1.本发明涉及微生物技术领域，具体而言，涉及一种降低不同菌株间拮抗作用的方法和复合菌剂的制备方法。
背景技术：
2.随着目前畜牧业的全面禁抗，微生态制剂越来越受到人们的关注，而微生态制剂一般分为单一菌种和复合菌种，由于肠道微生态系统复杂，单一菌种较难发挥作为，目前的微生态制剂多以复合菌种为主，例如采用芽孢杆菌、酵母菌、放线菌、乳杆菌、肠球菌、双歧杆菌中的至少两种进行复合发酵。在复合菌发酵时，由于两种菌之间容易产生拮抗作用，两种菌互相抑制生长繁殖而影响菌剂质量和发酵效果等。
3.具体来说，例如枯草芽孢杆菌和嗜酸乳杆菌是微生态复合菌剂中两种常用的益生菌，枯草芽孢杆菌有着极强的抗逆性，同时能合成淀粉酶、蛋白酶及多种抑菌活性物质；嗜酸乳杆菌作为胃和肠道中主要的益生菌，在胃中有着较高的存活率，同时其能产生乳酸、醋酸及抗生素类物质。枯草芽孢杆菌和嗜酸乳杆菌功能互补，且均有较强的抗逆性，不仅应用于后期复配的复合菌剂，也经常在发酵豆粕等固体发酵料中作为主要的菌种使用。
4.然而由于枯草芽孢杆菌和嗜酸乳杆菌之间容易产生拮抗作用，复合菌剂配置后容易因为拮抗作用导致菌量下降，而发酵料中更容易因为两种菌的拮抗作用大大影响发酵效果。
5.在复合菌剂发酵中类似于枯草芽孢杆菌和嗜酸乳杆菌这两种容易产生拮抗作用的菌株还有很多，目前对于这类菌株间的拮抗作用没有很好的解决方法，多以工艺调控来使两种菌的菌量趋向于平衡，导致不仅发酵时发酵效果受到影响，发酵结束后的产品中的菌量的下降速度也会变快。鉴于此，特提出本发明。
技术实现要素：
6.本发明的目的在于一种提供降低不同菌株间拮抗作用的方法和复合菌剂的制备方法。
7.本发明是这样实现的：
8.第一方面，本发明提供一种降低不同菌株间拮抗作用的方法，其包括：
9.第一驯化阶段：将第一目标菌株和第二目标菌株接种至同一摇瓶中，接种多瓶，发酵培养；对其中的所述第一目标菌株和所述第二目标菌株进行活菌计数，筛选所述第一目标菌株菌量最高的摇瓶所对应的所述第二目标菌株作为第二低拮抗菌；筛选所述第二目标菌株菌量最高的摇瓶所对应的所述第一目标菌株作为第一低拮抗菌；
10.第二驯化阶段：将所述第一低拮抗菌和所述第二低拮抗菌接种至同一摇瓶中，接种多瓶，发酵培养；对其中的所述第一低拮抗菌和所述第二低拮抗菌进行活菌计数，筛选所述第一低拮抗菌的菌量最高的平板并挑取一环菌落作为第一耐拮抗菌；筛选所述第二低拮抗菌的菌量最高的平板并挑取一环菌落作为第二耐拮抗菌。
11.在可选的实施方式中，在进行所述第二驯化阶段之前，重复所述第一驯化阶段以控制传代次数为2-3代，最终筛选获得的菌作为所述第一低拮抗菌和所述第二低拮抗菌。
12.在可选的实施方式中，重复所述第二驯化阶段以控制传代次数为4-6代，最终筛选获得的菌作为所述第一耐拮抗菌和所述第二耐拮抗菌。
13.在可选的实施方式中，所述第一驯化阶段和所述第二驯化阶段的发酵培养相同，均为36-38℃，80-120r/min转速下摇瓶培养24-30小时。
14.在可选的实施方式中，所述发酵培养的培养基包括：葡萄糖18-20g/l，蛋白胨8-10g/l，酵母浸粉2-2.4g/l，氯化钠2.5-3g/l，碳酸钙1-1.2g/l，磷酸氢二钾2-2.4g/l，ph 7-7.5。
15.在可选的实施方式中，在将所述第一目标菌株和所述第二目标菌株接种至同一摇瓶中之前，先对所述第一目标菌株和所述第二目标菌株进行复壮。
16.在可选的实施方式中，对所述第一目标菌株进行复壮包括：将保存于斜面的所述第一目标菌株接种至lb肉汤培养基中，于36-38℃，180-220r/min转速下摇瓶培养24-30小时。
17.在可选的实施方式中，对所述第二目标菌株进行复壮包括：将保存于斜面的所述第二目标菌株接种至mrs肉汤培养基中，于36-38℃，静置培养24-30小时。
18.在可选的实施方式中，所述第一目标菌株为芽孢杆菌、酵母菌和放线菌中的任一种；所述第二目标菌株为乳杆菌、肠球菌和双歧杆菌中的任一种；
19.优选地，所述第一目标菌株为芽孢杆菌，所述第二目标菌株为乳杆菌；
20.优选地，所述第一目标菌株为枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌，所述第二目标菌株为嗜酸乳杆菌或植物乳杆菌。
21.第二方面，本发明提供一种复合菌剂的制备方法，其包括在对复合菌进行复配或发酵之前，先采用如前述实施方式任一项所述的降低不同菌株间拮抗作用的方法对菌进行筛选。
22.本发明具有以下有益效果：
23.通过本发明的复合菌株驯化筛选过程，筛选出来的第一耐拮抗菌和第二耐拮抗菌之间的拮抗作用显著降低，并减少发酵过程两种菌互相抑制生长繁殖的情况发生，同时不影响菌株对有害菌的抑制效果。采用筛选后的第一耐拮抗菌和第二耐拮抗菌进行复合菌剂的复配或者复合菌的发酵，可以显著提升发酵后各菌的数量，提高其复配的复合菌剂质量或用于发酵料的主要菌种的发酵效果，提升菌量，同时，极大提升了菌种存活率和保存时间，大大促进了生产活动。
附图说明
24.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
25.图1为本发明实施例1提供的降低不同菌株间拮抗作用的方法的流程图。
具体实施方式
26.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
27.本技术提供了一种降低不同菌株间拮抗作用的方法，其包括如下步骤：
28.s1、菌种复壮。
29.对具有拮抗性能的不同菌株(第一目标菌株和第二目标菌株)分别进行复壮，其中，第一目标菌株有多种选择，例如可以为芽孢杆菌、酵母菌和放线菌中的任一种；第二目标菌株也有多种选择，例如可以为乳杆菌、肠球菌和双歧杆菌中的任一种。优选地，第一目标菌株为芽孢杆菌，第二目标菌株为乳杆菌；优选地，第一目标菌株为枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌，第二目标菌株为嗜酸乳杆菌或植物乳杆菌。
30.对第一目标菌株进行复壮包括：将保存于斜面的第一目标菌株接种至装液量200ml的1l常规摇瓶(lb肉汤培养基)中，于36-38℃，180-220r/min转速下摇瓶培养24-30小时。
31.对第二目标菌株进行复壮包括：将保存于斜面的第二目标菌株接种至装液量100ml的150ml常规摇瓶(mrs肉汤培养基)中，于36-38℃，静置培养24-30小时。
32.s2、第一驯化阶段发酵培养。
33.将第一目标菌株和第二目标菌株接种至同一摇瓶中，接种多瓶，发酵培养。
34.具体来说，将复壮后的第一目标菌株和第二目标菌株的菌液，各吸取1ml转接至同一瓶装液量200ml的1l常规摇瓶中，共接种3-4瓶，于36-38℃，80-120r/min转速下摇瓶培养24-30小时。
35.其中，发酵培养的培养基为葡萄糖18-20g/l，蛋白胨8-10g/l，酵母浸粉2-2.4g/l，氯化钠2.5-3g/l，碳酸钙1-1.2g/l，磷酸氢二钾2-2.4g/l，ph 7-7.5。
36.s3、计数并筛选第一低拮抗菌和第二低拮抗菌。
37.对其中的第一目标菌株和第二目标菌株进行活菌计数，筛选第一目标菌株菌量最高的摇瓶所对应的第二目标菌株作为第二低拮抗菌；筛选第二目标菌株菌量最高的摇瓶所对应的第一目标菌株作为第一低拮抗菌。
38.具体来说，采用稀释涂布法对第一目标菌株和第二目标菌株进行活菌计数，从计数平板中，选取第一目标菌株菌量最高的摇瓶所对应的第二目标菌株平板，和第二目标菌株菌量最高的摇瓶所对应的第一目标菌株平板，从嗜酸乳杆菌平板和枯草芽孢杆菌平板上各挑取一环菌落，接种至同一瓶装液量200ml的1l常规摇瓶中，共接种3-4瓶。
39.继续按照步骤s2中的发酵培养基进行发酵培养，重复第一驯化阶段以控制传代次数为2-3代，最终筛选获得的菌作为第一低拮抗菌和第二低拮抗菌。
40.s4、第二驯化阶段发酵培养。
41.将第一低拮抗菌和第二低拮抗菌接种至同一摇瓶中，接种多瓶，发酵培养。
42.发酵培养的培养基和培养方法与步骤s2相同，具体为：将经过多次传代驯化后获得的第一低拮抗菌和第二低拮抗菌进行共同发酵培养，转接至同一瓶装液量200ml的1l常规摇瓶中，共接种3-4瓶，于36-38℃，80-120r/min转速下摇瓶培养24-30小时。其中，发酵培
养的培养基为葡萄糖18-20g/l，蛋白胨8-10g/l，酵母浸粉2-2.4g/l，氯化钠2.5-3g/l，碳酸钙1-1.2g/l，磷酸氢二钾2-2.4g/l，ph 7-7.5。
43.s5、计数并筛选出第一耐拮抗菌和第二耐拮抗菌。
44.对其中的第一低拮抗菌和第二低拮抗菌进行活菌计数；筛选第一低拮抗菌的菌量最高的平板并挑取一环菌落作为第一耐拮抗菌；筛选第二低拮抗菌的菌量最高的平板并挑取一环菌落作为第二耐拮抗菌。
45.重复第二驯化阶段以控制传代次数为4-6代，当重复第二驯化阶段时，将第一低拮抗菌的菌量最高的平板和第二低拮抗菌的菌量最高的平板分别挑取一环菌落，接种至同一瓶装液量200ml的1l常规摇瓶中，共接种3-4瓶。之后对其进行活菌计数，再次挑选、接种后共同发酵培养(发酵培养的培养基和培养条件与步骤s2相同)，重复4-6次直至第二驯化阶段完成，最终筛选获得的菌作为第一耐拮抗菌和第二耐拮抗菌。
46.筛选出来的第一耐拮抗菌和第二耐拮抗菌之间的拮抗作用显著降低，同时不影响菌株对有害菌的抑制效果，采用筛选后的第一耐拮抗菌和第二耐拮抗菌进行复合菌剂的复配或者复合菌的发酵，可以显著提升发酵后各菌的数量，同时，极大提升了保存时间和长期保存下菌的存活率，大大促进了生产活动。
47.值得注意的是，驯化过程中严格控制驯化代数，其中，第一驯化阶段代数控制为2-3代，传代次数过少则达不到驯化效果，传代次数过多则会导致其后续生产活动中对有害菌的抑制效果受到影响。第二驯化阶段代数控制为4-6代，传代次数过少则达不到驯化效果，传代次数过多则增加菌株突变、退化的可能性，影响后续的生产活动。
48.在此基础上，本技术还提供了一种复合菌剂的制备方法，其包括在对复合菌进行复配或发酵之前，先采用上述降低不同菌株间拮抗作用的方法对菌进行筛选，其中，对复合菌进行复配或发酵的具体操作方法可参阅现有技术，本技术不做具体阐述。本技术提供的复合菌剂的制备方法，对于复配的复合菌剂，复配后的菌量不会因为两种菌之间的抑制作用而大量降低，对于复合菌的发酵，也降低了发酵过程两种菌互相抑制生长繁殖的情况，提升了发酵后各菌的菌量，提高其复配的复合菌剂质量或用于发酵料的主要菌种的发酵效果，提升菌量，同时，极大提升了菌种存活率和保存时间大大促进了生产活动。
49.以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
50.实施例1
51.本实施例提供了一种降低不同菌株间拮抗作用的方法，请参阅图1，其包括如下步骤：
52.s1、菌种复壮。
53.将保存于斜面的枯草芽孢杆菌接种至装液量200ml的1l常规摇瓶(lb肉汤培养基)中，于36-38℃，200r/min转速下摇瓶培养24小时。
54.将保存于斜面的嗜酸乳杆菌接种至装液量100ml的150ml常规摇瓶(mrs肉汤培养基)中，于36-38℃，静置培养24小时。
55.s2、第一驯化阶段发酵培养。
56.将复壮后的枯草芽孢杆菌和嗜酸乳杆菌的菌液中，各吸取1ml转接至同一瓶装液量200ml的1l常规摇瓶中，共接种4瓶，于36-38℃，100r/min转速下摇瓶培养24小时。
57.其中，发酵培养的培养基为葡萄糖20g/l，蛋白胨10g/l，酵母浸粉2.4g/l，氯化钠
3g/l，碳酸钙1.2g/l，磷酸氢二钾2.4g/l，ph 7.2。
58.s3、计数并筛选第一低拮抗菌和第二低拮抗菌。
59.采用稀释涂布法对第一目标菌株和第二目标菌株进行活菌计数，从计数平板中，选取枯草芽孢杆菌菌量最高的摇瓶所对应的嗜酸乳杆菌平板，和嗜酸乳杆菌菌量最高的摇瓶所对应的枯草芽孢杆菌平板，从嗜酸乳杆菌平板和枯草芽孢杆菌平板上各挑取一环菌落，接种至同一瓶装液量200ml的1l常规摇瓶中，共接种3-4瓶。
60.继续按照步骤s2中的发酵培养基进行发酵培养，重复第一驯化阶段以控制传代次数为3代，最终筛选获得的菌作为第一低拮抗菌和第二低拮抗菌。
61.s4、第二驯化阶段发酵培养。
62.将经过多次传代驯化后获得的第一低拮抗菌和第二低拮抗菌进行共同发酵培养，转接至同一瓶装液量200ml的1l常规摇瓶中，共接种4瓶，于36-38℃，100r/min转速下摇瓶培养24小时。其中，发酵培养的培养基与步骤s2相同。
63.s5、计数并筛选出第一耐拮抗菌和第二耐拮抗菌。
64.对其中的第一低拮抗菌和第二低拮抗菌进行活菌计数；将第一低拮抗菌的菌量最高的平板和第二低拮抗菌的菌量最高的平板分别挑取一环菌落，接种至同一瓶装液量200ml的1l常规摇瓶中，共接种4瓶。之后对其进行活菌计数，再次挑选、接种后共同发酵培养(发酵培养的培养基和培养条件与步骤s2相同)，重复5次直至第二驯化阶段完成，最终筛选获得的菌作为第一耐拮抗菌和第二耐拮抗菌。
65.实施例2-4
66.实施例2-4与实施例1基本相同，区别在于，第一驯化阶段和第二驯化阶段传代次数不同。
67.实施例2中，第一驯化阶段的传代次数为2次，第二驯化阶段传代次数为4次。
68.实施例3中，第一驯化阶段的传代次数为1次，第二驯化阶段传代次数为2次。
69.实施例4
70.本实施例与实施例1的区别在于，第一目标菌株为地衣芽孢杆菌，第二目标菌株为植物乳杆菌。
71.一、驯化效果验证实验
72.将驯化前的菌株(枯草芽孢杆菌和嗜酸乳杆菌、地衣芽孢杆菌和植物乳杆菌)以及驯化后的菌株(实施例1-4获得的第一耐拮抗菌和第二耐拮抗菌)选择相同的种子液培养基、相同的发酵培养基、相同的工艺进行扩培，扩培后取样、留样，并测定第一目标菌株与第二目标菌株的活菌数，检测结果如表1所示。
73.其中，第一目标菌株种子液培养基采用lb肉汤，工艺为：36-38℃，200r/min转速下摇瓶培养24小时。第二目标菌株种子液培养基采用mrs肉汤，工艺为：36-38℃下静置培养24小时。
74.发酵培养基：葡萄糖20g/l，蛋白胨10g/l，酵母浸粉2.4g/l，氯化钠3g/l，碳酸钙1.2g/l，磷酸氢二钾2.4g/l，ph7.2。
75.发酵工艺：于36-38℃，100r/min转速下摇瓶培养24小时。
76.表1.发酵结束后活菌数统计表
77.示例第一目标菌株(cfu/ml)第二目标菌株(cfu/ml)
实施例1-3驯化前6.83
×
1085.57
×
106实施例14.93
×
1091.24
×
109实施例24.74
×
1091.03
×
109实施例32.43
×
1093.52
×
108实施例4驯化前7.96
×
1084.33
×
106实施例45.15
×
1091.03
×
10978.二、保存效果实验
79.分别于15天、30天、60天、90天取样测活菌量，检测结果如表2所示。
80.表2.发酵结束并保存不同天数后的活菌数统计表
[0081][0082]
从实施例1-3驯化前和实施例1的数据对比可以看出，通过本发明提供的降低不同菌株间拮抗作用的方法，可使驯化后的两株菌在共同培养后，枯草芽孢杆菌菌量达到4.93
×
109cfu/ml，嗜酸乳杆菌菌量达到1.24
×
109cfu/ml，两株菌比例为3.98：1，相比驯化前的菌株，枯草芽孢杆菌菌量提升到原先的7.22倍，嗜酸乳杆菌菌量提升到原先的222.62倍，且两者菌量更为接近；在保存90天的情况下，驯化前枯草芽孢杆菌存活率为1.00％，嗜酸乳杆菌存活率为0.13％，驯化后枯草芽孢杆菌存活率为14.67％，嗜酸乳杆菌存活率为7.14％。驯化后保存90天的存活率相比驯化前提升了14-55倍，大大提升了后续生产应用的效果，显著提高了生产效益。
[0083]
从实施例1-2的数据对比可以看出，规定范围内传代次数的变化对于驯化的效果影响不大。
[0084]
从实施例1和实施例3的数据对比可以看出，驯化过程中传代次数过少，则驯化效果会受到较大的影响，但菌量及保存时的存活率依旧比驯化前的更高。
[0085]
从实施例1和实施例4的数据对比可以看出，将第一目标菌株改为地衣芽孢杆菌，第二目标菌株改为植物乳杆菌，依照本发明的驯化方法进行驯化，可使驯化后的两株菌在共同培养后，地衣芽孢杆菌菌量达到5.15
×
109cfu/ml，植物乳杆菌菌量达到1.03
×
109cfu/ml，两株菌比例为5：1，相比驯化前的菌株，地衣芽孢杆菌菌量提升到原先的6.47倍，植物乳杆菌菌量提升到原先的237.88倍，且两者菌量更为接近；在保存90天的情况下，驯化前地衣芽孢杆菌存活率为0.88％，植物乳杆菌存活率为0.13％，驯化后地衣芽孢杆菌存活率为15.28％，植物乳杆菌存活率为8.55％。驯化后保存90天的存活率相比驯化前提升了17-66倍，大大提升了后续生产应用的效果，显著提高了生产效益。可以看出，本技术提供的降低不同菌株间拮抗作用的方法的适用范围广，可适用于多种菌株间的拮抗性能调整，且均取得了较佳的效果。
[0086]
综上所述，本技术提供的降低不同菌株间拮抗作用的方法通过两个阶段分别对菌株的针对性拮抗能力和耐拮抗能力进行驯化，其中，第一驯化阶段用于筛选对于第二目标菌株抑制能力较弱的第一目标菌株，通过两株菌共同培养，对第二目标菌株抑制能力较弱的第一目标菌株的摇瓶中第二目标菌株的菌量较高，以此作为筛选合适的第一目标菌株的依据，同理筛选对于第一目标菌株抑制能力较弱的第二目标菌株。第二阶段为筛选对于第二目标菌株的拮抗作用耐性较强的第一目标菌株，通过两株菌共同培养，对第二目标菌株的拮抗作用耐性较强的第一目标菌株的摇瓶中第一目标菌株的菌量较高，以此作为筛选合适的第一目标菌株的依据，同理筛选对于第一目标菌株的拮抗作用耐性较强的第二目标菌株。通过上述驯化筛选过程，筛选出来的第一耐拮抗菌和第二耐拮抗菌之间的拮抗作用显著降低，减少发酵过程两种菌互相抑制生长繁殖的情况发生。同时不影响菌株对有害菌的抑制效果，采用筛选后的第一耐拮抗菌和第二耐拮抗菌进行复合菌剂的复配或者复合菌的发酵，可以显著提升发酵后各菌的数量，提高其复配的复合菌剂质量或用于发酵料的主要菌种的发酵效果，提升菌量，同时，极大提升了菌种存活率和保存时间，大大促进了生产活动。
[0087]
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。