抗的结合的手段，更优选含有与其共价结合的检测分子的抗igg抗体，最优选与辣根过氧化物酶共价连接的绵羊抗小鼠igg抗体。用于检测结合的方法用于半定量地确定一抗和二抗之间的结合，优选能够检测放射性同位素发射、电磁辐射或比色变化的检测方法，最优选化学发光检测试剂盒。例如，对于sds-page，可以获取来自柱级分的样品，并且在含有还原剂(例如dtt)的sds-page上样缓冲液中加热，并且在预制梯度聚丙烯酰胺凝胶(例如novex)上分辨衣壳蛋白。根据制造商的说明书或其它合适的染色方法，即sypro ruby或考马斯染色，可以使用silverxpress(invitrogen，ca)执行银染色。在一个实施方案中，柱级分中aav载体基因组(vg)的浓度可以通过定量实时pcr(q-pcr)进行测量。样品用dna酶i(或其它合适的核酸酶)进行稀释且消化，以去除外源dna。在核酸酶失活后，将样品进一步稀释，并且使用引物和taqman
tm
荧光探针进行扩增，所述taqman
tm
荧光探针对于引物间的dna序列是特异性的。在applied biosystems prism 7700 sequence detection system上，对于每个样品测量达到限定荧光水平所需的循环数目(阈值循环，ct)。含有与aav载体中包含的相同的序列的质粒dna用于生成q-pcr反应中的标准曲线。从样品中获得的循环阈值(ct)值，通过将其针对质粒标准曲线的ct值标准化，用于确定载体基因组滴度。也可以使用基于数字pcr的终点测定。
[0137]
在一个方面，使用优化的q-pcr方法，其利用广谱丝氨酸蛋白酶，例如蛋白酶k(例如从qiagen商购可得)。更特别地，优化的qpcr基因组滴度测定类似于标准测定，不同之处在于在dna酶i消化后，样品用蛋白酶k缓冲液进行稀释，并且用蛋白酶k进行处理，随后为热失活。适当地，样品用其量等于样品大小的蛋白酶k缓冲液进行稀释。蛋白酶k缓冲液可以浓缩至2倍或更高。通常，蛋白酶k处理为约0.2mg/ml，但可以从0.1mg/ml到约1mg/ml不等。处理步骤一般在约55℃下进行约15分钟，但可以在较低温度(例如，约37℃至约50℃)下经过较长时间段(例如，约20分钟至约30分钟)执行，或在较高温度(例如，高达约60℃)下执行较短的时间段(例如，约5至10分钟)。类似地，热失活一般为在约95℃下约15分钟，但可以降低温度(例如约70至约90℃)并延长时间(例如约20分钟至约30分钟)。然后将样品稀释(例如，1000倍)，并且如标准测定中所述的经受taqman分析。
[0138]
另外或可替代地，可以使用微滴式数字pcr(ddpcr)。例如，通过ddpcr用于确定单链和自互补aav载体基因组滴度的方法已得到描述。参见例如，m.lock等人，hu gene therapy methods，hum gene ther methods.2014apr；25(2):115-25.doi:10.1089/hgtb.2013.131。电子版2014年2月14日。
[0139]
简言之，用于从基因组缺陷的aavhu68中间体中分离具有包装基因组序列的raavhu68颗粒的方法，涉及使包含重组aavhu68病毒颗粒和aavhu68衣壳中间体的悬浮液经受快速高效液相层析，其中所述aavhu68病毒颗粒和aavhu68中间体结合在约10.2的ph下平衡的强阴离子交换树脂，并且经受盐梯度，同时监测洗脱物在约260纳米(nm)和约280nm处的紫外线吸光度。尽管对于raavhu68不太理想，但ph可能在约10.0至10.4的范围内。在该方法中，aavhu68完整衣壳从a260/a280比率达到拐点时洗脱的级分中收集。在一个实例中，对于亲和层析步骤，渗滤的产物可以应用于有效捕获aav2/hu68血清型的capture select
tm poros-aav2/9亲和树脂(life technologies)。在这些离子条件下，显著百分比的残留细胞dna和蛋白质流过柱，而aav颗粒被有效捕获。
[0140]
将raav.harsa悬浮于合适的生理学相容组合物(例如，缓冲盐水)中。该组合物可以冷冻用于贮存，以后解冻并且任选地用合适的稀释剂稀释。可替代地，可以将载体制备为组合物，其适合于递送至患者，而无需进行冷冻和解冻步骤。
[0141]
如本文使用的，术语“nab滴度”是产生了多少中和抗体(例如，抗aav nab)的测量，所述中和抗体中和其靶向表位(例如，aav)的生理效应。抗aav nab滴度可以如例如calcedo，r.等人，worldwide epidemiology of neutralizing antibodies to adeno-associated viruses.journal of infectious diseases，2009.199(3):第381-390页中所述进行测量，所述参考文献引入本文作为参考。
[0142]
缩写“sc”指自互补的。“自互补aav”指这样的构建体，其中由重组aav核酸序列携带的编码区已设计为形成分子内双链dna模板。在感染后，代替等待细胞介导的第二条链的合成，scaav的两个互补的一半缔合以形成一个双链dna(dsdna)单元，其即用于立即复制和转录。参见例如，d m mccarty等人，“self-complementary recombinant adeno-associated virus(scaav)vectors promote efficient transduction independently of dna synthesis”，gene therapy，(2001年8月)，第8卷，第16期，第1248-1254页。自互补aav在例如美国专利号6,596,535；7,125,717；和7,456,683中进行描述，所述美国专利各自整体引入本文作为参考。
[0143]“复制缺陷型病毒”或“病毒载体”指合成或人工病毒颗粒，其中含有目的基因的表达盒被包装在病毒衣壳或包膜中，其中也包装在病毒衣壳中或包膜内的任何病毒基因组序列是复制缺陷型的；即，它们不能生成子代病毒粒子，但保留感染靶细胞的能力。在一个实施方案中，病毒载体的基因组并不包括编码复制所需的酶的基因(基因组可以被改造为“无病毒基因的(gutless)
”–
仅含有侧翼为人工基因组的扩增和包装所需的信号的目的基因)，但这些基因可能在生产过程中供应。因此，它被视为对于基因疗法中的使用是安全的，因为除非在复制所需的病毒酶的存在下，不能发生通过子代病毒粒子的复制和感染。
[0144]
在许多情况下，raav颗粒称为dna酶抗性的。然而，除这种核酸内切酶(dna酶)之外，其它核酸内切酶和核酸外切酶也可以用于本文所述的纯化步骤中，以去除污染性核酸。可以选择此类核酸酶，以降解单链dna和/或双链dna和rna。此类步骤可以含有单一核酸酶
或针对不同靶的核酸酶的混合物，并且可以是核酸内切酶或核酸外切酶。
[0145]
术语“核酸酶抗性”指示aav衣壳已完全组装在表达盒周围，所述表达盒设计为将基因递送到宿主细胞，并且在核酸酶温育步骤期间保护这些包装的基因组序列免于降解(消化)，所述核酸酶温育步骤设计为去除来自生产工艺的可能存在的污染性核酸。
[0146]
vi.其它载体
[0147]
在一个方面，本文提供的是载体，其可用于治疗有需要的受试者中的与arsa突变相关或由功能性芳基硫酸酯酶a的正常水平方面的缺陷引起的疾病(例如mld)。载体携带在调控序列的控制下的编码功能性人芳基硫酸酯酶a(harsa)的核酸序列，所述调控序列指导靶细胞中的harsa表达。在某些实施方案中，harsa编码序列与seq id no:1具有约95％至100％同一性。另外或可替代地，功能性harsa蛋白具有氨基酸序列seq id no:2。在某些实施方案中，harsa-编码序列是seq id no:1。在某些实施方案中，载体或包含载体的组合物可施用于有需要的受试者，以改善与arsa突变相关或由功能性芳基硫酸酯酶a的正常水平方面的缺陷引起的疾病(例如mld)的症状，和/或延迟与arsa突变相关或由功能性芳基硫酸酯酶a的正常水平方面的缺陷引起的疾病(例如mld)的进展。
[0148]
在某些实施方案中，载体包含表达盒。在某些实施方案中，表达盒包含在指导harsa表达的调控序列的控制下、编码功能性人芳基硫酸酯酶a(harsa)的核酸序列。在某些实施方案中，功能性harsa蛋白包含信号肽和seq id no:2的氨基酸(aa)19至aa 507的氨基酸序列。在某些实施方案中，信号肽具有seq id no:2的aa 1至aa 18的氨基酸序列或seq id no:4的aa 1至aa 20的氨基酸序列。在某些实施方案中，harsa编码序列具有seq id no:1的核苷酸(nt)55至nt 1521的序列、或与其具有至少95％至99.9％同一性的编码功能性harsa的序列。在某些实施方案中，harsa编码序列是seq id no:1或seq id no:3。关于更多细节，参见部分i和iii。
[0149]
在某些实施方案中，载体是选自重组细小病毒、重组慢病毒、重组逆转录病毒或重组腺病毒的病毒载体；或者选自裸露dna、裸露rna、无机颗粒、脂质颗粒、基于聚合物的载体或基于壳聚糖的制剂的非病毒载体。所选择的载体可以通过任何合适的方法进行递送，所述方法包括转染、电穿孔、脂质体递送、膜融合技术、高速dna包被的小球、病毒感染和原生质体融合。用于制备此类构建体的方法是具有核酸操作技术的人员已知的，并且包括遗传改造、重组改造和合成技术。参见例如，sambrook等人，molecular cloning:a laboratory manual，cold spring harbor press，cold spring harbor，ny。
[0150]
在某些实施方案中，载体适合于经由大池内注射(icm)施用于患者，包括经由ct引导的枕下注射到大池内。在某些实施方案中，载体适合于施用于7岁或更年幼的受试者。在某些实施方案中，载体适合于施用于有需要的受试者，以改善异染性脑白质营养不良或与芳基硫酸酯酶a(arsa)基因突变相关的疾病的症状，和/或延迟异染性脑白质营养不良或与芳基硫酸酯酶a(arsa)基因突变相关的疾病的进展。在某些实施方案中，载体以单一剂量施用。关于更多细节，参见部分ii和部分viii。
[0151]“复制缺陷型病毒”或“病毒载体”指合成或人工病毒颗粒，其中含有目的基因(例如harsa编码序列)的表达盒被包装在病毒衣壳或包膜中，其中也包装在病毒衣壳中或包膜内的任何病毒基因组序列是复制缺陷型的；即，它们不能生成子代病毒粒子，但保留感染靶细胞的能力。在一个实施方案中，病毒载体的基因组并不包括编码复制所需的酶的基因(基
因组可以被改造为“无病毒基因的
”–
仅含有侧翼为人工基因组的扩增和包装所需的信号的目的转基因)，但这些基因可能在生产过程中供应。因此，它被视为对于基因疗法中的使用是安全的，因为除非在复制所需的病毒酶的存在下，不能发生通过子代病毒粒子的复制和感染。此类复制缺陷型病毒可以是腺相关病毒(aav)、腺病毒、慢病毒(整合的或非整合的)、或另一种合适的病毒来源。
[0152]
vii.组合物
[0153]
在一个进一步方面，本文提供的是包含如本文所述的raav或载体和水性悬浮介质的组合物。在某些实施方案中，提供了包含制剂缓冲液和如所述的raav或载体的水性组合物。在某些实施方案中，制剂缓冲液包含：人工脑脊液，其包含缓冲盐水以及钠、钙、镁、钾或其混合物中的一种或多种；和表面活性剂。在某些实施方案中，制剂缓冲液包含约0.0005％至约0.001％的表面活性剂。在某些实施方案中，组合物处于7.2至7.8的ph下。在某些实施方案中，aav.cb7.ci.harsaco.rbg药物产品由如本文所述的非复制性重组腺相关病毒(raav)载体和制剂缓冲液组成。
[0154]
在某些实施方案中，提供了包含根据权利要求1至10中任一项的raav和制剂缓冲液的水性药物组合物。在某些实施方案中，制剂缓冲液包含：人工脑脊液，其包含缓冲盐水以及钠、钙、镁、钾或其混合物中的一种或多种；和表面活性剂。在某些实施方案中，表面活性剂以0.0005％至约0.001％的药物组合物存在。在某些实施方案中，组合物处于7.5至7.8范围内的ph下。在某些实施方案中，制剂缓冲液适合于静脉内递送、鞘内施用或侧脑室内施用。
[0155]
在某些实施方案中，提供的是包含如所述的载体和制剂缓冲液的药物组合物。在某些实施方案中，制剂缓冲液适合于静脉内递送、鞘内施用或侧脑室内施用。
[0156]
在某些实施方案中，组合物适合于经由大池内注射(icm)施用于患者，包括经由ct引导的枕下注射到大池内。在某些实施方案中，组合物适合于施用于7岁或更年幼的受试者。在某些实施方案中，组合物适合于施用于有需要的受试者，以改善异染性脑白质营养不良或与芳基硫酸酯酶a(arsa)基因突变相关的疾病的症状，和/或延迟异染性脑白质营养不良或与芳基硫酸酯酶a(arsa)基因突变相关的疾病的进展。在某些实施方案中，组合物以单一剂量施用。在某些实施方案中，组合物具有至少2.50x10
13
gc raav/ml。
[0157]
本文提供的是含有至少一种raav原液(例如，raavhu68原液或突变型raavhu68原液)和任选的载体、赋形剂和/或防腐剂的组合物。raav原液指多个相同的raav载体，例如，以例如下文在浓度和剂量单位的讨论中描述的量。
[0158]
如本文使用的，“载体”包括任何和所有溶剂、分散介质、媒介物、包衣、稀释剂、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂、缓冲液、载体溶液、悬浮液、胶体等等。此类介质和试剂用于药物活性物质的用途是本领域众所周知的。还可以将补充性活性成分掺入组合物内。短语“药学上可接受的”指当施用于宿主时，不产生过敏或类似不良反应的分子实体和组合物。递送媒介物如脂质体、纳米胶囊、微粒、微球体、脂质颗粒、囊泡等等，可以用于将本发明的组合物引入合适的宿主细胞内。特别地，raav载体递送的载体基因组可以配制用于封装在脂质颗粒、脂质体、囊泡、纳米球或纳米颗粒等等中递送。
[0159]
在一个实施方案中，组合物包括适合于递送至受试者的最终制剂，例如，是缓冲至生理学相容的ph和盐浓度的水性液体悬浮液。任选地，制剂中存在一种或多种表面活性剂。
在另一个实施方案中，组合物可以作为浓缩物运输，所述浓缩物被稀释用于施用于受试者。在其它实施方案中，组合物可以是冻干的并且在施用时进行重构。
[0160]
合适的表面活性剂或表面活性剂的组合可以选自无毒的非离子型表面活性剂。在一个实施方案中，选择以伯羟基封端的双官能嵌段共聚物表面活性剂，例如，如f68[basf]，也称为泊洛沙姆188，其具有中性ph，具有8400的平均分子量。可以选择其它表面活性剂和其它泊洛沙姆，即由侧翼为聚氧乙烯(聚(环氧乙烷))的两条亲水链的聚氧丙烯(聚(环氧丙烷))的中心疏水链组成的非离子三嵌段共聚物、solutol hs 15(聚乙二醇-15羟基硬脂酸酯)、labrasol(聚氧辛酸甘油酯)、聚氧10油基醚、tween(聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯)、乙醇和聚乙二醇。在一个实施方案中，制剂含有泊洛沙姆。这些共聚物通常以字母“p”(泊洛沙姆)随后为三个数字进行命名：前两个数字x100给出聚氧丙烯核的近似分子质量，而最后一个数字x10给出聚氧乙烯含量百分比。在一个实施方案中，选择泊洛沙姆188。在一个实施方案中，表面活性剂可以以至多约0.0005％至约0.001％(基于重量比，w/w％)的悬浮液的量存在。在另一个实施方案中，表面活性剂可以以至多约0.0005％至约0.001％(基于体积比，v/v％)的悬浮液的量存在。在再一个实施方案中，表面活性剂可以以至多约0.0005％至约0.001％的悬浮液的量存在，其中n％指示每100ml悬浮液n克。在再一个实施方案中，表面活性剂可以以至多约0.0005％至约0.001％(基于重量/体积比，v/w％)的悬浮液的量存在。
[0161]
如本文使用的，在某些实施方案中，在指浓度时，“％”是重量比，例如，物质(待经由溶剂溶解到溶液内的)重量/溶剂的重量的百分比，或物质(待经由溶剂溶解到溶液内的)重量/溶液的重量的百分比。在某些实施方案中，在指浓度时，“％”是体积比，例如，物质(待经由溶剂溶解到溶液内的)体积/溶剂的体积的百分比，或物质(待经由溶剂溶解到溶液内的)体积/溶液的体积的百分比。在某些实施方案中，在指浓度时，“％”指示每100ml溶剂或溶液的物质(待经由溶剂溶解到溶液内的)克数。在某些实施方案中，在指浓度时，“％”是重量/体积的比率，例如，物质(待经由溶剂溶解到溶液内的)重量/溶剂的体积的百分比、或物质(待经由溶剂溶解到溶液内的)重量/溶液的体积的百分比。
[0162]
载体以足够的量施用，以转染细胞并提供足够水平的基因转移和表达，以提供治疗益处，而没有不适当的不良作用或具有医学上可接受的生理效应，其可以由医学领域的技术人员确定。常规和药学上可接受的施用途径包括但不限于直接递送至所需器官(例如脑、csf、肝脏(任选地经由肝动脉)、肺、心脏、眼、肾脏)、经口、吸入、鼻内、鞘内、气管内、动脉内、眼内、静脉内、肌内、皮下、皮内、实质内、侧脑室内、鞘内、icm、腰椎穿刺和其它肠胃外施用途径。需要时，施用途径可以进行组合。
[0163]
病毒载体的剂量主要取决于因素如待治疗的状况，患者的年龄、重量和健康，并且因此可以在患者中不同。例如，病毒载体的治疗有效的人剂量一般在约25至约1000微升至约100ml溶液的范围内，所述溶液含有约1x109至1x10
16
个载体基因组拷贝的浓度。在某些实施方案中，递送约1ml至约15ml、或约2.5ml至约10ml、或约5ml悬浮液的体积。在某些实施方案中，递送约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14或约15ml悬浮液的体积。在某些实施方案中，以该体积施用总共约8.9x10
12
至2.7x10
14
gc的剂量。在某些实施方案中，以该体积施用约1.1x10
10
gc/g脑质量至约3.3x10
11
gc/g脑质量的剂量。在某些实施方案中，以该体积施用约3.0x109、约4.0x109、约5.0x109、约6.0x109、约7.0x109、约
8.0x109、约9.0x109、约1.0x10
10
、约1.1x10
10
、约1.5x10
10
、约2.0x10
10
、约2.5x10
10
、约3.0x10
10
、约3.3x10
10
、约3.5x10
10
、约4.0x10
10
、约4.5x10
10
、约5.0x10
10
、约5.5x10
10
、约6.0x10
10
、约6.5x10
10
、约7.0x10
10
、约7.5x10
10
、约8.0x10
10
、约8.5x10
10
、约9.0x10
10
、约9.5x10
10
、约1.0x10
11
、约1.1x10
11
、约1.5x10
11
、约2.0x10
11
、约2.5x10
11
、约3.0x10
11
、约3.3x10
11
、约3.5x10
11
、约4.0x10
11
、约4.5x10
11
、约5.0x10
11
、约5.5x10
11
、约6.0x10
11
、约6.5x10
11
、约7.0x10
11
、约7.5x10
11
、约8.0x10
11
、约8.5x10
11
、约9.0x10
11
gc/克脑质量的剂量。
[0164]
受试者年龄假定的脑质量(g)≥4至《9个月600≥9至《18个月1000≥18个月至《3岁1100≥3岁1300
[0165]
调整剂量以针对任何副作用平衡治疗益处，并且此类剂量可以根据采用重组载体的治疗应用而变。可以监测转基因产物的表达水平，以确定导致病毒载体，优选含有小基因的aav载体的剂量频率。任选地，类似于对于治疗目的描述的施用方案可以用于使用本发明的组合物的免疫。
[0166]
复制缺陷型病毒组合物可以以剂量单位进行配制，以含有在约1.0x109gc至约1.0x10
16
gc(以治疗受试者)范围内的复制缺陷型病毒的量，包括在该范围内的所有整数量或分数量，并且对于人患者优选为1.0x10
12
gc至1.0x10
14
gc。在一个实施方案中，组合物配制为含有至少1x109、2x109、3x109、4x109、5x109、6x109、7x109、8x109或9x109gc/剂量，包括在该范围内的所有整数量或分数量。在另一个实施方案中，组合物配制为含有至少1x10
10
、2x10
10
、3x10
10
、4x10
10
、5x10
10
、6x10
10
、7x10
10
、8x10
10
或9x10
10
gc/剂量，包括在该范围内的所有整数量或分数量。在另一个实施方案中，组合物配制为含有至少1x10
11
、2x10
11
、3x10
11
、4x10
11
、5x10
11
、6x10
11
、7x10
11
、8x10
11
或9x10
11
gc/剂量，包括在该范围内的所有整数量或分数量。在另一个实施方案中，组合物配制为含有至少1x10
12
、2x10
12
、3x10
12
、4x10
12
、5x10
12
、6x10
12
、7x10
12
、8x10
12
或9x10
12
gc/剂量，包括在该范围内的所有整数量或分数量。在另一个实施方案中，组合物配制为含有至少1x10
13
、2x10
13
、3x10
13
、4x10
13
、5x10
13
、6x10
13
、7x10
13
、8x10
13
或9x10
13
gc/剂量，包括在该范围内的所有整数量或分数量。在另一个实施方案中，组合物配制为含有至少1x10
14
、2x10
14
、3x10
14
、4x10
14
、5x10
14
、6x10
14
、7x10
14
、8x10
14
或9x10
14
gc/剂量，包括在该范围内的所有整数量或分数量。在另一个实施方案中，组合物配制为含有至少1x10
15
、2x10
15
、3x10
15
、4x10
15
、5x10
15
、6x10
15
、7x10
15
、8x10
15
或9x10
15
gc/剂量，包括在该范围内的所有整数量或分数量。在一个实施方案中，对于人应用，剂量范围可以为1x10
10
至约1x10
12
gc/剂量，包括在该范围内的所有整数量或分数量。
[0167]
这些上述剂量可以在各种体积的载体、赋形剂或缓冲液制剂中施用，范围为约25至约1000微升，或更高的体积，包括在该范围内的所有数目，取决于待治疗区域的大小、使用的病毒滴度、施用途径和所需的方法效应。在一个实施方案中，载体、赋形剂或缓冲液的体积为至少约25μl。在一个实施方案中，体积为约50μl。在另一个实施方案中，体积为约75μl。在另一个实施方案中，体积为约100μl。在另一个实施方案中，体积为约125μl。在另一个实施方案中，体积为约150μl。在另一个实施方案中，体积为约175μl。在再一个实施方案中，体积为约200μl。在另一个实施方案中，体积为约225μl。在再一个实施方案中，体积为约250
μl。在再一个实施方案中，体积为约275μl。在再一个实施方案中，体积为约300μl。在再一个实施方案中，体积为约325μl。在另一个实施方案中，体积为约350μl。在另一个实施方案中，体积为约375μl。在另一个实施方案中，体积为约400μl。在另一个实施方案中，体积为约450μl。在另一个实施方案中，体积为约500μl。在另一个实施方案中，体积为约550μl。在另一个实施方案中，体积为约600μl。在另一个实施方案中，体积为约650μl。在另一个实施方案中，体积为约700μl。在另一个实施方案中，体积为约700至1000μl。
[0168]
在某些实施方案中，剂量可以在约1x109gc/g脑质量至约1x10
12
gc/g脑质量的范围内。在某些实施方案中，剂量可以在约1x10
10
gc/g脑质量至约1x10
12
gc/g脑质量的范围内。在某些实施方案中，剂量可以在约3x10
10
gc/g脑质量至约5x10
11
gc/g脑质量的范围内。
[0169]
在一个实施方案中，病毒构建体可以以至少约1x109gc至约1x10
15
、或约1x10
11
至5x10
13
gc的剂量递送。用于递送这些剂量和浓度的合适体积可以由本领域技术人员进行确定。例如，可以选择约1μl至150ml的体积，而对于成人选择更高的体积。通常，对于新生儿，合适的体积为约0.5ml至约10ml，对于较大的婴儿，可以选择约0.5ml至约15ml。对于幼儿，可以选择约0.5ml至约20ml的体积。对于儿童，可以选择最多约30ml的体积。对于青春期前儿童和青少年，可以选择最多约50ml的体积。在另外其它实施方案中，患者可以接受选择为约5ml至约15ml、或约7.5ml至约10ml的体积的鞘内施用。可以确定其它合适的体积和剂量。可以调整剂量以针对任何副作用平衡治疗益处，并且此类剂量可以根据采用重组载体的治疗应用而变。
[0170]
可以根据公开的方法将上述重组载体递送至宿主细胞。优选悬浮于生理学相容载体中的raav可以施用于人或非人哺乳动物患者。在某些实施方案中，为了施用于人患者，将raav适当地悬浮于含有盐水、表面活性剂和生理学相容的盐或盐混合物的水溶液中。适当地，将制剂调整到生理学可接受的ph，例如在ph 6至9、或ph 6.5至7.5、ph 7.0至7.7、或ph 7.2至7.8的范围内。由于脑脊液的ph为约7.28至约7.32，对于鞘内递送，可能需要在该范围内的ph；而对于静脉内递送，可能需要约6.8至约7.2的ph。然而，可以选择在最宽范围和这些子范围内的其它ph用于其它递送途径。
[0171]
在另一个实施方案中，组合物包括载体、稀释剂、赋形剂和/或佐剂。鉴于转移病毒针对的适应症，合适的载体可以由本领域技术人员容易地选择。例如，一种合适的载体包括盐水，其可以用各种缓冲溶液进行配制(例如磷酸盐缓冲盐水)。其它示例性载体包括无菌盐水、乳糖、蔗糖、磷酸钙、明胶、右旋糖酐、琼脂、果胶、花生油、芝麻油和水。缓冲液/载体应该包括这样的组分，其防止raav粘在输液管上，但不干扰体内的raav结合活性。合适的表面活性剂或表面活性剂的组合可以选自无毒的非离子型表面活性剂。在一个实施方案中，选择以伯羟基封端的双官能嵌段共聚物表面活性剂，例如，如泊洛沙姆188(也以商品名f68[basf]、f68、f68、p188已知)，其具有中性ph，具有8400的平均分子量。可以选择其它表面活性剂和其它泊洛沙姆，即由侧翼为聚氧乙烯(聚(环氧乙烷))的两条亲水链的聚氧丙烯(聚(环氧丙烷))的中心疏水链组成的非离子三嵌段共聚物、solutol hs 15(聚乙二醇-15羟基硬脂酸酯)、labrasol(聚氧辛酸甘油酯)、聚氧10油基醚、tween(聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯)、乙醇和聚乙二醇。在一个实施方案中，制剂含有泊洛沙姆。这些共聚物通常以字母“p”(泊洛沙姆)随后为三个数字进行命名：前两个数字x100给出聚氧丙烯核的近似分子质量，而最后一个数字x10给出聚氧乙烯
含量百分比。在一个实施方案中，选择泊洛沙姆188。表面活性剂可以以至多约0.0005％至约0.001％的悬浮液的量存在。
[0172]
在一个实例中，制剂可以含有例如缓冲盐水溶液，其包含在水中的氯化钠、碳酸氢钠、右旋糖、硫酸镁(例如硫酸镁
·
7h2o)、氯化钾、氯化钙(例如氯化钙
·
2h2o)、磷酸氢二钠及其混合物中的一种或多种。适当地，对于鞘内递送，渗透压在与脑脊液相容的范围内(例如，约275至约290)；参见例如，emedicine.medscape.com/-article/2093316-overview。任选地，对于鞘内递送，商购可得的稀释剂可以用作助悬剂、或与另一种助悬剂和其它任选的赋形剂组合使用。
[0173]
参见例如，elliotts溶液[lukare medical]。每10ml elliotts b溶液含有：氯化钠，usp-73mg；碳酸氢钠，usp-19mg；右旋糖，usp 8mg；硫酸镁
·
7h2o，usp 3mg；氯化钾，usp-3mg；氯化钙
·
2h2o，usp-2mg；磷酸氢二钠
·
7h2o，usp-2mg；注射用水，usp适量10ml。
[0174]
电解质浓度：钠149meq/升；碳酸氢盐22.6meq/升；钾4.0meq/升；氯化物132meq/升；钙2.7meq/升；硫酸盐2.4meq/升；镁2.4meq/升；磷酸盐1.5meq/升。
[0175]
成分的式和分子量为：
[0176]
成分分子式分子量氯化钠nacl58.44碳酸氢钠nahco384.01右旋糖c6h
12
o6180.16硫酸镁
·
7h2omg2so4·
7h2o246.48氯化钾kcl74.55氯化钙
·
2h2ocacl2·
2h2o147.01磷酸氢二钠
·
7h2ona2hpo4·
7h2o268.07
[0177]
elliotts b溶液的ph为6至7.5，且渗透压为288mosmol/l(计算的)。在某些实施方案中，含有raavhu68.harsa的组合物在6.8至8、或7.2至7.8、或7.5至8的范围内的ph下递送。对于鞘内递送，可能需要高于7.5的ph，例如7.5至8或7.8。
[0178]
在某些实施方案中，制剂可以含有不含碳酸氢钠的缓冲盐水溶液。此类制剂可以含有缓冲盐水溶液，其包含在水中的磷酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化镁及其混合物中的一种或多种，例如harvard’s缓冲液。水溶液可以进一步含有p188，从basf商购可得的泊洛沙姆，其以前以商品名f68销售。水溶液可以具有7.2的ph。
[0179]
在另一个实施方案中，制剂可以含有缓冲盐水溶液，其包含1mm磷酸钠(na3po4)、150mm氯化钠(nacl)、3mm氯化钾(kcl)、1.4mm氯化钙(cacl2)、0.8mm氯化镁(mgcl2)和0.001％泊洛沙姆(例如)188，ph 7.2。参见例如，harvardapparatus.com/harvard-apparatus-perfusion-fluid.html。在某些实施方案中，由于用harvard’s缓冲液观察到更好的ph稳定性，因此harvard’s缓冲液是优选的。下表提供了harvard’s缓冲液和elliot’s b缓冲液的比较。
[0180]
脑脊液(csf)组合物
[0181][0182]
在某些实施方案中，制剂缓冲液是具有pluronic f68的人工csf。在其它实施方案中，制剂可以含有一种或多种渗透促进剂。合适的渗透促进剂的实例可以包括例如甘露糖醇、甘胆酸钠、牛磺胆酸钠、脱氧胆酸钠、水杨酸钠、辛酸钠、癸酸钠、十二烷基硫酸钠、聚氧乙烯-9-月桂醚或edta。
[0183]
任选地，除raav和载体之外，本发明的组合物还可以含有其它常规药物成分，例如防腐剂或化学稳定剂。合适的示例性防腐剂包括三氯叔丁醇、山梨酸钾、山梨酸、二氧化硫、没食子酸丙酯、对羟基苯甲酸酯、乙基香草醛、丙三醇、苯酚和对氯苯酚。合适的化学稳定剂包括明胶和白蛋白。
[0184]
根据本发明的组合物可以包含例如上文定义的药学上可接受的载体。合适地，本文所述的组合物包含有效量的一种或多种aav，其悬浮于药学上合适的载体中和/或与合适的赋形剂混合，所述赋形剂设计用于经由注射、渗透泵、鞘内导管递送至受试者，或者用于通过另一种装置或途径递送。在一个实例中，组合物配制用于鞘内递送。
[0185]
如本文使用的，术语“鞘内递送”或“鞘内施用”指经由注射到椎管内，更具体而言注射到蛛网膜下腔内，使得它到达脑脊液(csf)的药物施用途径。鞘内递送可以包括腰椎穿刺、脑室内(包括侧脑室内(icv))、枕下/脑池内和/或c1-2穿刺。例如，可以借助于腰椎穿刺引入材料，用于扩散到整个蛛网膜下腔。在另一个实例中，注射可以进入大池内。
[0186]
如本文使用的，术语“脑池内递送”或“脑池内施用”指直接进入小脑延髓池的脑脊液内，更具体而言经由枕下穿刺或通过直接注射到大池(cisterna magna)内或经由永久放置的管的药物施用途径。
[0187]
在某些实施方案中，最终制剂缓冲液包含人工脑脊液，其包含缓冲盐水以及钠、
钙、镁、钾或其混合物中的一种或多种；和表面活性剂。在某些实施方案中，表面活性剂为约0.0005％w/w至约0.001％w/w的悬浮液。在某些实施方案中，表面活性剂是pluronic f68。在某些实施方案中，pluronic f68以约0.0001％的悬浮液的量存在。在某些实施方案中，组合物处于7.5至7.8的ph下，用于鞘内递送。
[0188]
在某些实施方案中，本文描述的组合物的治疗在动物和/或人患者中具有最低限度至轻度无症状的drg感觉神经元变性，就感觉神经毒性和亚临床感觉神经元损伤而言是良好耐受的。
[0189]
在某些实施方案中，本文所述的组合物可用于改善所治疗的受试者中的功能结果和临床结果。此类结果可以在组合物施用后约30天、约60天、约90天、约4个月、约5个月、约6个月、约7个月、约8个月、约9个月、约10个月、约11个月、约12个月、约13个月、约14个月、约15个月、约16个月、约17个月、约18个月、约19个月、约20个月、约21个月、约22个月、约23个月、约24个月、约2.5年、约3年、约3.5年、约4年、约4.5年，然后每年一次直到约5年进行测量。测量频率可以为约每1个月、约每2个月、约每3个月、约每4个月、约每5个月、约每6个月、约每7个月、约每8个月、约每9个月、约每10个月、约每11个月或约每12个月一次。
[0190]
在某些实施方案中，与未治疗的对照相比，本文所述的组合物显示了在治疗的受试者中测量的药效学和临床功效。
[0191]
在某些实施方案中，药效学功效、临床功效、功能结果、临床结果、疾病改善或疾病进展可以经由下述中的一种或多种进行评价：arsa(例如，在血清或csf中)的浓度和/或水平和/或生物活性，尿硫苷脂，cns髓鞘形成(脱髓鞘负载和模式)，如通过mri测量的白质萎缩，神经元代谢物n-乙酰天冬氨酸(naa)、肌醇(mi)、胆碱(cho)和/或乳酸(lac)水平(例如，如通过质磁共振波谱(mrs)测量的)、csf硫苷脂和溶血硫苷脂水平、视觉诱发电位(vep)、脑干听觉诱发反应(baer)、胆囊壁增厚(例如，经由超声评估)；运动功能(例如，通过异染性脑白质营养不良的粗大运动功能分类(gmfc-mld)或粗大运动功能测量(gmfm))，通过成就年龄、丧失年龄、以及维持或获得运动里程碑的儿童百分比评价的运动里程碑成就(如通过世界卫生组织[who]标准定义的)，认知功能(例如，通过贝利婴儿发育量表[bsid-iii]，韦氏儿童智力量表，第五版[wisc-v]测量的总智商[iq]和子域iq)，寿命(与患者相比)，神经系统临床检查(nce)，尺神经、腓深神经、正中神经、腓肠神经的神经传导速度(ncv)，通过癫痫发作日记记录的发病年龄和癫痫发作频率，行为功能(例如，通过文兰适应行为量表，第三版(文兰-iii)测量的)，lansky表现指数，儿童生活质量量表(例如，pedsql和pedsql-is)，和/或护理人员/父母生活质量。
[0192]
在某些实施方案中，药效学功效、临床功效、功能结果、临床结果、疾病改善或疾病进展可以评价异常性质(例如生物标记物活性、电生理活性和/或成像参数)和临床观察(例如，粗大和精细运动功能、认知和语言发展、神经系统检查结果、行为和里程碑发展、以及护理人员/父母报告的结果和生活质量评价降低)。可以评价其它疾病改善或疾病进展，参见部分ii和viii，其有关节段整体引入本文作为参考。
[0193]
可替代地或另外，药效学功效、临床功效、功能结果或临床结果可以包括生物标记物，例如raavhu68.harsaco的药效学和生物活性。
[0194]
iix.方法
[0195]
在另一个方面，提供了治疗患有与arsa突变相关或由功能性芳基硫酸酯酶a的正
常水平方面的缺陷引起的疾病(例如mld)的受试者，或改善与arsa突变相关或由功能性芳基硫酸酯酶a的正常水平方面的缺陷引起的疾病(例如mld)的症状，或延迟与arsa突变相关或由功能性芳基硫酸酯酶a的正常水平方面的缺陷引起的疾病(例如mld)的进展的方法。该方法包括向有需要的受试者施用有效量的如本文所述的raav或载体。在某些实施方案中，载体或raav可经由大池内注射(icm)，例如ct引导的枕下注射到大池内施用于患者。在某些实施方案中，提供了载体或组合物，其可施用于7岁或更年幼的患有异染性脑白质营养不良的患者。在某些实施方案中，该方法涉及以单一剂量将raav或载体递送至人患者。在某些实施方案中，raav以3.00x10
10
个基因组拷贝(gc)/克(gc/g)脑质量至1.00x10
12
gc/g脑质量的剂量进行施用。在某些实施方案中，在施用之后，受试者的疾病症状得到改善和/或疾病进展得到延迟。
[0196]
尽管神经系统定向的aav基因疗法主要靶向体内神经元，但交叉校正潜力打开了校正arsa缺陷的成髓鞘细胞的可能性，所述细胞不能通过大多数基因治疗载体在体内进行转导(cearley等人，2008；lawlor等人，2009)。
[0197]
在某些实施方案中，本文的“有效量”是实现mld症状的改善和/或mld进展延迟的量。
[0198]
载体以足够的量施用，以转染细胞并提供足够水平的基因转移和表达，以提供治疗益处，而没有不适当的不良作用或具有医学上可接受的生理效应，其可以由医学领域的技术人员确定。常规和药学上可接受的施用途径包括但不限于直接递送至所需器官(例如脑、csf、肝脏(任选地经由肝动脉)、肺、心脏、眼、肾脏)、经口、吸入、鼻内、鞘内、气管内、动脉内、眼内、静脉内、肌内、皮下、皮内、实质内、侧脑室内、鞘内、icm、腰椎穿刺和其它肠胃外施用途径。需要时，施用途径可以进行组合。
[0199]
病毒载体(例如raav)的剂量主要取决于因素如待治疗的状况，患者的年龄、重量和健康，并且因此可以在患者中不同。例如，病毒载体的治疗有效的人剂量一般在约25至约1000微升至约100ml溶液的范围内，所述溶液含有约1x109至1x10
16
个载体基因组拷贝的浓度。在某些实施方案中，递送约1ml至约15ml、或约2.5ml至约10ml、或约5ml悬浮液的体积。在某些实施方案中，递送约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14或约15ml悬浮液的体积。在某些实施方案中，以该体积施用总共约8.9x10
12
至2.7x10
14
gc的剂量。在某些实施方案中，以该体积施用约1.1x10
10
gc/g脑质量至约3.3x10
11
gc/g脑质量的剂量。在某些实施方案中，以该体积施用约3.0x109、约4.0x109、约5.0x109、约6.0x109、约7.0x109、约8.0x109、约9.0x109、约1.0x10
10
、约1.1x10
10
、约1.5x10
10
、约2.0x10
10
、约2.5x10
10
、约3.0x10
10
、约3.3x10
10
、约3.5x10
10
、约4.0x10
10
、约4.5x10
10
、约5.0x10
10
、约5.5x10
10
、约6.0x10
10
、约6.5x10
10
、约7.0x10
10
、约7.5x10
10
、约8.0x10
10
、约8.5x10
10
、约9.0x10
10
、约9.5x10
10
、约1.0x10
11
、约1.1x10
11
、约1.5x10
11
、约2.0x10
11
、约2.5x10
11
、约3.0x10
11
、约3.3x10
11
、约3.5x10
11
、约4.0x10
11
、约4.5x10
11
、约5.0x10
11
、约5.5x10
11
、约6.0x10
11
、约6.5x10
11
、约7.0x10
11
、约7.5x10
11
、约8.0x10
11
、约8.5x10
11
、约9.0x10
11
gc/克脑质量的剂量。
[0200]
调整剂量以针对任何副作用平衡治疗益处，并且此类剂量可以根据采用重组载体的治疗应用而变。可以监测转基因产物的表达水平，以确定导致病毒载体，优选含有小基因的aav载体的剂量频率。任选地，类似于对于治疗目的描述的施用方案可以用于使用本发明
的组合物的免疫。
[0201]
复制缺陷型病毒组合物可以以剂量单位进行配制，以含有在约1.0x109gc至约1.0x10
16
gc(以治疗受试者)范围内的复制缺陷型病毒的量，包括在该范围内的所有整数量或分数量，并且对于人患者优选为1.0x10
12
gc至1.0x10
14
gc。在一个实施方案中，组合物配制为含有至少1x109、2x109、3x109、4x109、5x109、6x109、7x109、8x109或9x109gc/剂量，包括在该范围内的所有整数量或分数量。在另一个实施方案中，组合物配制为含有至少1x10
10
、2x10
10
、3x10
10
、4x10
10
、5x10
10
、6x10
10
、7x10
10
、8x10
10
或9x10
10
gc/剂量，包括在该范围内的所有整数量或分数量。在另一个实施方案中，组合物配制为含有至少1x10
11
、2x10
11
、3x10
11
、4x10
11
、5x10
11
、6x10
11
、7x10
11
、8x10
11
或9x10
11
gc/剂量，包括在该范围内的所有整数量或分数量。在另一个实施方案中，组合物配制为含有至少1x10
12
、2x10
12
、3x10
12
、4x10
12
、5x10
12
、6x10
12
、7x10
12
、8x10
12
或9x10
12
gc/剂量，包括在该范围内的所有整数量或分数量。在另一个实施方案中，组合物配制为含有至少1x10
13
、2x10
13
、3x10
13
、4x10
13
、5x10
13
、6x10
13
、7x10
13
、8x10
13
或9x10
13
gc/剂量，包括在该范围内的所有整数量或分数量。在另一个实施方案中，组合物配制为含有至少1x10
14
、2x10
14
、3x10
14
、4x10
14
、5x10
14
、6x10
14
、7x10
14
、8x10
14
或9x10
14
gc/剂量，包括在该范围内的所有整数量或分数量。在另一个实施方案中，组合物配制为含有至少1x10
15
、2x10
15
、3x10
15
、4x10
15
、5x10
15
、6x10
15
、7x10
15
、8x10
15
或9x10
15
gc/剂量，包括在该范围内的所有整数量或分数量。
[0202]
在一个实施方案中，对于人应用，剂量范围可以为1x10
10
至约1x10
15
gc/kg体重，包括在该范围内的所有整数量或分数量。
[0203]
在一个实施方案中，载体的有效量为约1x109、2x109、3x109、4x109、5x109、6x109、7x109、8x109或9x109gc/kg体重，包括在该范围内的所有整数量或分数量。在另一个实施方案中，载体的有效量为约1x10
10
、2x10
10
、3x10
10
、4x10
10
、5x10
10
、6x10
10
、7x10
10
、8x10
10
或9x10
10
gc/kg体重，包括在该范围内的所有整数量或分数量。在另一个实施方案中，载体的有效量为约1x10
11
、2x10
11
、3x10
11
、4x10
11
、5x10
11
、6x10
11
、7x10
11
、8x10
11
或9x10
11
gc/kg体重，包括在该范围内的所有整数量或分数量。在另一个实施方案中，载体的有效量为约1x10
12
、2x10
12
、3x10
12
、4x10
12
、5x10
12
、6x10
12
、7x10
12
、8x10
12
或9x10
12
gc/kg体重，包括在该范围内的所有整数量或分数量。在另一个实施方案中，载体的有效量为约1x10
13
、2x10
13
、3x10
13
、4x10
13
、5x10
13
、6x10
13
、7x10
13
、8x10
13
或9x10
13
gc/kg体重，包括在该范围内的所有整数量或分数量。在另一个实施方案中，载体的有效量为约1x10
14
、2x10
14
、3x10
14
、4x10
14
、5x10
14
、6x10
14
、7x10
14
、8x10
14
或9x10
14
gc/kg体重，包括在该范围内的所有整数量或分数量。在另一个实施方案中，载体的有效量为约1x10
15
、2x10
15
、3x10
15
、4x10
15
、5x10
15
、6x10
15
、7x10
15
、8x10
15
或9x10
15
gc/kg体重，包括在该范围内的所有整数量或分数量。
[0204]
在一个实施方案中，对于人应用，剂量范围可以为1x10
10
至约1x10
15
gc/克(g)脑质量，包括在该范围内的所有整数量或分数量。在一个实施方案中，载体的有效量为约1x109、2x109、3x109、4x109、5x109、6x109、7x109、8x109或9x109gc/克(g)脑质量，包括在该范围内的所有整数量或分数量。在另一个实施方案中，载体的有效量为约1x10
10
、2x10
10
、3x10
10
、4x10
10
、5x10
10
、6x10
10
、7x10
10
、8x10
10
或9x10
10
gc/克(g)脑质量，包括在该范围内的所有整数量或分数量。在另一个实施方案中，载体的有效量为约1x10
11
、2x10
11
、3x10
11
、4x10
11
、5x10
11
、6x10
11
、7x10
11
、8x10
11
或9x10
11
gc/克(g)脑质量，包括在该范围内的所有整数量或分
数量。在另一个实施方案中，载体的有效量为约1x10
12
、2x10
12
、3x10
12
、4x10
12
、5x10
12
、6x10
12
、7x10
12
、8x10
12
或9x10
12
gc/克(g)脑质量，包括在该范围内的所有整数量或分数量。在另一个实施方案中，载体的有效量为约1x10
13
、2x10
13
、3x10
13
、4x10
13
、5x10
13
、6x10
13
、7x10
13
、8x10
13
或9x10
13
gc/克(g)脑质量，包括在该范围内的所有整数量或分数量。在另一个实施方案中，载体的有效量为约1x10
14
、2x10
14
、3x10
14
、4x10
14
、5x10
14
、6x10
14
、7x10
14
、8x10
14
或9x10
14
gc/克(g)脑质量，包括在该范围内的所有整数量或分数量。在另一个实施方案中，载体的有效量为约1x10
15
、2x10
15
、3x10
15
、4x10
15
、5x10
15
、6x10
15
、7x10
15
、8x10
15
或9x10
15
gc/克(g)脑质量，包括在该范围内的所有整数量或分数量。
[0205]
这些上述剂量可以在各种体积的载体、赋形剂或缓冲液制剂中施用，范围为约25至约1000微升，或更高的体积，包括在该范围内的所有数目，取决于待治疗区域的大小、使用的病毒滴度、施用途径和所需的方法效应。在一个实施方案中，载体、赋形剂或缓冲液的体积为至少约25μl。在一个实施方案中，体积为约50μl。在另一个实施方案中，体积为约75μl。在另一个实施方案中，体积为约100μl。在另一个实施方案中，体积为约125μl。在另一个实施方案中，体积为约150μl。在另一个实施方案中，体积为约175μl。在再一个实施方案中，体积为约200μl。在另一个实施方案中，体积为约225μl。在再一个实施方案中，体积为约250μl。在再一个实施方案中，体积为约275μl。在再一个实施方案中，体积为约300μl。在再一个实施方案中，体积为约325μl。在另一个实施方案中，体积为约350μl。在另一个实施方案中，体积为约375μl。在另一个实施方案中，体积为约400μl。在另一个实施方案中，体积为约450μl。在另一个实施方案中，体积为约500μl。在另一个实施方案中，体积为约550μl。在另一个实施方案中，体积为约600μl。在另一个实施方案中，体积为约650μl。在另一个实施方案中，体积为约700μl。在另一个实施方案中，体积为约700至1000μl。
[0206]
在某些实施方案中，剂量可以在约1x109gc/g脑质量至约1x10
12
gc/g脑质量的范围内。在某些实施方案中，剂量可以在约1x10
10
gc/g脑质量至约3x10
11
gc/g脑质量的范围内。在某些实施方案中，剂量可以在约1x10
10
gc/g脑质量至约2.5x10
11
gc/g脑质量的范围内。在某些实施方案中，剂量可以在约5x10
10
gc/g脑质量的范围内。
[0207]
在一个实施方案中，病毒构建体可以以至少约1x109gc至约1x10
15
、或约1x10
11
至5x10
13
gc的剂量递送。用于递送这些剂量和浓度的合适体积可以由本领域技术人员进行确定。例如，可以选择约1μl至150ml的体积，而对于成人选择更高的体积。通常，对于新生儿，合适的体积为约0.5ml至约10ml，对于较大的婴儿，可以选择约0.5ml至约15ml。对于幼儿，可以选择约0.5ml至约20ml的体积。对于儿童，可以选择最多约30ml的体积。对于青春期前儿童和青少年，可以选择最多约50ml的体积。在另外其它实施方案中，患者可以接受选择为约5ml至约15ml、或约7.5ml至约10ml的体积的鞘内施用。可以确定其它合适的体积和剂量。可以调整剂量以针对任何副作用平衡治疗益处，并且此类剂量可以根据对于其采用重组载体的治疗应用而变。
[0208]
可以根据公开的方法将上述重组载体递送至宿主细胞。优选悬浮于生理学相容载体中的raav可以施用于人或非人哺乳动物患者。在某些实施方案中，为了施用于人患者，将raav适当地悬浮于含有盐水、表面活性剂和生理学相容的盐或盐混合物的水溶液中。适当地，将制剂调整到生理学可接受的ph，例如在ph 6至9、或ph 6.5至7.5、ph 7.0至7.7、或ph7.2至7.8的范围内。由于脑脊液的ph为约7.28至约7.32，对于鞘内递送，可能需要在该范
围内的ph；而对于静脉内递送，可能需要约6.8至约7.2的ph。然而，可以选择在最宽范围和这些子范围内的其它ph用于其它递送途径。
[0209]
在某些实施方案中，本文描述的组合物的治疗在动物和/或人患者中具有最低限度至轻度无症状的drg感觉神经元变性，就感觉神经毒性和亚临床感觉神经元损伤而言是良好耐受的。
[0210]
在某些实施方案中，关于raav、载体、组合物和方法的提议群体由患有早发性晚期婴儿型和早期幼年型mld的受试者组成，所述受试者具有《7岁的症状发作，并且其可预测和快速的下降支持稳固的研究设计和在合理的随访期内的功能结果评估。
[0211]
经由raav、载体、组合物或方法的治疗用于疾病症状改善和延迟疾病进展，包括稳定潜在的病理状况，从而预防疾病发作并实现正常或接近正常的运动和认知发育，或者基本上预防或延迟技能丧失(例如获得发育和运动里程碑)和疾病进展。症状出现之前的患者对于这种治疗是合格的。
[0212]
aav.harsaco的aavhu68衣壳和icm roa有效地转导皮质神经元、产生髓鞘的少突胶质细胞的小子集、具有轴突投射pns内的运动神经元、以及具有轴突投射脊髓和外周神经两者内的drg感觉神经元。鉴于cns和pns两者中的广泛转导谱，arsa酶交叉校正可以治疗在许多mld患者中观察到的cns表现和外周神经病变两者，其无法通过hsc-gt或hsct解决。
[0213]
鉴于mld的性质，具有被认为在很大程度上不可逆的cns损伤，以及在早发型群体中的快速疾病进展，如本文所述的raav、载体、组合物或方法在没有疾病或患有轻度至中度疾病的患者中赋予极大的获益潜力。icm递送的aav基因疗法，例如aav.harsaco，显示了与基于hsc的疗法相比快速的动力学起效，具有在施用后3周在csf中的峰值arsa表达(参见实施例)。结果，aavharsaco可能停止疾病进展，即使是在已经具有一些临床疾病体征的患者中。因此，具有轻度至中度体征和症状的早发型mld患者，对于通过如本文所述的raav、载体、组合物或方法的治疗(称为“治疗”)是合格的，所述体征和症状包括在患者中具有轻度步态异常的那些体征和症状，所述患者是可走动的并且能够独立行走至少10步，运动里程碑获得中的明显延迟(定义为对于达到基于who标准的给定里程碑的年龄》第95百分位数(wijnhoven等人，2004))，以及在神经系统检查时的轻微体征。
[0214]
在具有轻度至中度症状的患者中不常见的疾病进展指标包括例如需要胃造口术的喂养困难、癫痫发展、认知功能低下、在神经系统检查时发现的严重异常(例如非常活跃的反射、严重的张力过低或四肢痉挛、严重吞咽困难、运用障碍或共济失调)，并且视力或听力损失将导致从试验中排除。在某些实施方案中，这种疾病进展的延迟显示为在低水平的临床功能下的疾病稳定。
[0215]
在某些实施方案中，除了需要镇静和/或lp的之外，在2年短期随访期过程中，在1、3和6个月，然后每6个月测量该方法的药效学和功效结果。在长期随访期过程中，评估频率降低到每12个月一次。考虑到未治疗的早发型mld患者中的快速疾病进展率，还选择了关于前2年的早期时间点和6个月间隔。
[0216]
在某些实施方案中，疾病症状的改善或疾病进展的延迟经由评价粗大运动功能来显示。gmfc-mld是经验证、可靠且简单的工具，用于mld患者的粗大运动功能和随着时间过去的下降的标准化评价(kehrer等人，2011b)。它在类似的工具上建模，所述工具评价患有脑性瘫痪的儿童的运动功能，并且基于自发运动的差异，将儿童的运动功能分类成五个级
别之一(palisano等人，2006)。kehrer等人修改了该分类系统，以使其与mld患者相关，并且提供了其中级别之间的区分在mld儿童的日常生活中被视为有意义的分类系统(下表)(kehrer等人，2011a；kehrer等人，2011b)。gmfc-mld既用于描述mld的自然史(kehrer等人，2011a)，又用于评估治疗干预后的运动功能(sessa等人，2016)。gmfc-mld的一个潜在局限性在于该工具对于18个月以上的儿童进行验证，因为这代表了儿童正常学习行走时的年龄上限(largo等人，1985；who，2006)。然而，该工具仍适用于在此年龄之前达到行走里程碑的儿童。
[0217]
表.异染性脑白质营养不良中的粗大运动功能分类系统
[0218][0219]
包括gmfm作为用于评估疾病症状改善或疾病进展延迟的量度。它是设计且验证的标准化的观察工具，以测量患有脑性瘫痪的儿童中，随着时间过去和在干预后的粗大运动功能变化(russell等人，1989；lundkvist josenby等人，2009；alotaibi等人，2014)。gmfm是88项工具，其评价跨越五个功能域分组的运动功能：躺和滚、坐、爬和跪、站立和行走、跑步和跳跃。还已对于健康儿童开发了参考曲线，所述健康儿童通常到5岁时获得量表上最困难的技能(行走、跑步、跳跃)(palisano等人，2006)。尽管该工具未对mld儿童进行验证，但它已证明可用于接受hsc-gt的早发型mld患者，在症状出现之前阶段治疗的受试者中证实了(接近)正常的粗大运动发展(sessa等人，2016；fumagalli等人，2017)。88项工具的优点之一在于它含有关于运动功能的各个方面的大量信息，并且子域可以分开概括且报告。由于平台效应，该工具在年龄较大的早期幼年型患者中可能无法提供信息，所述患者可能在研究入选之前已经达到最大gmfm评分(即，不能测量新技能的获得)，尽管它仍然能够显示随着时间过去，粗大运动功能的维持或丧失。
[0220]
外周神经病变是一种常见的、疼痛的且逐渐使人衰弱的mld表现，其可以加重这些患者的精细和粗大运动功能障碍(gieselmann和krageloh-mann，2010；van rappard等人，2015)。基于hsc的治疗似乎并未基本上改善外周神经病变(boucher等人，2015；van rappard等人，2016)。aav.harsaco转导神经元、drg和外周神经轴突细胞的能力允许arsa酶在脑内的表达和外周神经功能障碍。可以执行神经系统检查以评价外周神经病变的临床表现，并且可以对代表性的运动和感觉神经(腓深神经、正中神经、尺神经和腓肠神经)执行神经传导研究。由于mld主要是脱髓鞘疾病，因此神经传导速度被视为该疾病的有关神经生理学参数(biffi等人，2008)，并且可以进行测量。
[0221]
运动里程碑的发展取决于受试者入选时的年龄和疾病阶段。根据受试者入选时的年龄，受试者可能已获得了某些运动技能或尚未显示运动里程碑发展的迹象。评价将跟踪
所有里程碑的成就年龄和丧失年龄。运动里程碑成就基于下表中概述的who标准，对于六个粗大里程碑进行定义。
[0222]
表.世界卫生组织的粗大运动里程碑的表现标准
[0223][0224][0225]
改编自(wijnhoven等人，2004)。
[0226]
可以评价神经认知和行为表现，以显示疾病症状的改善或疾病进展的延迟。评价这些表现在早期幼年型mld儿童中尤为重要，在所述儿童中，行为和认知症状是该疾病的重要表现，其可能与运动功能障碍同时发展。临床量表可以用于量化aav.harsaco对认知、语言和运动功能的发展和变化的作用，其可以使用bsid-iii和wisc-v进行评价，伴随过渡到根据患者估计的发育年龄完成的年龄适当的评价工具。结果可以与典型发育儿童和未治疗儿童的标准进行比较。每个提议的测量先前已用于mld群体中(clarke等人，1989；boucher等人，2015；sessa等人，2016)。
[0227]
·
bsid-iii：该量表主要用于评价1-42个月的婴儿和幼儿的发育(albers和grieve，2007)。它由一系列标准化的发育游戏任务组成。通过将成功完成项目的原始评分转换为量表评分和综合评分，随后将评分与从相同年龄的典型发育儿童获得的标准进行比较，它衍生出发育商数。bsid-iii具有三个主要子测试。认知量表包括此类项目，如对熟悉物体和不熟悉物体的注意、寻找掉落的物体和假装游戏。语言量表评价语言的理解和表达(例如，遵循指示和命名物体的能力)。运动量表测量粗大和精细运动技能(例如抓握、坐下、叠积木和爬楼梯)。因此，bsid-iii可以提供另外的运动功能信息，以补充gmfc-mld和gmfm。
[0228]
·
wisc-v：该量表是对6至16岁的儿童个别进行的智力测试。它生成代表儿童的一
般智能的全量表iq，并且提供五个主要指数评分：言语理解指数、视觉空间指数、流体推理指数、工作记忆指数和处理速度指数。这些指数代表了儿童在离散认知领域的能力。
[0229]
包括存活作为疾病症状改善或疾病进展延迟的量度。对于诊断有晚期婴儿型mld的大多数患者，预计在生命的前5年中的死亡，具有25％的5年存活(mahmood等人，2010)，尽管以目前的支持性护理水平，存活可以延长到生命的第二个十年(gomez-ospina，2017)。因此，5年随访可能足以证实晚期婴儿型群体中的存活益处，尽管它对于评价早期幼年型队列中的存活可能不够长。重要的是，随着支持性护理的水平改善，早发型mld儿童现在可以活到10岁以上，尽管它处于非常低的功能水平下。
[0230]
虽然癫痫发作通常不是早发型群体的主要症状，但它是疾病晚期的特征(gieselmann和krageloh-mann，2010；mahmood等人，2010)。可能要求父母记日记，以记录癫痫发作活动(癫痫发作的开始、频率、长度和类型)，其使得能够评价aav.harsaco是否可以预防或延迟癫痫发作的开始或者降低癫痫发作事件的频率。
[0231]
可以使用先前已用于mld患者中的工具，评估适应行为连同父母和患者生活质量的测量，以显示疾病症状的改善或疾病进展的延迟(martin等人，2013；boucher等人，2015；sessa等人，2016)：
[0232]
·
文兰(vineland)-iii：评价从出生直到成年(0-90岁)跨越五个领域的适应行为：沟通、日常生活技能、社交、运动技能和适应不良行为。从文兰-ii到文兰-iii的改进掺入使得能够更好地了解发育障碍的问题。
[0233]
·
pedsqol和pedsql-is：与严重的儿科疾病的情况一样，该疾病对家庭的负担很重。pediatric quality of life inventory
tm
是经验证的工具，其评价儿童及其父母的生活质量(通过父母代理报告)。它已在健康儿童和青少年中进行验证，并且已用于各种儿科疾病中(iannaccone等人，2009；absoud等人，2011；consolaro和ravelli，2016)。因此，包含pedsql以评估aav.harsaco对患者及其家人生活质量的影响。它可以应用于2岁及以上的儿童的父母，并且因此随着儿童年龄超过5年随访期，可能提供信息。pediatric quality of life inventory
tm
婴儿量表(varni等人，2011)是经验证的由父母完成的模式工具，其设计为专门针对1-24个月的健康和患病婴儿测量健康有关的生活质量。它还为5岁及以上的儿童提供了自我报告的可能性。
[0234]
·
lansky表现指数：测量个体的功能状态，并且提供代表个人进行正常日常活动能力的评分的量表。
[0235]
可以测量如本文所述的raav(例如，aav..harsaco)、载体、组合物或方法对疾病病理状况的作用，以显示疾病症状的改善或疾病进展的延迟，包括髓鞘形成的变化、与髓鞘形成有关的功能结果和潜在的疾病生物标记物。
[0236]
可以检查mld的主要标志，中枢脱髓鞘和外周脱髓鞘，以显示在raav施用之后，疾病症状的改善或疾病进展的延迟。中枢脱髓鞘可以通过白质区域的mri测量进行跟踪，所述白质区域中的变化是疾病状态和进展的指标(gieselmann和krageloh-mann，2010；martin等人，2012；van rappard等人，2015)。通过mri检测到的中枢脱髓鞘与粗大运动功能障碍的程度正相关(groeschel等人，2011)。外周脱髓鞘可以经由关于运动神经(腓深神经、胫神经和尺神经)和感觉神经(腓肠神经和正中神经)的ncv研究间接地进行测量，其也提供了外周神经病变的读出。ncv研究监测指示生物活性髓鞘变化的波动(即，f波和远端潜伏期、幅度、
或者应答的存在或不存在)。
[0237]
除测量总脱髓鞘评分和脑白质萎缩之外，还可以使用质子mrs随着时间过去测量各种脑神经元代谢物，包括naa、mi、cho和lac。存在naa水平与粗大运动功能强烈相关联的证据，其中naa信号强度随着疾病进程推进而降低(kruse等人，1993；dali等人，2010)。另外，质子mrs研究已显示了，在mld疾病演变过程中，naa/肌酐比的降低、以及cho/肌酐比与mi和lac水平的增加(martin等人，2012)。因此，神经元代谢物可以作为显示疾病症状改善或疾病进展延迟的生物标记物进行评估。
[0238]
存在外周神经和csf硫苷脂和溶血硫苷脂累积与电生理参数异常和腓肠神经中的大量有髓纤维丧失相关联的证据(dali等人，2015)。因此，csf(溶血)-硫苷脂水平可以反映pns中的疾病严重程度，并且可以提供标记物来评价疗法对外周神经系统的影响。可以包括csf硫苷脂和溶血硫苷脂水平，以显示疾病症状的改善或疾病进展的延迟。
[0239]
与癫痫发作类似，视力丧失不是早发型mld的常见主要症状，但它的确在疾病的晚期出现(gieselmann和krageloh-mann，2010；van rappard等人，2015)。通过使用vep跟踪视力丧失提供了评价如本文所述的raav延迟或预防视力丧失的能力的机会。vep可以用于客观地测量对视觉刺激的应答，作为中枢视觉损害或丧失的指标。听力损失在疾病进展过程中也很常见，并且听觉异常的早期指标可以经由过baer测试进行测量。
[0240]
内脏组织中的mld后遗症之一涉及胆囊壁中的硫苷脂沉积，导致胆囊壁增厚和息肉，其可能需要手术干预并且可以在超声上显现(rodriguez-waitkus等人，2011；kim等人，2017)。胆囊异常是mld中的常见发现，并且使患者易患胆囊癌(van rappard等人，2016)，并且在mld的所有亚型中发生。
[0241]
在某些实施方案中，可以执行下文列出的测定，以显示疾病症状的改善和/或疾病进展的延迟：
[0242]
血液学、血清化学、凝血、lft；尿分析；hepb/hepc/hiv血清学；血清生物标记物(arsa)；血清和尿中的载体dna；血清抗aavhu68 nab；elispot(衣壳和arsa)；csf收集和评价；lp(以收集csf)；csf细胞学和化学；csf疾病生物标记物(arsa、硫苷脂、溶血硫苷脂)；csf抗aavhu68 nab；csf中的载体dna；体格检查(包括长度和重量)；神经系统检查；生命体征(vital signsd)；ecgd；感觉神经传导研究；gmfc-mld；gmfm；bsid-iiie；wisc-v；文兰-iiie；lansky表现指数；pedsql；pedsql-is；护理人员/父母qol评价；运动里程碑评价；关于癫痫发作日记完成的培训；癫痫日记的审查；影像评价；mri；mrs；ncv测量；和vep。
[0243]
有关缩写在下文列出：
[0244]
aavhu68，腺相关病毒血清型hu68；ae，不良事件；arsa，芳基硫酸酯酶a；baer，脑干听觉诱发反应；bsid-iii，贝利婴幼儿发育量表，第三版；csf，脑脊液；dna，脱氧核糖核酸；ecg，心电图；elispot，酶联免疫斑点；gmfc-mld，异染性脑白质营养不良的粗大运动功能分类；gmfm，粗大运动功能测量；hepb，乙型肝炎；hepc，丙型肝炎；hiv，人免疫缺陷病毒；icm，大池内；lft，肝功能测试；lp，腰椎穿刺；mri，磁共振成像；mrs，磁共振波谱学；nab，中和抗体；ncv，神经传导速度；pedsql/pedql-is，儿童生活质量量表；qol，生活质量；vep，视觉诱发电位；文兰-iii，文兰适应行为量表，第三版；wisc-v，韦氏儿童智力量表，第五版。
[0245]
raav、载体、组合物和方法在施用于cns和pns两者的几天内提供了超生理水平的arsa酶，所述cns和pns两者在mld患者中均受到影响。基于神经元、drg和外周神经轴突细胞
的优良转导的观察，来选择aavhu68衣壳和icm途径。尽管成髓鞘细胞的载体转导是有限的，但交叉校正潜力将允许通过少突胶质细胞的酶摄取。此外，aav载体和arsa酶可以沿着轴突转运，扩大治疗酶在脑内以及到外周的表达。
[0246]
x.用于将药物组合物递送到脑脊液内的仪器和方法
[0247]
在某些实施方案中，经由计算机断层扫描-(ct-)引导的枕下注射到大池内(大池内[icm])，作为单一剂量施用aav.cb7.ci.harsaco.rbg。
[0248]
单基因cns疾病的许多动物模型已使用aav介导的基因转移成功地进行治疗，并且使用第一代aav载体的几项早期人研究证实了载体递送至脑的安全性(janson等人，2002；mandel和burger，2004；kaplitt等人，2007；mittermeyer等人，2012；bartus等人，2014)。然而，这些载体的低效率阻碍了动物模型中的功效转变成临床益处。随着第二代aav载体的出现，基因转移到脑的潜力已得到极大增强。特别地，一些进化枝f分离株，例如aav9，已证实了极其有效的脑转导(gray等人，2013；haurigot等人，2013；hinderer等人，2014；bell等人，2015)。使用这些更有效的载体，基因疗法已显示了治疗各种神经性障碍的极大增强的潜力，并且利用第二代载体的几个计划已进展到临床(haurigot等人，2013；hinderer等人，2014；bell等人，2015；gurda等人，2016；hinderer等人，2016)。
[0249]
cns基因转移的早期研究不仅受到第一代aav载体的低基因转移效率的挑战，而且还受到可用递送方法的限制。大多数早期的非临床研究和临床研究利用直接载体注射到脑或脊髓的实质内(vite等人，2005；worgall等人，2008；colle等人，2010；ellinwood等人，2011；tardieu等人，2014)。虽然这种方法在注射部位附近产生了稳固转导，但将这种方法平移到影响cns各处的细胞的疾病是困难的，因为需要大量的载体注射来实现广泛的转基因递送。cns基因转移的另外障碍是发现实质内载体注射可以触发在注射部位处的炎症，其可以促进针对转基因产物的适应性免疫应答(worgall等人，2008；colle等人，2010；ellinwood等人，2011；ciesielska等人，2013)。已开发了两种替代的载体递送方法，以更安全且有效地靶向cns的大区域。
[0250]
第一种基于以下发现：一些aav载体，包括aav9，可以在iv递送后转导cns内的细胞(foust等人，2009)。然而，iv载体递送具有两个关键局限性。首先，载体渗透到cns内的低效率，需要非常大的载体剂量来达到治疗水平的转基因表达，增加了全身毒性的风险，并且潜在地需要对于许多患者群体可能无法制造的载体数量(gray等人，2011；hinderer等人，2014；gurda等人，2016)。其次，在iv载体递送后向cns的基因转移受到预先存在的针对载体衣壳的nab的显著限制(gray等人，2011)。鉴于aav nab在人中的高流行率，这留下了无法成为iv aav治疗的候选者的显著患者群体。为了规避iv aav用于靶向cns的局限性，已开发了it载体递送作为替代方法。使用csf作为载体传播的媒介物，it roa具有用单次微创注射，在cns和pns各处实现转基因递送的潜力。动物研究已证实了，通过避免跨越血脑屏障的需要，it递送导致基本上更有效的cns基因转移，伴随比iv方法所需的低得多的载体剂量(gray等人，2011；hinderer等人，2014)。由于抗体以极低水平存在于csf中，因此it载体递送不受预先存在的针对aav衣壳的nab的影响，使得这种方法适用于更广泛的患者群体(haurigot等人，2013)。it aav递送可以使用用于csf接近的各种途径来执行。腰椎穿刺(lp)是用于接近csf的最常见方法，并且因此作为用于nhp中的aav施用的途径进行评估。与在大池的水平下更优良的载体注射相比，发现经由lp将aav9载体递送到csf内，在转导脑和
脊髓的细胞方面的效率是至多1/10(hinderer等人，2014)。
[0251]
在nhp中用单次icm注射实现的优良的脑转导，导致选择这种roa用于aav.cb7.ci.harsaco.rbg的临床研究。由于脑干或附近血管损伤的罕见病例，曾经的常见程序，icm注射(也称为枕下穿刺)在预成像时代最终被lp取代(saunders和riordan，1929)。当今，该程序可以在实时ct引导下执行，允许在针插入期间显现关键结构，例如髓质、椎动脉和小脑后下动脉(pomerantz等人，2005；hinderer等人，2014)。
[0252]
在一个方面，本文提供的载体可以经由该节段中提供且在wo2018/160582中描述的方法和/或装置鞘内施用，所述专利引入本文作为参考。可替代地，可以选择其它装置和方法。
[0253]
在某些实施方案中，该方法包括经由脊椎针在ct引导的枕下注射到患者的大池内的步骤。如本文使用的，术语计算机断层扫描(ct)指其中身体结构的三维图像由计算机根据沿着轴制备的一系列平面横截面图像构建的射线照相术。
[0254]
在治疗当天，制备适当浓度的raavhu68.harsaco。含有5.6ml适当浓度的raavhu68.harsaco的注射器递送到操作室。下述人员出场用于研究药物施用：执行程序的介入医师；麻醉师和呼吸技术员；护士和医师助理；ct(或手术室)技术员；现场研究协调员。在药物施用之前，执行腰椎穿刺以去除预定体积的csf，然后鞘内注射碘造影剂(it)，以帮助显现大池的相关解剖结构。作为鞘内造影剂的替代方案，可以在针插入之前或期间施用静脉内(iv)造影剂。使用iv或it造影剂的决定由介入医师自行判断。将受试者麻醉、插管并放置在手术台上。使用无菌技术准备且覆盖注射部位。在荧光透视引导下，将脊椎针(22-25g)推进到大池内。较大的导引针可以用于帮助针放置。在针放置确认后，将延长套件(extension set)附接到脊椎针，并允许充满csf。由介入医师自行判断，可以将含有造影材料的注射器连接到延长套件，并且注射少量以确认针放置在大池中。在通过ct引导+/-造影剂注射确认针放置后，将含有5.6ml raavhu68.harsaco的注射器连接到延长套件。注射器内容物经过1-2分钟缓慢注入，递送5.0ml的体积。从受试者中缓慢取下针。
[0255]
在一个实施方案中，剂量可以按脑质量缩放，其提供了csf区室大小的近似值。在一个进一步的实施方案中，剂量转换基于对于成年小鼠为0.4g，对于幼年恒河猴为90g，且对于4-18个月的儿童为800g的脑质量。下表提供了关于小鼠med研究、nhp毒理学研究的说明性剂量和等价的人剂量。
[0256][0257]
在某些实施方案中，raavhu68.harsaco载体以单一剂量施用于受试者。在某些实施方案中，可能需要多个剂量(例如2个剂量)。例如，对于6个月以下的婴儿，可能需要间隔数天、数周或数月递送的多个剂量。
[0258]
在某些实施方案中，raavhu68.harsaco载体的单一剂量为约1x109gc至约
3x10
11
gc。在某些实施方案中，raavhu68.harsa的剂量为1x10
10
gc/脑质量至3.33x10
11
gc/脑质量。在其它实施方案中，可以选择不同的剂量。
[0259]
组合物可以以剂量单位进行配制，以含有在约1x109个基因组拷贝(gc)至约5x10
13
gc范围内的aav量(以治疗平均体重为70kg的受试者)。在一个实施方案中，执行脊椎穿刺，其中去除约15ml(或更少)至约40ml的csf，并且其中将载体与csf混合和/或悬浮于相容的载体中，并递送至受试者。在一个实例中，载体浓度为约3x10
13
gc，但其它量如约1x109gc、约5x109gc、约1x10
10
gc、约5x10
10
gc、约1x10
11
gc、约5x10
11
gc、约1x10
12
gc、约5x10
12
gc或约1.0x10
13
gc。
[0260]
可以用本文提供的raavhu68.harsaco组合物递送协同疗法。如本技术中较早描述的协同疗法引入本文作为参考。
[0261]
词语“包含(comprise)”、“包含(comprises)”和“包含(comprising)”应包容性地而非排他性地加以解释。词语“由
……
组成(consist)”、“由
……
组成(consisting)”及其变体应排他性地而非包容性地加以解释。虽然说明书中的各个实施方案使用“包含”语言呈现，但在其它情况下，有关实施方案也预期使用“由
……
组成”或“基本上由
……
组成”语言加以解释且描述。
[0262]
术语“表达”在本文中以其最广泛的含义使用，并且包含rna或rna和蛋白质的产生。关于rna，术语“表达”或“翻译”特别涉及肽或蛋白质的产生。表达可以是瞬时的或可以是稳定的。
[0263]
如本文使用的，“表达盒”指这样的核酸分子，其包含编码序列、启动子，并且可以包括关于其的其它调控序列。在某些实施方案中，载体基因组可以含有两个或更多个表达盒。在其它实施方案中，术语“转基因”可以与“表达盒”互换使用。通常，用于生成病毒载体的此类表达盒含有本文所述的基因产物的编码序列，其侧翼为病毒基因组的包装信号和其它表达控制序列例如本文所述的那些表达控制序列。
[0264]
当就蛋白质或核酸而言使用时，术语“异源的”指示蛋白质或核酸包含在自然界中未发现彼此处于相同关系的两个或更多个序列或子序列。例如，核酸通常是重组产生的，具有来自无关基因的两个或更多个序列，其排列为制备新的功能性核酸。例如，在一个实施方案中，核酸具有来自一种基因的启动子，其排列为指导来自不同基因的编码序列的表达。因此，就编码序列而言，启动子是异源的。
[0265]
如本文使用的，“有效量”指raav组合物的量，其在靶细胞中递送且表达一定量的来自载体基因组的基因产物。有效量可以基于动物模型而不是人患者进行确定。合适的鼠或nhp模型的实例在本文中进行描述。
[0266]
在本发明的上下文中，术语“翻译”涉及在核糖体处的过程，其中mrna链控制氨基酸序列的组装，以生成蛋白质或肽。
[0267]
应注意，术语“一个”或“一种”指一个或多个/一种或多种，例如“增强子”，应理解为代表一种或多种增强子。因此，术语“一个”(或“一种”)、“一个或多个/一种或多种”和“至少一个/种”在本文中可互换使用。
[0268]
如上所述，除非另有说明，否则当用于修饰数值时，术语“约”意指
±
10％的变动。
[0269]
除非在本说明书中另有定义，否则本文使用的技术术语和科学术语具有与本领域普通技术人员参考出版的教科书所通常理解的相同的含义，所述教科书为本领域技术人员
提供了本技术中使用的许多术语的一般指导。
[0270]
实施例
[0271]
下述实施例仅是说明性的，而不预期限制本发明。
[0272]
将载体aavhu68.cb7.ci.harsaco.rbg(也称为aav.cb7.ci.harsaco.rbg或aavhu68.harsaco或aav.harsaco)递送到csf内，以实现治疗性arsa表达水平并拯救mld的几种生物标记物。
[0273]
在健康的野生型小鼠中执行了aav.cb7.ci.harsaco.rbg的几项概念验证性药理学研究。在健康小鼠和非人灵长类动物(nhp)中的非临床研究已证实了，aav.cb7.ci.harsaco.rbg的csf递送导致cns、pns和csf中的arsa过表达(实施例1至4)。实施例2证实了aav.cb7.ci.harsaco.rbg的侧脑室内(icv)施用导致健康野生型小鼠的脑中的酶促活性的arsa表达。实施例3证实了所观察到的arsa的表达部分起因于皮质神经元和少突胶质细胞两者的转导和/或交叉校正，所述皮质神经元和少突胶质细胞是mld患者中受arsa缺陷影响的两种主要细胞类型。在大小相关的动物食蟹猴(实施例4)中也已获得了潜在治疗水平的arsa，并且在体内和/或体外mld疾病模型中进行了功效研究。还在健康的成年食蟹猴中执行了测试剂量范围的另外实验，其证实了尽管抗人arsa(harsa)抗体的诱导，但脑、脊髓和drg的神经元显示了在aav.cb7.ci.harsaco.rbg的icm施用后至少6周的稳固arsa表达(实施例4)。在治疗后2周还观察到基线csf arsa活性水平的加倍(实施例4)，提示了在早发型mld患者中实现治疗性表达水平的arsa的可能性。
[0274]
还执行实验以便评价aav.cb7.ci.harsaco.rbg在新的mld小鼠模型中的药理学和毒理学(实验5)，用于med研究中的后续使用(实施例6)。体外模型处于调查中，以测试aav.cb7.ci.harsaco.rbg用于减少mld患者衍生的细胞系中的疾病生物标记物的功效(实施例7)。进一步地，实施例8提供了aav.cb7.ci.harsaco.rbg在幼年恒河猴中的药理学和毒理学研究。实施例10显示了aav.cb7.ci.harsaco.rbg在儿科mld群体中的试验。
[0275]
实施例1
–
aav.harsaco载体
[0276]
下表中说明了aav.harsaco的组分。
[0277][0278]
载体由含有人arsa的编码序列(seq id no:1和seq id no:3)的顺式质粒进行构建，所述编码序列由具有侧翼为aav2反向末端重复的巨细胞病毒增强子的鸡β肌动蛋白启动子(cb7；seq id no:16)表达。
[0279]
载体通过贴壁hek293细胞的三重转染在aav血清型hu68衣壳(wo 2018/160582)中
进行包装，并且如lock，m.等人，rapid，simple，and versatile manufacturing of recombinant adeno-associated viral vectors at scale.human gene therapy 21，1259-1271(2010)中先前所述的，通过碘克沙醇梯度离心进行纯化。
[0280]
更特别地，aav.cb7.ci.harsaco.rbg通过用以下对hek293工作细胞库(wcb)细胞的三重质粒转染而产生：aav顺式质粒(penn.aav.cb7.ci.harsaco.rbg.kanr)、编码aav2 rep和aavhu68 cap基因的aav反式质粒(paav2/hu68.kanr)和辅助腺病毒质粒(padδf6.kanr)。aav.cb7.ci.harsaco.rbg包装的载体基因组的大小为3883个碱基(seq id no:5的nt 1至nt 3883)。
[0281]
顺式质粒(图2)含有下述载体基因组序列元件：
[0282]
反向末端重复(itr)：itr是衍生自aav2的相同的反向互补序列(130个碱基对[bp]，genbank：nc_001401)，其侧接载体基因组的所有组分。当aav和腺病毒辅助功能反式提供时，itr既充当载体dna复制的起点，又充当载体基因组的包装信号。因此，itr序列代表载体基因组复制和包装所需的唯一顺式序列。
[0283]
人巨细胞病毒立即早期增强子(cmv ie)：从人衍生的巨细胞病毒获得的这种增强子序列(382bp，genbank:k03104.1)增加下游转基因的表达。
[0284]
鸡β肌动蛋白(ba)启动子(seq id no:18)：选择这种遍在启动子(281bp，genbank：x00182.1)来驱动任何细胞类型中的转基因表达。
[0285]
嵌合内含子(ci)：杂合内含子由鸡ba剪接供体(973bp，genbank：x00182.1)和兔β珠蛋白剪接受体元件组成。内含子被转录，但通过剪接从成熟的信使核糖核酸(mrna)中去除，将其任一侧上的序列结合在一起。表达盒中内含子的存在已显示了促进mrna从核到细胞质的转运，因此增强了用于翻译的mrna的稳态水平累积。这是预期增加基因表达水平的基因载体中的共同特征。
[0286]
编码序列：人arsa基因(seq id no:1或seq id no:3)的改造的互补脱氧核糖核酸(cdna)编码芳基硫酸酯酶a，其为溶酶体酶，负责硫酸化的半乳糖神经鞘脂，半乳糖神经酰胺-3-o-硫酸酯和半乳糖鞘氨醇-3-o-硫酸酯的脱硫酸酯(1527bp；509个氨基酸[aa]，genbank：np_000478.3)。
[0287]
兔β珠蛋白多聚腺苷酸化信号(rbgpolya)：rbgpolya信号(127bp，genbank：v00882.1)顺式促进转基因mrna的有效多聚腺苷酸化。该元件充当转录终止的信号，一种在新生转录物的3’端处的特异性切割事件和长多聚腺苷酸尾的添加。
[0288]
质粒的所有组成部分都已通过直接测序进行验证。
[0289]
aav2/hu68反式质粒(图3)是paav2/hu68.kanr。它的长度为8030bp，并且编码四种野生型aav2复制酶(rep)蛋白，其是aav载体基因组的复制和包装所需的。paav2/hu68.kanr质粒还编码三种野生型aavhu68病毒粒子蛋白衣壳(cap)蛋白，其组装成aav血清型hu68的病毒粒子壳，以容纳aav载体基因组。新型aavhu68序列得自人心脏组织dna。
[0290]
为了产生paav2/hu68.kanr反式质粒，去除来自质粒paav2/9n的aav9 cap基因(其编码衍生自pbluescript ks载体的质粒主链上的野生型aav2 rep和aav9 cap基因)，并且替换为aavhu68 cap基因。氨苄青霉素抗性(ampr)基因也替换为卡那霉素抗性(kanr)基因，产生paav2/hu68.kanr。这种克隆策略将aav p5启动子序列(其通常驱动rep表达)从rep的5’端重新定位到cap的3’端，在rep的上游留下截短的p5启动子。这种截短的启动子作用于
下调rep的表达，并且因而使载体生产达到最大。质粒的所有组成部分都已通过直接测序进行验证。
[0291]
构建了质粒paddeltaf6(kanr)(图4)，并且大小为15,770bp。该质粒含有对于aav复制重要的腺病毒基因组区域；即e2a、e4和va rna(腺病毒e1功能由hek293细胞提供)。然而，该质粒不含其它腺病毒复制或结构基因。该质粒不含对于复制关键的顺式元件，例如腺病毒itr；因此，预计不生成感染性腺病毒。该质粒衍生自ad5的e1、e3缺失的分子克隆(pbhg10，基于pbr322的质粒)。将缺失引入ad5内，以消除不必要的腺病毒基因的表达，并且将腺病毒dna的量从32kb减少到12kb(图5a)。最后，氨苄青霉素抗性基因由卡那霉素抗性基因替换，以产生padeltaf6(kanr)(图5b)。保留在该质粒中的e2、e4和va腺病毒基因，连同存在于hek293细胞中的e1一起，对于aav载体生产是必要的。
[0292]
aav.cb7.ci.harsaco.rbg通过hek293细胞的瞬时转染随后为下游纯化进行制造。制造工艺流程图解显示于图6和图7中。进入产物制备内的主要试剂在图解的左侧上指示，并且工艺中的质量评价在图解的右侧上描绘。还提供了每个生产和纯化步骤的描述。除非另有说明，产物制造遵循单元操作的线性流程，并且利用一次性的封闭的生物处理系统，除非另有说明。涉及细胞培养的生产工艺的所有步骤，从细胞接种到收获物收集，都使用无菌、一次性使用的一次性管道和袋组件无菌地执行。使用corning器具(t型烧瓶、cellstacks[cs-10]和/或hyperstacks[hs-36])来扩增细胞。细胞在生物反应器中进行转染，并且所有开放操作都在iso 5级环境中的ii级生物安全柜(bsc)中执行。纯化过程尽可能地在封闭系统中执行。
[0293]
开发了用于aav.cb7.ci.harsaco.rbg的制造工艺，并且涉及用质粒dna瞬时转染人胚胎肾293(hek293)细胞。生产中使用的hek293工作细胞库(wcb)如fda和国际协调委员会(international council for harmonisation)(ich)指南中详述的进行测试且认证。为了支持临床开发，原料药(bds)的单个分批或多个分批在生物反应器中由聚乙烯亚胺(pei-)介导的hek293细胞的三重转染而产生。当可能时，收获的aav材料在一次性的封闭生物处理系统中，通过澄清、切向流过滤(tff)、亲和层析和阴离子交换层析序贯地进行纯化。产物在鞘内最终制剂缓冲液(itffb；含有0.001％pluronic f-68的人工csf)中进行配制。将一个或多个bds分批冷冻，随后解冻，必要时合并，调整至靶浓度，并且通过0.22μm过滤器进行无菌过滤，然后填充小瓶。
[0294]
使用两种不同的生物反应器：小规模或中试规模的生物反应器和大规模生物反应器。小规模生物反应器是线性缩放的生物反应器，具有就大规模生物反应器而言相等的床高度用于细胞生长。小规模生物反应器和大规模生物反应器的使用允许具有最低限度的工艺和材料影响的可缩放制造。大规模生物反应器和/或小规模生物反应器用于毒理学批次的生产。大规模生物反应器用于生产待用于临床试验和许可的良好生产规范(gmp)原料药(ds)批次。必要时，大规模gmp生产分批大小用计划且合并的多个分批生成，以满足药物产品(dp)供应所需的载体量。当产物从ind允许的非临床研究转向临床开发和通过许可时，用于aav.cb7.ci.harsaco.rbg的制造工艺在很大程度上保持不变。假设为影响产物质量的工艺参数并不进行修改。大多数关键来源材料保持相同，包括hek293 wcb，尽管用于gmp制造的pei和质粒dna是gmp-source
tm
或indready
tm
级别材料。
[0295]
随着用大规模生物反应器的放大制造工艺得到实施，并且基于当前生物反应器平
台的综合制造经验，通过可比性测试解决与工艺中的变化有关的任何潜在影响，以确保不存在产物的身份、纯度、效力和安全性变化。为了比较用更新的程序或新材料制造的新批次与先前批次而进行的可比性测试，由分析证书(coa)中包括的测试子集组成。新批次符合先前制定的规格，并且可比性评价(下表)中包括的任何测试使用类似的方法和相同的测试场所(如果可能的话)来完成。
[0296]
表.可比性评价
[0297][0298]a通过auc的颗粒含量分析在毒理学批次制造和产物建立制造运行完成后进行确定。
[0299]
auc，分析超速离心；gc，基因组拷贝；itr，反向末端重复；iu，感染单位；ms，质谱法；ngs，下一代测序；qpcr，定量聚合酶链反应；rcaav，有复制能力的腺相关病毒；sds-page，十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳；tbd，待确定；tcid
50
，50％组织培养物感染剂量；usp，美国药典。
[0300]
细胞培养和收获制造工艺包括四个主要制造步骤：(a)细胞接种和扩增，(b)瞬时转染，(c)载体收获，和(d)载体澄清。这些工艺设置在概述工艺图解(图6)中进行描绘。下文提供了这些工艺各自的一般描述。
[0301]
(a)细胞接种和扩增
[0302]
充分表征的hek293细胞系用于生产工艺。已产生了wcb。用于载体生产的细胞培养物从一个或两个解冻的wcb小瓶开始，并且按照主分批记录(mbr)文件进行扩增。细胞使用组织培养塑料进行扩增，以允许生成足够的细胞团块用于在大规模生物反应器器皿表面积中的接种，用于每个ds分批的载体生产。细胞在由达尔贝科改良伊格尔培养基(dmem)组成的培养基中进行培养，所述dmem补充有10％γ照射的新西兰来源的胎牛血清(fbs)。细胞是贴壁依赖性的，并且细胞解离使用tryple
tm
select(不含动物产品的细胞解离试剂)完成。细胞接种使用无菌、一次性使用的一次性生物工艺袋和管道套件来实现。反应器是温度、ph和溶解氧(do-)控制的。
[0303]
(b)瞬时转染
[0304]
在大约4天的生长(dmem培养基+10％fbs)之后，将细胞培养基替换为新鲜的无血清dmem培养基，并且使用基于pei的转染方法，用三种生产质粒转染细胞。生产工艺中使用的所有质粒都在如上文所述的cmo质量系统的背景下生产，伴随利用基础设施的控制，以确保可追溯性、文件对照和材料隔离。在bsc中制备了足够的质粒dna转染复合物，以转染高达
500m2(每个bds分批)。最初，制备dna/pei混合物，其含有与gmp级别pei(peipro hq，polyplus transfection sa)以最佳比的顺式(载体基因组)质粒、反式(rep和cap基因)质粒和辅助质粒。在小规模优化研究中，该质粒比确定为对于aav生产最佳的。在充分混合后，允许溶液在室温下静置最多25分钟，然后加入无血清培养基中，以猝灭反应，并且最后加入生物反应器中。反应器是温度和do控制的，并且使细胞温育5天。
[0305]
(c)载体收获
[0306]
使用一次性生物工艺袋，通过将培养基无菌泵出生物反应器，从生物反应器中收集转染的细胞和培养基。在收获之后，加入洗涤剂、核酸内切酶和mgcl2(核酸内切酶的辅因子)，以释放载体并消化未包装的dna。产物(在一次性的生物工艺袋中)在温度控制的一次性使用的混合器中在37℃下温育2小时，以提供足够的时间用于酶促消化收获物中作为转染程序的结果而存在的残留细胞和质粒dna。执行该步骤，以使最终载体dp中的残留dna量降到最低。在温育之后，将nacl加入至500mm的最终浓度，以帮助在过滤和下游tff过程中的产物回收。
[0307]
(d)载体澄清
[0308]
使用与无菌、封闭的管道和袋套件(其由蠕动泵驱动)串联连接的预过滤器和深度过滤器胶囊(1.2/0.22μm)，从产物中去除细胞和细胞碎片。澄清确保保护下游过滤器和层析柱免于结垢，并且生物负荷减少过滤确保在过滤器串结束时，在下游纯化之前去除在上游生产过程期间潜在地引入的任何生物负荷。
[0309]
纯化过程包括四个主要制造步骤：(a)通过tff的浓缩和缓冲液交换，(b)亲和层析，(c)阴离子交换层析，以及(d)通过tff的浓缩和缓冲液交换。这些工艺步骤在概述工艺图解(图6)中进行描绘。下文提供了这些工艺各自的一般描述。
[0310]
(a)大规模切向流过滤
[0311]
通过tff使用定制的无菌、封闭的生物处理管道、袋和膜套件，来实现澄清产物的体积减少(20倍)。tff的原理是在压力下使溶液与适当孔隙率(100kda)的膜平行流动。压力差驱动较小尺寸的分子通过膜并有效地进入废物流内，同时保留比膜孔大的分子。通过使溶液再循环，平行流扫过膜表面，防止膜孔结垢和通过与膜结合的产物损失。通过选择适当的膜孔径和表面积，可以快速减少液体样品的体积，同时保留且浓缩所需的分子。tff应用中的渗滤涉及将新鲜缓冲液加入再循环样品中，其速率与液体通过膜并进入废物流相同。随着渗滤体积的增加，从再循环样品中去除的小分子量也增加。这种渗滤导致澄清产物的适度纯化，而且也实现了与随后的亲和柱层析步骤相容的缓冲液交换。相应地，利用100kda的pes(聚醚砜)膜用于浓缩，其然后用最少四个渗滤体积(diavolume)的缓冲液进行渗滤，所述缓冲液由20mm tris ph 7.5和400mm nacl组成。然后用1.2/0.22μm深度过滤器胶囊进一步澄清渗滤的产物，以去除任何沉淀的材料。
[0312]
(b)亲和层析
[0313]
将渗滤的产物应用于poros
tm capture-select
tm aav亲和树脂(life technologies)，其有效地捕获aavhu68血清型。在这些离子条件下，显著百分比的残留细胞dna和蛋白质流过柱，而aav颗粒被有效地捕获。在应用之后，用5体积的低盐核酸内切酶溶液(250u/ml核酸内切酶、20mm tris ph 7.5、40mm nacl和1.5mm mgcl2)处理柱，以去除任何剩余的宿主细胞和质粒核酸。洗涤柱以去除另外的进料杂质，随后为低ph阶梯洗脱
(400mm nacl，20mm柠檬酸钠，ph 2.5)，其立即通过收集到1/10体积的中和缓冲液(200mm双-三丙烷，ph 10.2)内进行中和。
[0314]
(c)阴离子交换层析
[0315]
为了实现工艺中杂质(包括空aav颗粒)的进一步减少，将poros-aav洗脱池稀释50倍(20mm双-三丙烷，0.001％pluronic f-68，ph 10.2)，以减少离子强度并且使得能够与cimultus
tm qa整体矩阵(bia separations)结合。在低盐洗涤之后，使用60倍柱体积的nacl线性盐梯度(10
–
180mm nacl)来洗脱载体产物。这种浅盐梯度有效地将不含载体基因组的衣壳颗粒(空颗粒)与含有载体基因组的颗粒(满颗粒)分开，并且导致富含满颗粒的制剂。收集并中和满颗粒峰洗脱物。评价峰面积并且与先前的数据进行比较，用于确定近似的载体产率。
[0316]
(d)通过中空纤维切向流过滤的浓缩和缓冲液交换
[0317]
合并的阴离子交换中间体使用tff进行浓缩和缓冲液交换。在该步骤中，使用了100kda膜中空纤维tff膜。在该步骤期间，使产物达到靶浓度，然后缓冲液交换到itffb(具有0.001％pluronic f-68的人工csf)内。
[0318]
取出样品用于测试(图7)。将原料药(bds)无菌过滤(0.22μm)，贮存于无菌容器中，并且在隔离位置中在≤
–
60℃下冷冻，直至释放用于最终填充。
[0319]
将冷冻的原料药解冻，合并，且使用最终制剂缓冲液(ffb)调整至靶浓度(经由tff的稀释或浓缩步骤)。产物通过0.22μm过滤器进行终末过滤，并且填充到具有压接密封塞的无菌west pharmaceutical’s crystal zenith(环状烯烃聚合物)小瓶内。将标记的小瓶贮存于≤
–
60℃下。
[0320]
通过将来自转化的stbl2
tm
大肠杆菌细胞的1l过夜培养物的1ml与等体积的无菌50％甘油混合，来制备顺式、反式和辅助质粒的细菌主细胞库(bmcb)甘油原液。从混合物中制备bmcb甘油原液的两个0.5ml等分试样/构建体，并且在
–
80℃下贮存于nalgene低温小瓶中。为了验证bmcb甘油原液，使扩增的质粒dna经受内部结构分析，其涉及限制性酶消化随后为凝胶电泳，以及在qiagen通过桑格测序的完全质粒序列分析。为了制备用于运送到质粒dna制造商的细菌工作细胞库(bwcb)甘油原液等分试样，从bmcb甘油原液接种3ml培养物并生长过夜。接下来，如上所述，使用1ml过夜培养物来制备bwcb甘油原液等分试样。通过对从剩余的2ml过夜细菌培养物中提取的dna的上述结构分析，来验证新的bwcb甘油原液等分试样。从质粒dna制造商收到后，将bwcb甘油原液贮存于
–
80℃下的计划特异性位置中。通过刮取冷冻的bwcb甘油原液来接种生产培养物。
[0321]
用作良好生产规范(gmp)载体制造的来源材料的质粒在作为gmp设施不合格的设施中进行生产；然而，质粒以这样的方式进行生产，所述方式设计为满足当前良好生产规范(cgmp)中间体的要求。质粒生产在专用部件和专用套房中进行。进行生产程序和监督，以确保具有高纯度dna的一致质量产物，其符合如下表中捕获的严格释放标准。质粒生产中使用的组分是“无动物的”(基于来自组分产品的每个供应商的coa)，并且该工艺中使用的所有部件(发酵瓶、容器、膜、树脂、柱、管道以及与质粒接触的任何部件)专用于单一质粒，并且经认证不含tse-/bse。获得所利用的树脂、柱和组分用于单一质粒的制造中的排他性使用。质粒的发酵、裂解和纯化在标有指定质粒名称的专用房间内发生。在这些房间中不同时处理其它质粒。在每次质粒生产活动之间清洁房间和设备。在用于重组载体的生产
之前，每种制造的质粒都使用下一代测序(ngs)进行完全测序以排除由其它质粒的污染，加上关于无菌性和支原体存在的测试。
[0322]
用于药理学/毒理学的载体生产中使用的所有质粒dna都通过puresyn’s premium-research ready program制备。puresyn’spremium-research ready program使用清洁和隔离程序以及一次性使用的组分进行生产，然而，它们并非在专用房间内进行生产。
[0323]
表.用于质粒生产的释放规格
[0324][0325]
hek293细胞最初通过用剪切的腺病毒5型(ad5)dna转化hek细胞来生成(graham等人，1977)。这些细胞表达raav生产所需的e1a和e1b基因产物。hek293细胞是高度可转染的，在质粒dna转染时产生高水平的raav。
[0326]
载体基因组身份：dna测序
[0327]
aav载体(2.00x10
11
gc)用baseline zero核酸内切酶和plasmid safe dna酶进行处理，以消除环境中的未封装dna，然后在95℃下在1x磷酸盐缓冲盐水(pbs)和0.5％十二烷基硫酸钠(sds)中温育10分钟，以使载体基因组变性。变性的载体基因组随后通过在热循环仪中以0.6℃/分钟的速率将反应混合物缓慢冷却至24℃进行退火，使用qiaquick pcr purification kit(qiagen)进行提纯，并且在covaris ultrasonicator上剪切至500bp的平均大小。用high sensitivity dna试剂盒(agilent)，在2100bioanalyzer上评估dna剪切。根据制造商的方案，使用nebnextultraii文库试剂盒，将剪切的dna制备成ngs文库，进行大小选择，并且通过agencourt ampure xp珠(beckman coulter)进行提纯。然后在bioanalyzer上再次分析各个ngs文库的片段大小分布，并且在以等摩尔浓度合并之前，通过3.0fluorometer进行定量。根据illumina’s miseq system denature和dilute libraries guide，通过3.0fluorometer测量最终合并文库的浓度，变性并稀释至
8pm。phix对照在最终文库中以10％掺料。使用illumina miseq nano reagent kit v2(250bp配对端)，在miseq测序仪上执行测序。如上所述，使用ngs比对方法执行数据分析。
[0328]
测序读数由miseq计算机进行自动解复用和衔接子修剪。关于每种质粒的修剪读数与相应的参考序列进行比对，并且使用bbtools生物信息学软件套件(sourceforge.net/projects/bbmap)调用序列变体。另外，bbmap(jgi.doe.gov/data-and-tools/bbtools/)用于生成vcf和bam文件。vcf文件由自定义unix脚本进一步解析，以生成简化的制表符分隔表(仅保留chrom、ref、alt、qual、type、depth、af、raf、sb、dp4字段)。bam文件在igv integrated genomic viewer软件(software.broadinstitute.org/software/igv/)中进行目视检查，以确保正确的ngs比对。与ngs比对方法并行，进行从头组装，以使用novoplasty(github.com/ndierckx/novoplasty)构建长的环化序列。从头序列针对原始载体基因组参考序列进行比对，以表征比对方法中可能忽略的大序列排列。
[0329]
载体衣壳身份：vp1的aav衣壳质谱法
[0330]
基于aav衣壳蛋白的肽的分析，使用在university of pennsylvania and bioproximity，llc开发的新测定，实现了dp的aavhu68血清型的确认。该方法涉及vp的胰蛋白酶消化，随后为在q-exactive orbitrap质谱仪上的串联质谱法(ms)表征，以对衣壳蛋白肽进行测序。来自串联质谱测序和靶向的ms方法的谱文库用于测定可以独特地鉴定特异性aav病毒颗粒血清型的签名肽(signature peptide)。对于八种血清型(aavhu68、aav1、aav2、aav6、aav8、aav9、aavrh10和aavhu37)特异性的签名肽库，针对通过测试物品的消化产生的串联质谱进行筛选。对于阳性鉴定，仅检测到来自单一血清型的签名肽。
[0331]
基因组拷贝滴度
[0332]
已开发了基于ddpcr的技术，用于确定aav载体的gc滴度(lock等人，2014)。参考标准在试运行期间生成，并且用于证明测定合格。该方法是实用的，报告与qpcr等价或更好的滴度，并且不需要质粒标准曲线。所利用的测定涉及用dna酶i的消化，随后为ddpcr分析，以测量封装的载体gc。dna检测使用靶向polya区域的序列特异性引物组合以及与该相同区域杂交的加上荧光标签的探针来完成。许多标准、验证样品和对照(用于背景和dna污染)已引入该测定内。该测定使用试点参考标准是合格的。测定通过建立且定义测定参数证明是合格的，所述测定参数包括灵敏度、检测限(lod)、合格范围、以及测定内和测定间精确度。建立内部aavhu68参考批次并用于执行合格研究。
[0333]
感染单位滴度
[0334]
感染单位(iu)测定用于确定raav载体在rc32细胞(表达rep2的hela细胞)中的生产力摄取和复制。已采用类似于先前公开的96孔终点形式。简言之，rc32细胞通过raav bds的连续稀释物和ad5的一致稀释物进行共感染，其中在raav的每个稀释度下具有12个重复。在感染后72小时，将细胞裂解，并且执行qpcr，以检测超过输入的raav载体扩增。执行终点稀释50％组织培养物感染剂量(tcid
50
)计算(spearman-karber)，以确定表示为iu/ml的复制滴度。由于“感染性”值取决于每个粒子与细胞的接触、受体结合、内化、转运至核和基因组复制，因此它们受测定几何形状以及所使用的细胞系中适当受体和结合后途径的存在的影响。受体和结合后途径通常并不在永生化的细胞系中维持，并且因此感染性测定滴度不是存在的“感染性”颗粒数目的绝对量度。然而，衣壳化gc/“感染性单位”的比率(描述为gc/iu比)可以用作批次间的产物一致性的量度。
[0335]
颗粒含量分析
[0336]
如在分析超速离心机(auc)中测量的，沉降速度可以检测聚集体、其它次要组分，以及基于其不同的沉降系数，提供不同颗粒种类的相对量的良好定量。这是基于长度和时间的基本单位的绝对方法，不需要标准分子作为参考。用12mm光程长度的双通道木炭-环氧树脂中心件(charcoal-epon centerpieces)，将载体样品加载到细胞内。将所供应的稀释缓冲液加载到每个细胞的参考通道内。然后将加载的细胞放入an-60ti分析转子内，并且加载到配备有吸光度和ri检测器两者的beckman-coulter proteomelab xl-i分析超速离心机内。在20℃下的完全温度平衡后，使转子达到12,000转/分钟(rpm)的最终运行速度。大约每3分钟记录在280nm扫描处的吸光度，共大约5.5小时(每个样品总共110次扫描)。原始数据使用c(s)方法进行分析，并且在分析程序sedfit中实现。将所得的大小分布进行绘图并且对峰进行整合。与每个峰相关的百分比值代表所有峰下总面积的峰面积分数，并且基于在280nm处生成的原始数据。许多实验室使用这些值来计算满:空比。然而，因为空颗粒和满颗粒在该波长具有不同的消光系数，所以可以相应地调整原始数据。在消光系数调整之前和之后的空颗粒和满单体峰值的比用于确定满:空比，并且记录这两个比值。
[0337]
宿主细胞dna
[0338]
qpcr测定用于检测残留的hek293dna。在用“非相关dna”掺料后，从大约1ml产物中提取总dna(非相关、载体和残留基因组dna)。使用靶向18s rdna的qpcr对hcdna进行定量。基于所掺杂的非相关dna的回收率，对检测到的dna数量进行标准化。测试了三种不同的扩增子大小，以建立残留hcdna的大小谱。
[0339]
宿主细胞蛋白
[0340]
执行elisa以测量污染性宿主hek293细胞蛋白的水平。根据由供应商提供的说明书，使用the cygnus technologies hek293 host cell proteins2nd generation elisa试剂盒。
[0341]
具有复制能力的aav测定
[0342]
就具有复制能力的aav2/hu68(rcaav)的存在分析样品，所述具有复制能力的aav2/hu68可以在生产过程期间潜在地出现。已开发了三次传代测定，其由基于细胞的扩增和传代，随后为通过实时qpcr(caphu68靶)检测rcaav dna组成。基于细胞的组分由用测试样品和野生型人ad5的稀释物接种hek293细胞的单层(p1)组成。测试的最大产物量为1.00x10
10
gc的载体产物。由于腺病毒的存在，rcaav在细胞培养物中进行扩增。在2天后，生成细胞裂解物，并且使ad5热灭活。然后将澄清的裂解物传递到第二轮细胞(p2)，以增强灵敏度(再次在ad5的存在下)。在2天后，生成细胞裂解物，并且使ad5热灭活。然后将澄清的裂解物传递到第三轮细胞(p3)，以使灵敏度达到最大(再次在ad5的存在下)。在2天后，将细胞裂解以释放dna，其然后经受qpcr以检测aavhu68 cap序列。以ad5依赖性方式扩增aavhu68 cap序列指示了rcaav的存在。含有aav2 rep和aavhu68 cap基因的aav2/hu68替代阳性对照的使用，使得能够确定测定的lod(0.1iu、1iu、10iu和100iu)。使用raav的连续稀释物(1.00
×
10
10
gc、1.00x109gc、1.00x108gc和1.00x107gc)，可以定量测试样品中存在的rcaav的大致数量。执行了测试方法。
[0343]
体外效力
[0344]
为了将ddpcr gc滴度与基因表达联系起来，执行了体外相对效力生物测定。简言
之，将细胞在96孔板中铺平板，并且在37℃/5％co2下温育过夜。第二天，细胞用连续稀释的aav载体进行感染，并在37℃/5％co2下温育最多3天。在培养期结束时，收集细胞培养基并且基于比色底物的切割来测定arsa活性。检测的优化正在进行中。
[0345]
总蛋白、衣壳蛋白、蛋白质纯度和衣壳蛋白比率
[0346]
首先使用二辛可宁酸(bca)测定，针对牛血清白蛋白(bsa)蛋白质标准曲线定量载体样品的总蛋白。通过将等份样品与试剂盒中提供的micro-bca试剂混合来进行确定。相同的程序应用于bsa标准的稀释物。使混合物在60℃下温育，并且在562nm处测量吸光度。使用4参数拟合，从已知浓度的标准吸光度生成标准曲线。未知样品根据4参数回归进行定量。
[0347]
为了提供raav纯度的半定量确定，样品针对基因组滴度进行标准化，并且在还原条件下，通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)分离5.00x109gc。然后用sypro ruby染料染色sds-page凝胶。任何杂质条带都通过密度测定法进行定量。除三种aav特异性蛋白质(vp1、vp2和vp3)之外出现的染色条带被视为蛋白质杂质。报告了污染物条带的杂质质量百分比以及近似分子量。sds-page凝胶还用于定量vp1、vp2和vp3蛋白，并且确定其比率。
[0348]
基因组拷贝/感染单位的比率
[0349]
gc/iu比是产物一致性的量度。将ddpcr滴度(gc/ml)除以“感染单位”(iu/ml)，以给出计算的gc/iu比。
[0350]
实施例2-在小鼠中的概念验证性药理学和剂量范围研究
[0351]
执行实验以确定在小鼠中的icv注射后，aavhu68.harsaco载体的效力。对于这项概念验证性(poc)实验选择了健康的6-8周龄c57bl6/j小鼠。选择icv途径是因为小鼠的较小尺寸使得难以经由icm可靠地注射aav载体。年龄基于历史数据和我们在这个年龄的小鼠中执行icv注射的先前经验进行选择(hinderer等人，2016)。基于在小鼠中用其它icv施用的aav载体的先前经验，选择21天的尸检时间点来捕获稳定的转基因表达(hinderer等人，2016)。
[0352]
以1.00x10
10
gc的低剂量或1.00x10
11
gc的高剂量，经由单次icv注射到右脑室内，将aavhu68.cb7.ci.harsaco.rbg载体施用到c57bl6/j野生型小鼠的csf内。基于在不同lsd小鼠模型中icv施用的aav载体的先前剂量范围研究来选择剂量(hinderer等人，2016)。作为对照，年龄匹配的c57bl6/j小鼠用媒介物(pbs)单次icv注射到右脑室内，以获得基线arsa活性水平。在施用21天后，对小鼠进行尸检，并且使用基于人工底物4-硝基儿茶酚硫酸酯的切割的比色测定，在来自脑、肝脏和血清样品的透析蛋白质提取物中定量arsa活性水平。
[0353]
由于脑是对于mld治疗的关键靶组织，因此在aavhu68.cb7.ci.harsaco.rbg载体施用后21天，在左大脑半球相对于右大脑半球中测量了arsa活性水平。与pbs治疗的对照相比，arsa活性在施用低剂量(1.00x10
10
gc)或高剂量(1.00x10
11
gc)aavhu68.cb7.ci.harsaco.rbg载体的小鼠的脑中分别高12％和31％。此外，对于aavhu68.cb7.ci.harsaco.rbg治疗的动物，在右半球和左半球之间没有观察到arsa活性水平的明显差异(图8)。这些结果提示了，经由单次单侧icv注射将aavhu68.cb7.ci.harsaco.rbg载体递送到csf内，足以转导两个大脑半球的细胞和/或通过释放到csf内的循环arsa酶来促进交叉校正。两种剂量的aav.cb7.ci.harsaco.rbg均导致
在对野生型小鼠的icv施用之后，脑中的酶促活性的arsa酶的过表达。
[0354]
为了定量在神经系统之外的组织中的功能性arsa酶活性，在aavhu68.cb7.ci.harsaco.rbg载体施用后21天获得血清和肝脏样品。与pbs治疗的对照中的基线水平相比，在施用低剂量(1.00x10
10
gc)或高剂量(1.00x10
11
gc)aavhu68.cb7.ci.harsaco.rbg载体的小鼠中，血清中的arsa活性水平分别高30％和151％(图9a)。在肝脏中，在施用低剂量(1.00x10
10
gc)或高剂量(1.00x10
11
gc)aavhu68.cb7.ci.harsaco.rbg载体的小鼠中，arsa活性水平分别是11倍和28倍(图9b)。这些结果提示了，除脑之外，csf递送的aavhu68.cb7.ci.harsaco.rbg载体可能已转导和/或交叉校正了特别是在肝脏中的外周器官系统的细胞。在两种剂量的aav.cb7.ci.harsaco.rbg下，在肝脏和血清中也检测到酶促活性的arsa的过表达。
[0355]
总而言之，这项实验确认了，在小鼠中aavhu68.cb7.ci.harsaco.rbg载体的单次单侧icv注射，导致在21天内在脑的两个半球中的酶促活性的arsa酶的剂量依赖性表达。在血清和肝脏中也存在功能性arsa酶，提示了aavhu68.cb7.ci.harsaco.rbg载体在外周器官系统中被转导。然而，因为我们将arsa活性测量为高于野生型基线水平的过表达，所以这种过表达妨碍了将这些结果转变为潜在有效的治疗剂量。因此在arsa-/-小鼠中执行med研究，以确认剂量范围(实施例4)。
[0356]
实施例3-小鼠中的细胞嗜性研究。
[0357]
在野生型小鼠中icv施用载体之后，评价了arsa酶的cns表达谱。显示了aavhu68占优势地转导神经元，并且执行实验以确定arsa是否定位至产生髓鞘的少突胶质细胞。arsa的少突胶质细胞特异性表达支持了mld患者中受影响的关键细胞类型的交叉校正的可能性。对于这项研究，利用了aavhu68.cb7.ci.harsacoha.rbg，其是类似于aavhu68.cb7.ci.harsaco.rbg的aavhu68载体，其编码用c末端ha肽加上标签的人改造arsa酶。因为抗arsa抗体理论上可以与野生型动物中的内源性鼠arsa交叉反应，所以使用抗血凝素(ha)抗体来评价在icv施用之后的arsa表达。在这种类似的aavhu68载体施用之后观察到的arsa表达谱预计代表在aavhu68.cb7.ci.harsaco.rbg施用之后的arsa表达。
[0358]
以1.00x10
10
gc的低剂量或1.00x10
11
gc的高剂量，将aavhu68.cb7.ci.harsacoha.rbg icv施用到成年c57bl6/j野生型小鼠(6-8周龄)的csf内。在载体施用后21天，对小鼠进行尸检，并获得含有皮质和皮质下白质的脑样品，以评价少突胶质细胞(其通过少突胶质细胞转录因子2(olig2)的表达进行鉴定)中的arsa表达。选择载体剂量、小鼠品系、年龄和尸检时间点以映射实施例2，并且检查皮质和皮质下白质，因为这些区域在icv施用后一致地进行转导，并且是用于治疗mld的关键靶向组织。
[0359]
低剂量(1.00x10
10
gc)的施用导致皮质和皮质下白质中最少数目的表达arsa的细胞。相比之下，施用高剂量(1.00x10
11
gc)的动物展示在皮质和皮质下白质中更多数目的表达arsa的细胞。此外，在含有大量arsa阳性olig2阴性细胞(假定神经元)的脑区域中，观察到表达arsa的少突胶质细胞的富集(图10)。因为少突胶质细胞通常最低限度地被aavhu68转导，所以arsa表达的这种细胞分布模式提示了，已发生了少突胶质细胞通过相邻神经元的交叉校正。这些数据支持了aavhu68.cb7.ci.harsaco.rbg可以对mld患者中受影响的cns和pns的神经元和成髓鞘细胞两者提供分泌性arsa酶的持久来源的可能性。
[0360]
总而言之，这项实验证实了，到野生型小鼠中icv施用类似于
aavhu68.cb7.ci.harsaco.rbg的载体后21天，arsa酶成功地递送到脑中的神经元和少突胶质细胞两者，其为mld治疗的关键靶细胞类型。在单侧icv施用后，在脑的两侧中均观察到表达加上ha标签的arsa的转导细胞。神经元和少突胶质细胞这两种主要靶细胞均表达arsa。
[0361]
实施例4-在食蟹猴中的试点剂量范围研究。
[0362]
这项研究是试点研究，以确定在aavhu68.cb7.ci.harsaco.rbg载体的icm施用之后，将非人灵长类动物(nhp)的csf中的arsa活性水平增加到高于基线水平所需的剂量范围。来自离体慢病毒hsc-gt的1/2期试验的结果已显示了，在csf中达到arsa活性的正常水平与早发型mld患者的良好结果相关联(sessa等人，2016)。因为hsc-gt类似于这些实施例中描述的治疗方法，因为它依赖于来自分泌arsa的cns驻留细胞的交叉校正，所以有理由认为nhp中arsa的csf水平将预测aavhu68.cb7.ci.harsaco.rbg载体的潜在功效。
[0363]
以3.00x10
12
gc(低剂量)、1.00x10
13
gc(中剂量)或3.00x10
13
gc(高剂量)的剂量，将aavhu68.cb7.ci.harsaco.rbg载体icm施用于成年食蟹猴。在aavhu68.cb7.ci.harsaco.rbg施用之后的42天期间，每周收集一次csf和血清(除了对于csf收集的第30天之外)，以评价arsa活性水平的动态和抑制性抗arsa抗体的存在。aavhu68.cb7.ci.harsaco.rbg的剂量基于在nhp中表达可分泌蛋白的icm施用载体的先前经验进行选择(hordeaux等人，2018)。基于我们先前的经验：转基因表达到it aav施用后14天是可检测的，在aavhu68.cb7.ci.harsaco.rbg治疗之后42天期间的样品收集时间点预计捕获arsa活性水平的稳定平台(hinderer等人，2014；hinderer等人，2018)。
[0364]
中剂量(1.00x10
13
gc)或高剂量(3.00x10
13
gc)aavhu68.cb7.ci.harsaco.rbg的施用增加了高于基线水平的csf arsa活性。arsa活性在治疗后7-14天达到峰值，并且随后到治疗后35-42天恢复至基线水平。在其峰值时，对于接受中剂量或高剂量的每只nhp，arsa活性是基线的至少两倍，提示了当施用于arsa缺陷的mld患者时，aavhu68.cb7.ci.harsaco.rbg可能能够恢复正常arsa水平。相比之下，低剂量(3.00x10
12
gc)的aavhu68.cb7.ci.harsaco.rbg在增加arsa活性水平方面是无效的(图11)。
[0365]
在aavhu68.cb7.ci.harsaco.rbg施用后14天后，所观察到的arsa活性水平下降可能起因于抑制性抗harsa抗体的产生。分析揭示了，在csf中，到治疗后3周，在一些动物中观察到抗harsa抗体的增加。到42天，所有动物都展示升高的抗harsa抗体，并且更高的抗体水平似乎与更高剂量的aavhu68.cb7.ci.harsaco.rbg相关联(图12a)。在血清中，到aavhu68.cb7.ci.harsaco.rbg施用后21-28天，循环抗harsa抗体的增加在一些动物中是显而易见的。到42天，大多数动物展示升高的抗harsa抗体，但与csf不同，血清水平似乎与aavhu68.cb7.ci.harsaco.rbg的剂量无关(图12b)。这些结果提示了，在aavhu68.cb7.ci.harsaco.rbg施用后14天，所观察到的arsa活性下降是由于csf和血清循环的抗harsa抗体的诱导。
[0366]
除针对aavhu68.cb7.ci.harsaco.rbg转基因产物的体液应答(即，抗harsa抗体的产生)之外，经由细胞毒性t细胞应答消除转导细胞也是可能的，所述细胞毒性t细胞应答已促成csf中的arsa活性丧失。为了解决这种可能性，从治疗后42天进行尸检的nhp中收获cns、pns和外周组织，用于arsa表达的综合评估。
[0367]
在施用高剂量的aavhu68.cb7.ci.harsaco.rbg(3.00x10
13
gc)的nhp中，在整个脑中检测到表达人arsa酶的转导细胞，包括皮层(图13e、图13f、图13g、图13i和图13j)、海马
(图13h)、丘脑(图13k)和小脑(图13l)。颈(图14d)、胸(图14e)和腰(图14f)脊髓的细胞，连同颈(图14g)、胸(图14h)和腰(图14i)drg也表达人arsa酶。这些发现提示了，尽管针对转基因产物的体液免疫应答，但在aavhu68.cb7.ci.harsaco.rbg施用后，转导细胞仍然在靶组织内持续存在至少42天，在其中需要校正神经元和髓鞘产生细胞的地方产生arsa。这些数据支持了aavhu68.cb7.ci.harsaco.rbg可以对mld患者的cns和pns两者提供治疗水平的arsa的可能性。
[0368]
观察到在高剂量的aavhu68.cb7.ci.harsaco.rbg(3.00x10
13
gc)下，与成功的icm基因转移后通常可见的一致的最低限度至中度背侧感觉轴突病。在研究期间在动物中没有观察到外周神经病变的临床体征。生成关于施用低剂量(3.00x10
12
gc)或中剂量(1.00x10
13
gc)aavhu68.cb7.ci.harsaco.rbg的nhp的组织病理学载玻片，并且执行分析。
[0369]
累积起来，这项研究显示了，到aavhu68.cb7.ci.harsaco.rbg的icm施用后14天，nhp的csf中的总arsa活性水平增加了一倍以上。由于针对人arsa转基因的抗体的产生，csf arsa活性水平在随后的28天内恢复到大约基线水平。然而，对于42天的研究持续时间，在脑和脊髓各处的转导细胞仍然持续存在，包括已投射到pns内的细胞(例如，drg和运动神经元)。观察到没有临床体征的在高剂量(3.00x10
13
gc)下的轴突病，并且与icm aav施用之后的先前发现一致。这些数据支持了aavhu68.cb7.ci.harsaco.rbg用于将arsa递送到mld患者的cns和pns中的缺陷神经元和髓鞘产生细胞的用途。
[0370]
在csf和靶组织(cns、pns)的md和hd处实现了arsa的过表达。ld是亚最佳的。
[0371]
实施例5-arsa-/-小鼠模型。
[0372]
文献中没有报道过天然存在的mld动物模型。存在两种实验室生成的mld小鼠模型，这两者均通过德国的volkmar gieselmann小组产生(hess等人，1996；ramakrishnan等人，2007)。由于获得这些公开的系用于研究的困难，因此使用成簇规律间隔短回文重复-crispr相关蛋白9(crispr-cas9)基因编辑技术生成了mld小鼠模型。下表中提供了三种不同的实验室生成的小鼠模型的比较。
[0373]
表.异染性脑白质营养不良的小鼠模型
[0374][0375]
arsa，芳基硫酸酯酶a(基因，小鼠)；cns，中枢神经系统；crispr/cas9，成簇规律间隔短回文重复/crispr相关蛋白9；gal3st1，半乳糖-3-o-磺基转移酶-1(基因，小鼠)；gal3st1，半乳糖-3-o-磺基转移酶-1(蛋白质)；pns，外周神经系统；tg，转基因。
[0376]
a.非脱髓鞘mld小鼠(arsa-/-)
[0377]
经由将1.3kb新霉素盒插入arsa基因的外显子4内，通过同源重组开发了经典的mld小鼠模型(在文献中称为“非脱髓鞘mld小鼠”)。这种插入导致基因的完全敲除，其中纯合的arsa-/-小鼠缺乏可检测的arsa mrna和功能蛋白。这些小鼠在cns、pns、肾脏和肝脏中发展进行性硫苷脂贮存，类似于mld患者中已描述的。然而，当与人患者相比较时，贮存和相关表型进展更慢，在小鼠中在中年左右(6-12个月)表现出来。使用生物化学分析(ramakrishnan等人，2007)，到6个月可以检测到硫苷脂水平的增加，但仅到10-12月龄，才能观察到显著的组织学硫苷脂染色(gieselmann等人，1998)。在arsa-/-小鼠中可测量的最一致的神经系统症状是步态模式异常(基于足迹分析)和运动协调性降低(通过转棒表现测量的)(gieselmann等人，1998；matzner等人，2009；stroobants等人，2011)，其通常在6-10月龄后出现。与人mld患者形成对比，在arsa-/-小鼠的cns或pns中未发现脱髓鞘，这解释了对于这些动物观察到的令人惊讶的温和表型和正常寿命。
[0378]
b.脱髓鞘(加重的)mld小鼠(tg/arsa-/-)
[0379]
假设缓慢的硫苷脂贮存解释了在arsa-/-小鼠中观察到的延迟疾病发作和脱髓鞘缺乏的原因(ramakrishnan等人，2007)。为了解决这一假设，开发了遗传加重的mld小鼠模型，其展示脱髓鞘(在文献中称为“脱髓鞘mld小鼠”)。该系通过将arsa-/-小鼠与在髓鞘产生细胞中携带过表达gal3st1酶的转基因(tg)的小鼠杂交而产生。gal3st1涉及硫苷脂的生物合成，并且当与arsa-/-小鼠相比较时，双重突变型小鼠(tg/arsa-/-)在其组织中累积约两倍多的硫苷脂。tg/arsa-/-小鼠显示出通过嗜酸性(alcianophilic)组织学染色检测到的cns和pns中的硫脂贮存增加、神经传导受损、以及pns和在较小程度上的cns中的髓鞘形成降低(ramakrishnan等人，2007)，所有这些都是人患者的mld的关键特征。然而，当与人患者的疾
病进展相比较时，这些发现的出现是延迟的，其中特征在成年小鼠中在6月龄左右表现出来。具体而言，研究人员使用生物化学测定描述了到6个月的硫苷脂累积，并且所有其它表型到17-22个月出现。硫苷脂贮存的延迟和随后的脱髓鞘很可能是tg/arsa-/-小鼠中观察到的正常寿命的原因，其与mld患者的寿命缩短形成对比。
[0380]
c.新型mld小鼠模型
[0381]
aavhu68.cb7.ci.harsaco.rbg的药理活性在体内和体外mld模型两者中进行评价。对于体内模型，生成了新型arsa-/-(+/-aav-ph.b-gal3st1)小鼠模型并且进行表征，因为公开的体内模型(arsa-/-[单一突变]和tg/arsa-/-[双重突变])的可用性是有限的。正在评估新小鼠模型展示与经典arsa-/-小鼠可比较的自然史，包括与mld患者中观察到的相似的表型，具体地中枢神经系统(cns)、外周神经系统(pns)、肾脏和肝脏的细胞中的硫苷脂贮存，连同步态异常和运动协调性降低。
[0382]
新的arsa-/-小鼠系使用crispr/cas9胚胎显微注射生成。产生了四只首建鼠(founder)，其具有长度范围为1105bp至1133bp的外显子2-4缺失。所有四只首建鼠都与c57bl/6j野生型小鼠育种一次，并且成功地将缺失的等位基因传递给f1代。f1代携带者再一次杂交育种到c57bl6/j背景内，以进一步稀释任何不需要的脱靶编辑。所有四个系都产生了f2代携带者，其进行培育以生成且表征四个arsa-/-小鼠系。首只arsa-/-小鼠出生。
[0383]
所利用的基因改造策略靶向定位于染色体15上的小鼠arsa基因，使用几种引导rna来促进外显子2直到外显子4的靶向缺失。虽然经典的arsa-/-模型采用新霉素盒的同源重组来产生无效等位基因，但crispr/cas9基因编辑预料在比先前的基因靶向方法更短的时间内产生具有可比较表型的完全敲除。
[0384]
与公开的arsa-/-小鼠模型不同，并不预计在新的arsa-/-小鼠系中观察到脱髓鞘。因此，在arsa-/-小鼠中开发了另一种模型，其中硫苷脂合成酶半乳糖-3-o-磺基转移酶-1(gal3st1)是过表达的，其增加了硫苷脂贮存。硫苷脂贮存的增加应该导致类似于经典arsa-/-小鼠模型的pns中的脱髓鞘、神经传导受损和麻痹。在mld患者中观察到这些特征。还生成了与tg/arsa-/-小鼠类似的过表达gal3st1的小鼠，以确定在加重的条件下是否可以观察到脱髓鞘。然而，代替生成双重突变体，采用aav-php.b载体来过表达gal3st(aav-php.b.cb7.gal3st1co.rbg[aav-ph.b.gal3st1])。选择aav.php.b衣壳是因为它在c57bl6/j小鼠中的全身(iv)注射后，展示稳固的cns嗜性(deverman等人，2016；hordeaux等人，2019)。这种方法避免了育种具有不同遗传背景的双重转基因小鼠的问题，因为混合遗传背景频繁导致f2代中混淆的神经行为异常，其随后无法在更纯的遗传背景中重现。因此，预计这些小鼠在cns中以高水平过表达gal3st1，具有同基因背景的附加的实验益处。
[0385]
根据下述表型标准(按疾病严重程度的升序列出)执行自然史研究：
[0386]
1.cns和外周组织中的残留arsa活性降低或缺失的证实；
[0387]
2.在cns、pns、肾脏和肝脏中的硫苷脂贮存的证实；
[0388]
3.关于组织病理学的脱髓鞘的证实；
[0389]
4.与脱髓鞘一致的行为表型的证实。
[0390]
选择arsa-/-小鼠或aav-ph.b.gal3st1介导的加重的arsa-/-小鼠或两者用于药理学和med研究。除满足最大数目的上述表型标准之外，决定还基于哪个小鼠系展示最佳育种性能和来自arsa
+/-携带者杂交的arsa
+/-小鼠百分比。
[0391]
大约8周龄的小鼠在适应小鼠动物饲养所1周后入选自然史研究。评价最少六只arsa-/-雄性(m)和六只arsa-/-雌性(f)/系，并且与野生型同窝仔畜进行比较。使用改编自(guyenet等人，2010)的评分系统，每周一次监测小鼠的共济失调发展。每月一次对动物称重并评估运动协调性(转棒测定)、握力和感觉缺陷的迹象(热板测定)。使用catwalk
tm
步态分析系统，每2个月完成一次步态分析。在6月龄时，对每个队列的子集(arsa-/-:n＝3m，3f；野生型：n＝1m，1f)进行尸检，并且评估arsa酶活性，脱髓鞘，以及在脑、肾脏、肝脏、坐骨神经和脊髓中的硫苷脂贮存。跟踪剩余的小鼠较长的时间段，以充分表征这些系的自然史并监测迟发性脱髓鞘的可能性。
[0392]
可以观察到延迟或缺失的脱髓鞘表型。用编码硫苷脂合成酶gal3st1的aav-php.b载体(aav-php.b.cb7.gal3st1co.rbg)的iv推注，治疗每个系中的小鼠子集，以增加硫苷脂合成速率。如tg/arsa-/-小鼠中，gal3st1的过表达可能产生更快速的贮存过载和加重的疾病模型，其证实了沿着更类似于人中观察到的疾病进展的时间过程的脱髓鞘。在自然史研究中，与arsa-/-小鼠平行地，使所有小鼠经受每周一次的临床观察，以监测总体健康和共济失调。来自每个队列的小鼠子集(arsa-/-:n＝3m，3f；arsa
+/+
:n＝1m，1f)在6月龄时进行尸检，以评价硫苷脂贮存和脱髓鞘。
[0393]
实施例6-arsa-/-小鼠中aavhu68.cb7.ci.harsaco.rbg的最小有效剂量(med)的鉴定。
[0394]
选择实施例5中鉴定的arsa-/-小鼠系，以进行icv施用的aav.cb7.ci.harsaco.rbg的med研究。注射时的年龄、生命中的参数和尸检时的年龄基于其它实施例中定义的最相关的疾病生物标记物。
[0395]
med研究使用对于glp nhp毒理学研究制造的毒理学载体批次来执行。该研究评估了四个剂量水平，以确定med、药理学和组织病理学(功效和安全性)。剂量水平基于在野生型小鼠实施例2和3中的试点剂量范围以及当缩放到人时的最大可行剂量进行选择。icv注射的年龄基于自然史研究结果进行确定。在注射后的适当时间点处死动物，以获得药理学和功效读出，并且与施用itffb的年龄匹配的对照进行比较。尸检时间点基于实施例5进行确定，并且可以基于公开的arsa-/-模型的自然史，在小鼠大约5-12月龄时执行。然而，基于自然史研究的结果和测量的终点，尸检时间点可能延长。功效终点基于来自实施例5的结果进行限定，并且可以包括测定如共济失调评分、体重、转棒上的运动协调性和热板上的感觉功能。在令人满意的神经行为终点的不存在下，arsa活性水平、硫苷脂贮存和组织病理学可能是用于定义med的标准。
[0396]
实施例5使用aav-php.b介导的gal3st1过表达(硫苷脂过载)鉴定了可靠的加重模型，在每个剂量水平下执行关于加重小鼠的一个研究臂。这些小鼠在研究第0天时同时接受iv施用的aav.php.b.gal3st1剂量和icv施用的aav.cb7.ci.harsaco.rbg剂量，以避免产生交叉反应性nab，其可能伴随交错给药发生。
[0397]
研究设计在下表中呈现：
[0398][0399]a所有小鼠都在载体施用后5-12个月进行尸检用于所指示的评价。
[0400]b初始组织病理学分析集中于脑、颈脊髓、颈drg、外周神经、肝脏、脾脏、肾脏、肺、心脏、膈膜和肌肉。还收集另外的组织用于任选的组织病理学，包括胃肠道、生殖器官、肾上腺和淋巴结。适当时对器官进行称重。
[0401]
aav-ph.b.gal3st1、aav-php.b.cb7.ci.gal3st1co.rbg；arsa，芳基硫酸酯酶a(基因，小鼠)；arsa，芳基硫酸酯酶a(蛋白质)；cns，中枢神经系统；csf，脑脊液；gal3st1，半乳糖-3-o-磺基转移酶-1(蛋白质)；gc，基因组拷贝；icv，侧脑室内；iv，静脉内；med，最小有效剂量；n，动物数目；pns，外周神经系统；tbd，待确定。
[0402]
实施例7-使用患者衍生的细胞用于概念验证性药理学研究的体外疾病模型的表征。
[0403]
为了补充aav.cb7.ci.harsaco.rbg的体内研究，使用体外疾病模型评价aav介导的arsa基因递送的功效。最近，表征了mld患者衍生的基于ipsc的模型，其重现了缺陷的神经胶质和神经元分化以及mld的几个特征，例如溶酶体区室扩张、硫苷脂贮存、氧化性应激和细胞凋亡(frati等人，2018)。表征了一种患者衍生的细胞系(riken细胞库参考hps0240)以及两种crispr-cas9arsa敲除ipsc克隆。确定了适当的细胞系。评价了在aav载体施用之后的疾病生物标记物拯救程度。因为已知aavhu68衣壳在培养中弱转导细胞，所以不同的aav血清型可以用于递送arsa编码载体基因组，其是用于这些研究的aav.cb7.ci.harsaco.rbg或与之类似。
[0404]
依照通过frati等人，(2018)描述的氧化性应激或形态变化，神经祖细胞阶段并未显示任何决定性的表型。分化细胞(神经元和少突胶质细胞)处于调查中，因为它们在公开的工作中证实了更突出的硫苷脂贮存表型。具有可靠的硫苷脂贮存，使用aav介导的arsa转导来测试表型拯救。因为已知aavhu68衣壳在培养中弱转导细胞，所以不同血清型的衣壳可以用于递送arsa编码载体基因组，其是aav.cb7.ci.harsaco.rbg或与之类似。
[0405]
来自体内小鼠模型(实施例6)和上述mld体外模型中的一种或多种的数据用于支
持aav.cb7.ci.harsaco.rbg的药理活性。
[0406]
实施例8
–
在非人灵长类动物中的毒理学研究。
[0407]
6-8岁的成年食蟹猴用于aav.cb7.ci.harsaco.rbg的非glp试点剂量范围研究中。选择幼年恒河猴(1.
–
2岁)用于aav.cb7.ci.harsaco.rbg的毒理学研究。为了方便的目的(动物的可用性)，使用了两个不同的nhp物种。在恒河猴和食蟹猴之间在aav icm施用后的转导谱中不存在差异。成年食蟹猴和幼年恒河猴均具有相似的解剖特征和生理特征，并且重现了预期的婴儿临床群体的cns解剖结构，并且可以使用临床roa(icm)进行治疗。解剖结构和roa中的相似性可能导致代表性的载体分布和转导谱，其允许在小鼠中可能的更准确的毒性评价。另外，与啮齿类动物模型中相比，在nhp中执行了更严格的神经系统评价，允许cns毒性的更灵敏检测。
[0408]
完成的非临床药理学研究证实了，在aav.cb7.ci.harsaco.rbg的icv施用之后，经由健康小鼠的脑中的神经元和产生髓鞘的少突胶质细胞两者的转导和/或交叉校正，aav介导的arsa酶递送的潜力。在经由临床途径(icm)施用aav.cb7.ci.harsaco.rbg的食蟹猴中的药理学研究显示了，在治疗后的前14天期间，csf中的arsa活性增加到至少两倍的内源性水平。由于脑脊液(csf)中达到arsa活性的正常水平与我们预期的患者群体(早发型mld患者)的良好结果相关联(sessa等人，2016)，aav.cb7.ci.harsaco.rbg具有向mld患者的csf递送治疗水平的arsa的潜力。此外，证实了对于aav.cb7.ci.harsaco.rbg施用后至少42天，表达arsa的转导和/或交叉校正的细胞在脑和脊髓各处广泛地持续存在，包括投射到pns内的细胞(脊髓运动神经元和背根神经节[drg])。因此，aav.cb7.ci.harsaco.rbg具有对mld患者中受影响的cns和pns的神经元和成髓鞘细胞两者提供分泌性arsa酶的持久来源的潜力。
[0409]
为了扩展这项药理学研究并收集安全性数据，使用预期的临床施用途径(roa)，在幼年恒河猴中执行了aav.cb7.ci.harsaco.rbg的符合glp的180天毒理学研究。将其它aav载体鞘内(it)递送到恒河猴的csf内，已导致在注射后2-3周的峰值转基因表达，随后为到90天的转基因表达的稳定平台。我们已证实了在食蟹猴中的icm施用后14天观察到arsa表达的峰值。因此，180天的时间点足以评估在最大暴露于转基因产物期间发生的任何毒性。直到180天的评估也足以检测由于注射程序或对测试物品的先天性炎症应答的立即毒性，以及对载体衣壳或转基因产物的适应性免疫应答。
[0410]
在幼年恒河猴(大约1-2岁)中进行符合glp的180天安全性研究，以调查在icm施用之后aav.cb7.ci.harsaco.rbg的毒理学。选择180天的评估期是因为这允许分泌的转基因产物有足够的时间在icm aav施用之后达到稳定的平台水平。选择施用年龄以代表我们依据cns解剖结构预期的婴儿群体。下表中概述了研究设计。
[0411][0412]
f，雌性；glp，良好实验室规范；icm，大池内；itffb，鞘内最终制剂缓冲液；m，雄性；na，不适用；roa，施用途径。
[0413]
幼年恒河猴接受三种剂量水平的aav.cb7.ci.harsaco.rbg之一：3.0x10
12
gc、1.0x10
13
gc或3.0x10
13
gc(n＝3/剂量)。另外的幼年猕猴(n＝2)施用作为对照的媒介物(itffb)。aav.cb7.ci.harsaco.rbg剂量水平选择为等价于med研究中按脑质量缩放时评估的剂量水平(假定对于小鼠为0.4g且对于恒河猴为90g)。nhp使用与所述相同的载体递送装置进行给药。
[0414]
执行基线神经系统检查、临床病理学(差异细胞计数、临床化学和凝血实验对象组)、csf化学和csf细胞学。在aav.cb7.ci.harsaco.rbg或媒介物施用后，每天监测动物的痛苦和异常行为的迹象。在aav.cb7.ci.harsaco.rbg或媒介物施用之后，在每周一次的基础上执行血液和csf临床病理学评价和神经系统检查共30天，并且其后每30天一次。在基线和其后的每30天时间点，通过干扰素γ(ifn-γ)酶联免疫斑点(elispot)测定，来评价针对
aavhu68和aav.cb7.ci.harsaco.rbg转基因产物的抗aavhu68 nab和细胞毒性t淋巴细胞应答。
[0415]
在aav.cb7.ci.harsaco.rbg或媒介物施用后90天，对50％的动物(组1-4)实施安乐死，并且对综合的组织列表执行组织病理学分析，包括但不限于脑、脊髓、drg、外周神经、心脏、肝脏、脾脏、肾脏、肺、生殖器官、肾上腺和淋巴结。适当时对器官进行称重。从循环区室(外周血单核细胞)中收集淋巴细胞，并且在尸检时就针对这些器官中的衣壳和转基因产物两者为反应性的t细胞的存在评估cns引流淋巴结。在组1-4实施安乐死后90天(在aav.cb7.ci.harsaco.rbg或媒介物施用后100天和80天)，对剩余动物(组5-8)实施安乐死，并且如上执行组织病理学分析。
[0416]
除尿和粪便之外，还收获并存档用于载体生物分布的组织、csf和血清，以评价载体排泄。在幼年猕猴中使用相同的衣壳和roa评价组织样品中的qpcr。
[0417]
icm载体施用导致在csf区室内的立即载体分布，并且效力和毒性两者均与cns载体暴露有关。因此，剂量按脑质量缩放，其提供了csf区室大小的近似值。剂量转换基于成年小鼠为0.4g(gu等人，2012)，幼年恒河猴为90g(herndon等人，1998)，且4-12个月的人类婴儿为800g(dekaban，1978)的脑质量。下表中显示了等价的人剂量。
[0418]
表.关于鼠med研究、nhp剂量范围和毒理学研究的剂量，以及等价的人剂量
[0419][0420]
缩写：gc，基因组拷贝；med，最小有效剂量；nhp，非人灵长类动物。
[0421]
实施例9-非临床腺相关病毒研究中的感觉神经元毒性。
[0422]
为了减少aav.cb7.ci.harsaco.rbg毒理学研究中出现的drg感觉神经元的最低限度至轻度无症状变性，构建了包括drg脱靶的mirna序列的载体基因组。从5'到3'，raav载体基因组构建为cb7启动子，改造的harsa编码序列，四个连续的mirna183(具有agtgaattctaccagtgccata的序列，seq id no:20)(其通过间隔区分开，并且每个间隔区独立地选自(a)ggat；(b)cacgtg；或(c)gcatgc中的一种或多种)，以及rbgpolya。这种载体基因组称为aav.cb7.ci.harsaco.mirna183.rbg，而包含这种载体基因组和aavhu68衣壳的raav称为aavhu68.cb7.ci.harsaco.mirna183.rbg。包含这种载体基因组的raav载体的生产类似于实施例1中描述的方法执行。使用实施例2-8和10中描述的方法和模型，测试aavhu68.cb7.ci.harsaco.mirna183.rbg的功效和毒性。
[0423]
实施例10-首次人体试验。
[0424]
执行了在通过arsa酶缺陷引起的早发型(晚期婴儿型或早期幼年型)mld的儿科患者(≥4个月)中，通过单次icm注射施用的aav.cb7.ci.harsaco.rbg的1/2期、多中心、标签公开、单臂、剂量递增研究。在2年内评价安全性和耐受性、药效学和临床功效，并且跟踪所有受试者直到aav.cb7.ci.harsaco.rbg施用后5年，用于安全性和耐受性、药效学、疾病进展和临床结果的长期评估。
[0425]
该研究由从大约第
–
35天到第
–
1天的筛选阶段组成，以确定每个潜在受试者的合格性。在确认受试者的合格性和父母/监护人愿意让他们的儿童参与研究后，受试者经历基线评价，其包括脑mri、用于csf收集的lp、抽血、尿收集、生命体征、ecg、体格检查、神经系统检查和临床评价。基线评价在第
–
1天和第0天时发生，并且合格性在aav.cb7.ci.harsaco.rbg施用之前的基线时再次进行确认。
[0426]
在治疗阶段过程中，受试者在第0天的早上入院。受试者在第0天时接受aav.cb7.ci.harsaco.rbg的单次icm剂量，并且在给药后留在医院至少24小时用于观察。随后的研究就诊在给药后的第7天、第14天、第30天、3个月和6个月发生，随后为对于给药后的前2年每6个月一次。长期随访(ltfu)就诊以每12个月一次的频率发生另外3年，直到给药后5年。
[0427]
单一剂量的aav.cb7.ci.harsaco.rbg以如下所示的剂量水平之一进行施用。
[0428]
队列1(低剂量)：三个合格的受试者(受试者#1-3)序贯地入选，并且施用低剂量的aav.cb7.ci.harsaco.rbg，其中在第一个受试者和第二个受试者之间具有4周的安全性观察期。如果没有观察到srt，则在队列1中的第三个受试者施用aav.cb7.ci.harsaco.rbg后4周，通过安全委员会评估所有可用的安全性数据。
[0429]
队列2(高剂量)：三个合格的受试者(受试者#4-6)序贯地入选，并且施用高剂量的aav.cb7.ci.harsaco.rbg，其中在第四个受试者和第五个受试者之间具有4周的安全性观察期。如果没有观察到srt，则在受试者#6施用aav.cb7.ci.harsaco.rbg后4周，安全委员会评估所有可用的安全性数据，包括来自队列1中的受试者的安全性数据。
[0430]
队列3(mtd，最大耐受剂量)：伴随通过安全委员会的积极推荐，另外6个受试者(受试者#7-12)入选，并且施用以mtd的单次icm剂量的aav.cb7.ci.harsaco.rbg。该队列中的受试者的给药不与每个受试者之间的4周安全性观察期错开。
[0431]
总共入选的9个受试者入选高剂量队列或低剂量队列，并且总共为12个受试者(跨越所有剂量)。应用了安全范围，使得对于人受试者选择的高剂量是nhp中的等价mtd的30-50％。低剂量通常是所选择的高剂量的1/2-1/3，条件是它是超过动物研究中的等价缩放med的剂量。应理解如果耐受，则更高的剂量预计是有利的。
[0432]
由于早发型mld的标记在于一旦症状出现，就非常快速的病程，因此执行研究以允许基于研究者对于该受试者的利益-风险评价，在队列1(低剂量)和队列2(高剂量)中的第一个患者给药后30天受试者的同时入选。在这种情况下，队列中的第二个患者和第三个患者之间的给药窗口将为至少24小时，以观察患者的急性毒性、过敏反应和程序有关事件。鉴于该疾病的罕见性，两个受试者同时出现用于治疗的概率被认为很低。所提议方法的基本原理在于，因为患者经历快速的疾病进展而错过治疗窗口的风险，将超过在队列中的下一个患者给药前的延长安全性随访的潜在益处。其中患者在入选和治疗之间经历显著疾病进展的此类情形被引证为在用hsc-gt治疗的一些早发型mld患者中观察到的不良结果的可能原因(sessa等人，2016)，这突出强调了处于疾病快速进展的风险中的患者的及时鉴定和治疗的必须性。
[0433]
通过arsa酶缺陷引起的早发型(晚期婴儿型或早期幼年型)mld的儿科患者(≥4个月)代表了具有最高的未满足需求的群体。入选我们提议的fih试验的那些mld患者可能具有0/0(两个无效arsa等位基因，其中不产生可检测的功能酶)，或0/r(关于一个无效arsa等
位基因和一个“残留”arsa等位基因(r)(其编码具有残留功能活性的酶，所述酶仍然可以降解少量的硫苷脂)的杂合性)基因型。他们展示毁灭性的病程，具有运动和认知损害两者的快速且可预测的下降，导致在疾病发作后几年内的死亡。疾病修正治疗对于大多数早发型患者是不可用的。造血干细胞移植(hsct)在这个群体中并未提供益处，而造血干细胞伴基因疗法(hsc-gt)是调查研究治疗，其仅在症状出现之前的患者中是有效的，所述患者构成早发型群体的一小部分。
[0434]
主要终点评价aav.cb7.ci.harsaco.rbg的安全性和耐受性。次要或探索性终点包括药代动力学和药效学性质(转基因表达、生物标记物活性和成像参数)和临床功效结果(粗大和精细运动功能、认知和语言发展、神经系统检查结果、行为和里程碑发展、以及父母报告的结果和生活质量评价)。选择功效终点和随访时机，以测量疾病进展的预防或稳定。
[0435]
因此，在我们提议的fih试验中，将胆囊病理状态作为安全性信号和探索性终点两者进行监测。
[0436]
通过以下的评估来评价直到单次icm剂量施用之后24个月，aav.cb7.ci.harsaco.rbg的安全性和耐受性：ae和sae、生命体征和体格检查、神经系统检查、心电图(ecg)、感觉神经传导研究(用于评估drg毒性)、实验室评价(血清化学、血液学、凝血研究、肝功能测试[lft]、尿分析以及csf化学和细胞学)、和/或载体和转基因产物的免疫原性。
[0437]
如通过异染性脑白质营养不良的粗大运动功能分类(gmfc-mld)测量的，评价aav.cb7.ci.harsaco.rbg对直到治疗后2年的粗大运动功能的作用。
[0438]
aav.cb7.ci.harsaco.rbg功效的另外测量包括下述：
[0439]
基于下述终点来评价在单次icm剂量施用之后2年内，aav.cb7.ci.harsaco.rbg的药效学和生物活性：csf和血清中的arsa水平；
[0440]
如通过以下测量的，评价直到单次icm剂量施用之后2年，aav.cb7.ci.harsaco.rbg的功效：粗大运动功能测量(gmfm)，神经认知(通过贝利婴儿发育量表[bsid-iii]，韦氏儿童智力量表，第五版[wisc-v]测量的总智商[iq]和子域iq)，存活，神经系统临床检查(nce)，尺神经、腓深神经、正中神经、腓肠神经的ncv，通过成就年龄、丧失年龄、以及维持或获得运动里程碑的儿童百分比评价的运动里程碑成就(如通过世界卫生组织[who]标准定义的)；
[0441]
如通过以下测量的，进一步评价直到单次icm剂量施用之后2年，aav.cb7.ci.harsaco.rbg的功效：通过癫痫发作日记记录的发病年龄和癫痫发作频率，文兰适应行为量表，第三版(文兰-iii)，lansky表现指数，儿童生活质量量表(pedsql和pedsql-is)，护理人员/父母生活质量；
[0442]
如通过以下测量的，进一步评价直到单次icm剂量施用之后2年，aav.cb7.ci.harsaco.rbg的药效学效应：如通过mri测量的cns髓鞘形成(脱髓鞘负载和模式)和白质萎缩，如通过质磁共振波谱(mrs)测量的神经元代谢物n-乙酰天冬氨酸(naa)、肌醇(mi)、胆碱(cho)和乳酸(lac)水平，csf硫苷脂和溶血硫苷脂水平，视觉诱发电位(vep)，脑干听觉诱发反应(baer)，胆囊壁增厚的超声评估。
[0443]
纳入标准包含下述：
[0444]
(i)基于低于正常范围的arsa活性和两个引起疾病的arsa等位基因(已知或新型
突变)的鉴定，记录的mld的生物化学和分子诊断。在新型突变的情况下，24小时尿收集必须显示升高的硫苷脂水平；
[0445]
(ii)≥4个月；
[0446]
(iii)症状出现之前的受试者必须具有以下任一种：
[0447]
其症状发作年龄《7岁的受mld影响的年长同胞(先证者)。基于先证者中的症状发作年龄及其arsa基因型，如下将受试者分类为晚期婴儿型、早期幼年型、或中晚期婴儿型/早期幼年型：晚期婴儿型：先证者中的症状发作≤30个月，且基因型通常为0/0；早期幼年型：先证者中的症状发作》30个月且《7岁，具有通常为0/r的基因型；中晚期婴儿型/早期幼年型：先证者中的症状发作《7岁，但不能明确地将先证者表征为晚期婴儿型或早期幼年型
[0448]
或者
[0449]
如果在没有年长患病同胞的情况下，在症状出现之前的儿童中诊断了mld(例如，偶然或经由新生儿筛查(当可用时))，则全部可用数据强烈提示受试者患有很可能受益于基因疗法的早发型mld变体，且受试者《7岁，则在通过发起人医学监察员(sponsor medical monitor)讨论和批准后，受试者可以被视为合格的；
[0450]
(iv)有症状的晚期婴儿型受试者是合格的，条件是他们具有通过以下体现的轻度的mld临床或神经系统表现：
[0451]
预计的运动里程碑成就的延迟，例如在实现独立站立或行走上的延迟(在who里程碑范围上》第95百分位数)
[0452]
和/或
[0453]
在nce时的轻度异常包括但不限于张力增加、痉挛或反射亢进。如果受试者已实现了独立行走，则轻度共济失调的体征是可接受的，条件是受试者可以独立行走至少10步；
[0454]
(v)如果有症状的早期幼年型受试者在nce时具有轻度/中度异常，包括但不限于张力增加、痉挛、反射亢进或轻度步态异常，不需要步行辅助，则他们是合格的；
[0455]
(vi)父母/监护人签署并注明日期的知情同意书。
[0456]
淘汰标准包含下述：
[0457]
所达到的运动里程碑退化的证据；
[0458]
需要辅助用于行走的可走动受试者；
[0459]
基于总iq《70，具有认知缺陷的ej mld受试者；
[0460]
不能归于mld的任何临床上显著的神经认知缺陷，在研究者看来，所述神经认知缺陷可能混淆研究结果的解释；
[0461]
具有关于人免疫缺陷病毒(hiv)或丙型肝炎(hepc)的阳性检测结果的患者；
[0462]
任何当前或先前的状况或体格检查或实验室测试发现，在研究者看来，所述发现使受试者处于不当风险中、或者干扰研究产品安全性或功效结果的评估和解释；
[0463]
icm施用程序的任何禁忌症，包括荧光透视成像的禁忌症；
[0464]
mri或lp的任何禁忌症；
[0465]
在筛选前4周内或在该临床研究中使用的调查研究产品的5个半衰期内(以较长者为准)，入选具有调查研究产品的任何其它临床研究；
[0466]
先前已经历同种异体hsct，并且具有供体起源的残留细胞的证据；
[0467]
先前的基因疗法。
[0468]
下文详细描述了施用途径和程序。
[0469]
在第0天时，经由实时ct引导的枕下注射到大池内，将aav.cb7.ci.harsaco.rbg作为单一剂量施用于住院受试者。
[0470]
在第0天时，通过与研究相关的调查研究药房制备了含有5.6ml适当滴度的aav.cb7.ci.harsaco.rbg的注射器，并且递送到操作室。
[0471]
在研究药物施用之前，将受试者麻醉、插管，并且使用无菌技术准备且覆盖注射部位。执行lp以去除预定体积的csf，这之后it注射碘造影剂，以帮助显现大池的相关解剖结构。作为it造影剂的替代方案，可以在针插入之前或期间施用iv造影剂。使用iv或it造影剂的决定由执行该程序的介入医师自行判断。在ct荧光透视引导下，将脊椎针(22-25g)推进到大池内。较大的导引针可以用于帮助针放置。在针放置确认后，将延长套件附接到脊椎针，并允许充满csf。由介入医师自行判断，可以将含有造影材料的注射器连接到延长套件，并且注射少量以确认针放置在大池中。在确认针放置后，将含有aav.cb7.ci.harsaco.rbg的注射器连接到延长套件。注射器内容物经过1-2分钟缓慢注入，递送5.0ml的体积。
[0472]
执行了安全性评价，其包括不良事件(ae)和严重不良事件(sae)的收集、体格检查和神经系统检查、生命体征、临床实验室测试(血清化学、血液学、凝血、lft、尿分析)、ecg、神经传导研究、以及csf细胞学和化学(细胞计数、蛋白质、葡萄糖)。在队列1中的前三个受试者之后以及在队列2中的前三个受试者之后进行安全性评估。
[0473]
对于次要终点和探索性终点执行统计比较。当对于每个终点可用时，在每个时间点的测量与关于每个受试者的基线值，以及来自年龄匹配的健康对照的数据和来自具有可比队列特性的mld患者的自然史数据进行比较。
[0474]
所有数据都呈现在受试者数据列表中。分类变量使用频率和百分比进行概括，并且连续变量使用描述性统计(非缺失观察的数目、平均值、标准差、中值、最小值和最大值)进行概括。适当时呈现图形显示。
[0475]
实施例11-aavhu68+脱酰胺。
[0476]
就修饰对aavhu68进行分析。简言之，aavhu68载体使用与这项研究无关的载体基因组产生，各自使用在293细胞中的常规三重转染方法产生。关于这些技术的一般描述，参见例如，bell cl等人，the aav9 receptor and its modification to improve in vivo lung gene transfer in mice.j clin invest.2011；121:2427
–
2435。简言之，编码侧翼为aav2反向末端重复的待包装序列(由鸡β肌动蛋白启动子、内含子和衍生自猿猴病毒40(sv40)晚期基因的polya表达的转基因)的质粒，通过用编码aav2 rep基因和aavhu68cap基因的质粒以及腺病毒辅助质粒(padδf6)三重转染hek293细胞进行包装。所得到的aav病毒颗粒可以使用cscl梯度离心进行纯化、浓缩且冷冻用于以后使用。
[0477]
变性和烷基化：向100μg解冻的病毒制剂(蛋白质溶液)中，加入2μl 1m二硫苏糖醇(dtt)和2μl 8m盐酸胍(gndhcl)，并且在90℃下温育10分钟。允许溶液冷却至室温，然后加入5μl新鲜制备的1m碘乙酰胺(iam)，并且在室温下在黑暗中温育30分钟。在30分钟后，通过加入1μl 1m dtt来猝灭烷基化反应。
[0478]
消化：向变性蛋白质溶液中，加入20mm碳酸氢铵，ph 7.5-8，其体积将最终的gndhcl浓度稀释至800mm。添加胰蛋白酶溶液用于1:20的胰蛋白酶/蛋白质比，并且在37℃下温育过夜。在消化后，将tfa加入至最终的0.5％，以猝灭消化反应。
[0479]
质谱法：通过uhplc-ms/ms分析大约1微克的组合的消化混合物。在ultimate 3000rslcnano system(thermo scientific)上执行lc。流动相a是具有0.1％甲酸的milliq水。流动相b是具有0.1％甲酸的乙腈。lc梯度在15分钟内从4％b运行到6％b，然后运行到10％b共25分钟(总共40分钟)，然后运行到30％b共46分钟(总共86分钟)。将样品直接加载到柱中。柱尺寸为75cm x 15um i.d，并且装有2微米c18培养基(acclaim pepmap)。lc经由使用来源的nanoflex电喷雾电离，与四极杆orbitrap质谱仪(q-exactive hf，thermo scientific)进行相互作用。将柱加热至35℃，并且施加2.2kv的电喷雾电压。质谱仪被编程为获得来自前20种离子的串联质谱。全ms分辨率为120,000，且ms/ms分辨率为30,000。标准化的碰撞能量设定为30，自动增益控制设定为1e5，最大填充ms设定为100ms，最大填充ms/ms设定为50ms。
[0480]
数据处理：通过biopharma finder 1.0(thermo scientific)分析质谱仪原始数据文件。简言之，所有搜索都需要10ppm前体质量耐受性，5ppm片段质量耐受性，胰蛋白酶切割，最多1个缺失切割，半胱氨酸烷基化的固定修饰，甲硫氨酸/色氨酸氧化、天冬酰胺/谷氨酰胺的脱酰胺、磷酸化、甲基化和酰胺化的可变修饰。
[0481]
在下表中，t指胰蛋白酶，而c指胰凝乳蛋白酶。
[0482]
[0483]
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