1.本实用新型涉及细胞染色试剂，尤其涉及一种细胞间质苏木素-伊红染色试剂盒。


背景技术：

2.肿瘤间质由癌症相关的成纤维细胞、内皮细胞、淀粉样细胞、周细胞、淋巴细胞和细胞外基质组成。在肿瘤的生长过程中，肿瘤微环境起到了重要的作用。成纤维细胞、内皮细胞、炎症细胞、周皮细胞及细胞外基质等肿瘤间质都对肿瘤的生物学行为 (生长、浸润、转移等)起到了决定性的作用。
3.肿瘤间质比(tumor-stroma ratio，tsr)即肿瘤组织内肿瘤细胞与间质部分的比例，既往多项研究表明：tsr是乳腺癌、宫颈癌及食管癌等多种恶性肿瘤患者预后的独立预测因素。
4.目前研究中对肿瘤间质比的评估主要是对术后病理切片进行染色，然后通过有经验的病理学家人工计算tsr值。其中苏木素-伊红(he)染色由于易操作、低成本而成为常用的染色方法。其是依据组织或细胞的不同成分对碱性染料(苏木素)和酸性染料(伊红)的亲和力不同及染色性质不一样的原理进行染色的，由酸性物质组成的细胞核等被苏木素染成鲜明的蓝紫色，而含有碱性物质的细胞浆、肌纤维、胶原纤维等各种不同成分又呈现出深浅不同的红色。但是通过人工计算tsr值会使结果具有非常大的不确定性和不可重复性，目前多以10％为取值区间，而40％～60％范围内的tsr 计算是评估的难点，采用数字化图像分析设备会大大地提高tsr评估的准确性。
5.因此，设计专用于数字化图像分析设备的he染色试剂盒以便使实验流程更方便、快捷成为一种趋势。


技术实现要素：

6.为实现上述目的，本实用新型提供了一种细胞间质苏木素-伊红染色试剂盒，包括盒体、苏木素染液试剂瓶、分化液试剂瓶、伊红染液试剂瓶、载玻片和盖玻片，以及具有三个卡位槽、若干第一嵌槽和若干第二嵌槽的固定部件，所述固定部件可拆卸或不可拆卸地设置于盒体内，前述三个试剂瓶分别被三个所述卡位槽所固定，所述载玻片和所述盖玻片采用多片组合包装，分别放置在所述第一嵌槽和所述第二嵌槽内。
7.进一步，所述苏木素染液的主要成分包括苏木素，所述伊红染液的主要成分包括曙红，所述分化液的主要成分包括乙醇和盐酸。
8.优选地，三个试剂瓶中的试剂储量均相等；进一步优选地，所述三种试剂瓶均为白色或乳白色试剂瓶。
9.进一步，所述载玻片和所述盖玻片的数量与前述三种试剂储量相匹配，可一起放置在一个嵌槽内，也可分组放置在多个嵌槽内。
10.优选地，所述多片组合包装为5片或10片组合包装。
11.优选地，所述固定部件由轻质的抗震材料制成，用于防撞、防移位且方便拿取，其
材料可选自泡沫塑料、空心纸板、海绵等。
12.在一些实施方式中，固定部件由脆性抗震材料(如泡沫塑料)制成，固定部件可拆卸，其横截面外轮廓与盒体横截面内轮廓的形状大小相同或比其略小(缝隙小于1 mm)，略小的轮廓使固定部件容易放入盒体，但不易发生位移；三个所述卡位槽的直径分别与其对应试剂瓶的直径相同或略大(缝隙小于1mm)，略大的直径使试剂瓶易放入卡位槽，但不易发生位移。
13.在一些实施方式中，固定部件由柔性的可变形材料(如海绵)制成，固定部件的横截面外轮廓与盒体横截面内轮廓的形状大小相同或比其略大(可变形材料完全抵住盒体，但不发生肉眼可见的形变)，三个所述卡位槽的直径与其对应试剂瓶的直径相同或略小(可变形材料完全抵住盒体，但不发生肉眼可见的形变)，使盒体与固定部件之间、固定部件与试剂瓶之间可通过挤压力、摩擦力来达到相对固定的目的。
14.在一些实施方式中，所述固定部件的高度不超过试剂瓶高度的二分之一或三分之一，这样便于试剂瓶的拿取。在另一些实施方式中，所述固定部件的高度超过试剂瓶高度的三分之二，这样使试剂瓶不易脱出卡位槽。
15.在一些实施方式中，三个所述卡位槽并排设置；由于在进行细胞间质苏木素-伊红染色时，需要将三种试剂分别倒入三个染缸内，实验过程中需要将切片样本依次置入三个染色缸内浸泡，因此并排的的设计可便于实验人员依次拿出倾倒试剂。优选地，所述苏木素染液试剂瓶、所述分化液试剂瓶和所述伊红染液试剂瓶依次放置在三个卡位槽内，使其按照实验步骤的先后顺序排列便于操作。
16.优选地，所述苏木素染液试剂瓶、所述分化液试剂瓶和所述伊红染液试剂瓶为相同试剂瓶，所述试剂瓶的直径优选为4～7cm，高度优选为8～18cm。
17.优选地，所述试剂瓶为广口瓶，即试剂瓶去掉瓶盖后，开口处的直径不小于瓶体直径的80％，以便于试剂的倾倒。
18.优选地，所述试剂瓶的材质为耐酸、耐碱的塑料。
19.可选地，所述卡位槽为通孔或凹槽。
20.优选地，所述试剂盒内的底面还设置有抗震底垫，该抗震底垫的材料可与固定部件相同或不同。
21.优选地，所述固定部件为双层结构。
22.在一些实施方式中，所述固定部件的高度为4～8cm或8～12cm。
23.在一些实施方式中，所述固定部件为一体式的双层纸板，下层纸板无孔，上层纸板具有三个作为卡位槽的通孔以及若干所述第一嵌槽和若干所述第二嵌槽；这种设计使三种试剂瓶可方便地同时取出。
24.在另一些实施方式中，所述固定部件为双层泡沫塑料板，设置于盒体内的底部，且都具有三个对应的作为卡位槽的通孔，上层泡沫塑料板还具有若干所述第一嵌槽和若干所述第二嵌槽，这种设计可方便地分别取出三种试剂瓶，双层泡沫塑料板较单层板(包括厚度与双层板相同的单层板)在运输过程中不易脱出卡位槽。
25.在又一些实施方式中，所述固定部件为双层泡沫塑料板，上层泡沫塑料板具有三个作为卡位槽的通孔以及若干所述第一嵌槽和若干所述第二嵌槽，下层泡沫塑料板具有三个对应的作为卡位槽的凹槽，可作为底垫使用，同时也起到固定试剂瓶的作用。
26.由于医院病理切片染色数量较大，因此本试剂盒在设计包装规格时既要考虑拿取方便，又要考虑尽可能地满足样本数量，病理科浸泡切片的染缸一般可同时用于5片病理切片，需要50ml的试剂，即每份切片样本需要10ml试剂，所以本试剂盒中的各试剂可采用10份、15份、20份、25份或30份病理切片的量为一包装，相应地，各试剂瓶内所储的试剂量优选为100～150ml、150～200ml、200～250ml、250～300ml 或300～350ml。
27.为了减小试剂盒的横截面面积，所述嵌槽为侧插式设计，所述载玻片竖向或横向侧插入所述第一嵌槽内，而非平躺放置，所述盖玻片为正方形，则可任意方向侧插入所述第二嵌槽内。嵌槽的尺寸正好可放置一组或多组包装的载玻片或盖玻片，使其不可移动。
28.在一些实施方式中，三个所述卡位槽并排设置，所述第一嵌槽和所述第二嵌槽成对出现，数量为多对，与所述卡位槽平行或交替设置。在另一些实施方式中，三个所述卡位槽分两排设置(如呈三角形布局)，多对第一嵌槽和第二嵌槽，集中或分散设置在卡位槽之间的空当处，如卡位槽和嵌槽间隔排布，这样使重量更分散，试剂盒整体不易侧倾。
29.进一步，所述细胞间质苏木素-伊红染色试剂盒还包括封固剂试剂瓶。所述固定部件还具有用于固定封固剂试剂瓶的卡位槽。优选地，所述封固剂为中性树脂，如eukitt。
30.进一步，所述细胞间质苏木素-伊红染色试剂盒还包括无水乙醇试剂瓶、乙醇溶液试剂瓶、二甲苯试剂瓶中的任意一个或多个；优选地，其中的各试剂储量为所述苏木素染液试剂瓶储量的两倍，或者各试剂储量与所述苏木素染液试剂瓶储量相同，但各试剂的试剂瓶数量是所述苏木素染液试剂瓶数量的两倍。相应地，所述固定部件内还设置有用于固定这些辅助试剂试剂瓶的卡位槽。
31.优选地，所述乙醇溶液试剂瓶有两个以上，所述乙醇溶液选自70％～95％乙醇溶液中的两种以上。在一些实施方式中，所述乙醇溶液包括80％乙醇溶液和95％乙醇溶液。
32.在一些实施方式中，所述无水乙醇试剂瓶、乙醇溶液试剂瓶、二甲苯试剂瓶和所述苏木素染液试剂瓶、分化液试剂瓶、伊红染液试剂瓶设置在一个盒体中。在另一些实施方式中，所述无水乙醇试剂瓶、乙醇溶液试剂瓶、二甲苯试剂瓶和所述苏木素染液试剂瓶、分化液试剂瓶、伊红染液试剂瓶设置在不同盒体中，或者所述无水乙醇试剂瓶、乙醇溶液试剂瓶、二甲苯试剂瓶设置在另一更大的盒体中，该更大的盒体可容纳并放置含所述苏木素染液试剂瓶、分化液试剂瓶、伊红染液试剂瓶的盒体。
33.进一步，所述无水乙醇试剂瓶、乙醇溶液试剂瓶、二甲苯试剂瓶所在的试剂盒内也具有与前述设计相同的固定部件，当无水乙醇试剂瓶、乙醇溶液试剂瓶、二甲苯试剂瓶与苏木素染液试剂瓶、分化液试剂瓶、伊红染液试剂瓶共用同一个盒体时，所述固定部件也为一体，当它们分开放置在不同盒体中时，所述固定部件也为分体。
34.在一些实施方式中，无水乙醇试剂瓶、95％乙醇溶液试剂瓶、80％乙醇溶液试剂瓶和二甲苯试剂瓶的卡位槽呈两排、三排或四排设计，优选与前述三个试剂瓶的卡位槽的排列相平行。
35.进一步，本实用新型所述试剂盒还包括使用说明书。
36.优选地，本实用新型所述试剂盒的保存温度为10～30℃。
37.进一步，本实用新型所述试剂盒特别适用于数字病理扫描分析系统肿瘤间质比分析。优选地，所述数字病理扫描分析系统具有可通过训练机器学习算法从而对图像进行分析的功能。
38.在本实用新型的一种较佳实施方式中，所述试剂盒的使用方式包括如下步骤：
39.1)脱蜡：用二甲苯浸泡脱蜡，然后依次用无水乙醇、95％乙醇、80％乙醇、水浸泡洗涤；
40.2)染色：依次用苏木素染液浸泡染色，用分化液浸泡分化，用流水冲洗，用80％乙醇浸泡，用伊红染液浸泡染色；
41.3)脱水：依次用80％乙醇、95％乙醇、无水乙醇浸泡脱水；
42.4)透明：用二甲苯浸泡使其透明；
43.5)封固：用封固剂封固。
44.本实用新型采用苏木素-伊红(he)对组织切片进行细胞间质染色，苏木素-伊红染色液主要依据组织或细胞的不同成分对碱性染料(苏木素)和酸性染料(伊红)的亲和力不同及染色性质不一样，因此细胞或组织切片经苏木素-伊红染色液染色后，主要由酸性物质组成的细胞核等被苏木素染成鲜明的蓝紫色，而含有碱性物质的细胞浆、肌纤维、胶原纤维等各种不同成分又呈现出深浅不同的红色。如肌肉纤维为深红色，红细胞为橙红色，钙为深蓝色，粘蛋白为灰蓝色。但上述的这些颜色差异非常细微，通过肉眼很难准确识别并定量，因此，在数字病理扫描分析系统的帮助下可以实现肿瘤细胞间质的精确定量，并计算肿瘤组织中肿瘤细胞与间质部分的比例，可用于肿瘤预后评估和治疗药物筛选。
45.上述颜色名称只是举例说明颜色差异，并非绝对颜色，在实际情况中结果可能会有主观或客观上的误差，但这不影响通过色差结合形态来区分细胞核、细胞质、细胞间质各组分的技术原理。
46.本实用新型的细胞间质苏木素-伊红染色试剂盒结构简单、布局合理、取用方便，固定部件可拆卸，试剂瓶不易脱出移位，且按照医院病理科的使用习惯来确定包装规格，方便大批样本的同时操作，也有全套试剂和耗材的可选包装，医生可根据实际需要进行选择。
47.以下将结合附图对本实用新型的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本实用新型的目的、特征和效果。
附图说明
48.图1是实施例1中所述试剂盒的结构示意图；
49.图2是实施例2的固定部件和试剂瓶的正面结构示意图；
50.图3是实施例3的固定部件和试剂瓶的正面结构示意图；
51.图4是实施例4的固定部件第一嵌槽和第二嵌槽的侧剖面结构示意图；
52.图5是实施例4的固定部件俯视结构示意图；
53.图6是实施例5的固定部件和试剂瓶的俯视结构示意图；
54.1-盒体、2-试剂瓶、21-苏木素染液试剂瓶、22-分化液试剂瓶、23-伊红染液试剂瓶、24-无水乙醇试剂瓶、25-95％乙醇溶液试剂瓶、26-80％乙醇溶液试剂瓶、27-二甲苯试剂瓶、28-封固剂试剂瓶、3-固定部件、31-卡位槽、32-上层泡沫塑料板、33-下层泡沫塑料板、34-上层纸板、35-下层纸板、36-第一嵌槽、37-第二嵌槽。
具体实施方式
55.下面详细描述本实用新型的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始
至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本实用新型，而不能理解为对本实用新型的限制。
56.在本实用新型的描述中，需要理解的是，术语“中间”、“纵向”、“横向”、“长度”、“宽度”、“厚度”、“上”、“下”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“底”“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或部件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本实用新型的限制。
57.此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定，“若干”的含义是不确定的数量，可以为一个，也可以为两个或两个以上。
58.实施例1
59.图1所示为本实用新型的一种实施方式，如图所示，细胞间质苏木素-伊红染色试剂盒包括盒体1、试剂瓶2、固定部件3，在固定部件3中设置有卡位槽31、第一嵌槽 36和第二嵌槽37，卡位槽为开设在固定部件3内的三个圆形通孔，其中放置三个试剂瓶：苏木素染液试剂瓶21、分化液试剂瓶22和伊红染液试剂瓶23，三个试剂瓶中的试剂量均相等，为250ml，可用于20份的病理切片染色。第一嵌槽36用于放置多片组合包装的载玻片，本实施例中的载玻片长边横向摆放并侧插入第一嵌槽36内，第二嵌槽37用于放置多片组合包装的盖玻片，盖玻片也是侧插入第二嵌槽37内，载玻片的盖玻片数量相等，包装规格相同，第一嵌槽36与第二嵌槽37成对出现，且与试剂瓶2交替设置成一排。固定部件3可拆卸或不可拆卸地设置于盒体1内，其由泡沫塑料制成，外轮廓比盒体内轮廓略小，可拆卸的情况下无论是装入还是拿出都较方便，且几乎不会在水平方向上移动，三个试剂瓶的卡位槽的直径比试剂瓶的直径略大，固定部件的高度为4～8cm，使试剂瓶便于拿取，但又不容易从卡位槽中脱出。三个试剂瓶的直径为4～7cm，高度为8～18cm，且试剂瓶为广口瓶，便于倾倒。本实用新型中的三个试剂瓶均可为白色或乳白色常规塑料试剂瓶，无需使用棕色试剂瓶。
60.实施例2
61.本实用新型固定部件的另一种实施方式，如图2所示，其中固定部件3由可分离的上下两层泡沫塑料板组成，其中上层泡沫塑料板32内的卡位槽为圆形通孔，此外还设置有第一嵌槽36和第二嵌槽37，它们的排布和实施例1中相同，下层泡沫塑料板 33内的卡位槽为圆形凹槽，下层泡沫塑料板33既可以起到固定作用，又可以起到抗震作用，也可视为底垫，固定部件分两层的好处是：运输过程中如遇跳动，下层可抗震，上层会随试剂瓶一起发生向上的位移，但是由于卡位槽的作用使试剂瓶之间不发生位移，回落时更容易回到原来的位置。上下两层泡沫塑料板的总高度为4～9cm，在其它的实施方式中，底垫内也可以没有卡位槽。图2中三种试剂瓶从左到右依次为苏木素染液试剂瓶21、分化液试剂瓶22和伊红染液试剂瓶23，这是按照实验操作步骤来排布的试剂瓶。
62.实施例3
63.如图3所示，在本实用新型的第三种实施方式中，固定部件为一体式的双层纸板，
上层纸板34，设置有试剂瓶的卡位槽，下层纸板35没有，上层纸板的高度超过试剂瓶高度的三分之二，在上层纸板34上还连接有第一嵌槽36和第二嵌槽37，所述第一嵌槽36和第二嵌槽37也是由纸板制成，为中空的长方体或正方体，其内分别放置多片组合包装的载玻片和盖玻片，其中载玻片的长边竖直方向摆放并侧插入第一嵌槽36 内，盖玻片也是侧插入第二嵌槽37内，且载玻片和盖玻片正好卡在嵌槽内，不易脱出，这种设计使三种试剂瓶和耗材可方便地同时取出。在某些实施方式中，上层纸板34 和下层纸板35之间还填充有海绵、泡沫塑料、纸团等抗震材料。在另一些实施方式中，该固定部件具有与图3中类似的结构，不是双层纸板，而是高度为6～12cm的泡沫塑料或海绵，那么试剂瓶的下部以及嵌槽在图中为不可视，卡位槽可以为通孔或凹槽，这种实施方式可以更有效地防止试剂瓶脱出。
64.实施例4
65.如图4和图5所示为本实用新型的第四种实施方式，与前述实施例不同，本实施例中的第一嵌槽36和第二嵌槽37单独排成一排，与试剂瓶的三个卡位槽31相平行，所述第一嵌槽36和所述第二嵌槽37也是成对出现，载玻片长边竖直方向侧插入第一嵌槽36内，盖玻片也是竖直方向侧插入第二嵌槽37内，图中为20份样本包装的试剂盒结构优选实施例，共4组第一嵌槽36和第二嵌槽37，每组嵌槽内放置5对载玻片和盖玻片，5片载玻片为一独立包装，5片盖玻片为一组独立包装，嵌槽的大小以正好容纳一组载玻片或盖玻片为宜，使玻片不易从嵌槽内脱出。
66.实施例5
67.如图6所示为本实用新型的又一种实施方式，固定部件3上设置了更多的卡位槽 31，用于摆放苏木素染液试剂瓶21、分化液试剂瓶22、伊红染液试剂瓶23、无水乙醇试剂瓶24、95％乙醇溶液试剂瓶25、80％乙醇溶液试剂瓶26、二甲苯试剂瓶27以及封固剂试剂瓶28，此外固定部件3上还设置有多对第一嵌槽36和第二嵌槽37，图中可见试剂瓶卡位槽31与成对的第一嵌槽36和第二嵌槽37在两排的位置上交替设置，此外在其它空当部位还设置有成对的第一嵌槽36和第二嵌槽37，图中下面两排卡位槽31是四个直径稍大的卡位槽，可以放置容量是苏木素染液试剂瓶21两倍的四个辅助试剂的试剂瓶，即无水乙醇试剂瓶24、95％乙醇溶液试剂瓶25、80％乙醇溶液试剂瓶26、二甲苯试剂瓶27，在它们中间还放置有封固剂试剂瓶28。本实施例中的试剂盒可满足肿瘤切片间质比数字病理扫描分析的全部流程所需。
68.实施例6石蜡切片的制作
69.1.1将手术取下的肿瘤组织块浸于固定液中使组织、细胞的蛋白质变性凝固，以防止细胞死后的自溶或细菌的分解，从而保持细胞本来的形态结构。
70.1.2在由低浓度到高浓度的酒精中浸泡进行脱水，逐渐脱去组织块中的水分，再将组织块置于二甲苯中透明。
71.1.3将已透明的组织块置于已溶化的石蜡中，放入溶蜡箱保温。待石蜡完全浸入组织块后进行包埋：将已浸透石蜡的组织块放入已溶化的石蜡中，冷却凝固成块。
72.1.4将包埋好的蜡块固定于切片机上，切成薄片，厚度为4～6μm，放到热水中烫平，再贴到载玻片上，放入恒温箱中烘干或在加热装置上烤干。
73.实施例7细胞间质苏木素-伊红染色过程及结果
74.一、脱蜡
75.1.1烘干或烤完的切片依次放入二甲苯ⅰ(脱蜡1缸)、二甲苯ⅱ(脱蜡2缸)中脱蜡15分钟。脱蜡时间长短取决于石蜡是不是彻底溶解，气温低可延长时间，气温高可适当缩短时间。
76.1.2依次放入无水乙醇、95％乙醇、80％乙醇中各2分钟。
77.1.3放入水中2～3分钟，洗去乙醇。
78.二、染色
79.2.1放入苏木素染液中浸染15分钟，流水冲洗1～2分钟。
80.2.2在分化液中分化5秒，使切片褪色至淡蓝红色。分化的作用是使细胞浆蓝色脱去，而细胞核更加清晰、鲜丽。分化不足时，胞浆带蓝，胞核过染；分化过度时，胞核太淡，难以辨认，可再退回苏木素染液，延长一定时间。
81.2.3流水冲洗10分钟，使组织呈鲜蓝色或天蓝色(蓝化)。
82.2.4把载玻片先放入80％乙醇中浸泡5秒钟，再在伊红染液中浸染1分钟，无需水洗。
83.三、脱水
84.3.1 80％乙醇中脱水30秒，如在乙醇中褪色很快时，可返回伊红染液中复染。
85.3.2 95％乙醇i、ii中脱水，分别为1分钟、2分钟。
86.3.3无水乙醇i、无水乙醇ii各2分钟。
87.四、透明
88.4.1二甲苯ⅰ、二甲苯ⅱ中透明各2分钟。
89.五、封固
90.5.1用eukitt封固。
91.六、结果
92.将染色后的组织载玻片置于数字病理扫描分析系统显微镜下，进行扫描、图像选取、图像处理、间质比分析。染色后的切片组织图像中细胞核被染为蓝色或黑色，细胞质被染为粉红色或紫粉色，肌肉纤维被染为深红色，钙被染为深蓝色，粘蛋白被染为灰蓝色。
93.以上详细描述了本实用新型的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本实用新型的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本实用新型的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。