1.本发明属于医药技术领域，具体涉及一种抗细胞内支原体感染的药物制剂及其用途，用于细胞培养时预防细胞感染支原体和清除感染细胞的支原体。
背景技术：
2.细胞培养中支原体是最常见的污染/感染细胞的微生物，研究表明全球实验室中可能有高达35％的细胞存在支原体污染，即使全球实验室最认可的美国模式培养物集存库(american type culture collection，atcc)细胞中也存在部分细胞株有支原体污染的报道。支原体污染细胞的危害在于可导致细胞生理学、基因表达及对药物反应的改变，导致实验结果的不稳定性和不可重复性。同时，支原体感染细胞并不易被发现，其感染细胞时可能并未对细胞生长形态产生太大影响(但此时部分基因表达、药物反应性等已不同于正常细胞)，使研究者容易放松对支原体感染的警惕，不采取预防或干预措施，放任支原体污染细胞。此外，由于细胞间支原体主要来源于实验操作者，并且支原体可以通过气溶胶、接触等形式在细胞培养箱乃至整个细胞培养间内进行播散，导致细胞间大规模的支原体感染。因此，需要有专门用于杀灭支原体的制剂。
3.目前，研发的杀灭支原体制剂如清除细胞支原体污染的试剂有多种，根据其作用机制分为阻断支原体蛋白质合成和核酸合成两大类，市售制剂商品名有bm cyclin、mycoplasma removal agent(mra)、ciprobay、baytril、zagam、plasmocin、mycoplasma terminator等。上述药物尽管可以清除支原体，但其不足也较为明显：(1)对细胞毒性大，从而导致细胞损伤；(2)起效慢，处理时间达14天，部分细胞持续干预21天；(3)容易导致支原体产生耐药性。由于清除支原体时间较长，导致支原体获得耐药性，而且对再次发生支原体污染的细胞作用不佳。因此，亟待需要开发一种快速、低细胞毒性的抗支原体污染药物。
4.司帕沙星(sparfloxacin，spara)对支原体等病原菌有强大的杀伤作用，对肺炎支原体较环丙沙星、氧氟沙星和氟哌酸强8
–
62倍，可迅速有效地清除细胞中支原体，其作用机制主要通过靶向dna促旋酶抑制dna合成进而发挥杀菌作用，且不影响细胞内dna、rna的合成，对细胞功能影响小，可实现一方面迅速有效地清除细胞中支原体保护细胞生存和功能、另一方面防止支原体耐药的目的。但是，司帕沙星原药不溶于水，仅溶于二甲基亚砜，而二甲基亚砜对细胞有一定的损伤作用，特别是对感染支原体的细胞(此时细胞状态较差)有较强的诱导死亡作用，不能直接用于细胞培养场合。另外，对于公共细胞培养环境仅仅清除支原体还不够，细胞可能面临再次污染或者新细胞的支原体污染。因此，急需一种强有力的支原体杀伤制剂为细胞构筑一道防线，预防支原体污染细胞。
技术实现要素：
5.为克服现有技术的上述不足，本发明的主要目的是提供司帕沙星在制备抗细胞内支原体感染的药物制剂中的用途。
6.本发明的另一目的是提供一种抗细胞内支原体感染的药物制剂。
7.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
8.本发明提供司帕沙星在制备抗细胞内支原体感染的药物制剂中的用途。
9.作为优选的技术方案，所述药物制剂为以司帕沙星为活性成分且终浓度为10mg/ml的溶液剂。
10.优选地，所述溶液剂通过司帕沙星溶于0.1mol/l的naoh溶液中并依次经0.45μm和0.22μm的过滤器过滤得到。
11.本发明还提供司帕沙星在制备抗细胞培养基中细胞内支原体感染的药物制剂中的用途。
12.作为优选的技术方案，所述药物制剂以司帕沙星为活性成分，且有效使用剂量为0.001
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0.1mg司帕沙星/ml细胞培养基。
13.优选地，所述药物制剂为司帕沙星溶于0.1mol/l的naoh溶液中并依次经0.45μm和0.22μm的过滤器过滤得到终浓度为10mg/ml的溶液剂，有效使用剂量为0.01
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0.1mg司帕沙星/ml细胞培养基，每1-2天/次，持续使用7天。
14.一种抗细胞内支原体感染的药物制剂，为终浓度为10mg/ml的司帕沙星溶液剂，通过司帕沙星溶于0.1mol/l的naoh溶液中并依次经0.45μm和0.22μm的过滤器过滤得到。
15.本发明还提供所述抗细胞内支原体感染的药物制剂在细胞培养中的用途。
16.优选地，所述抗细胞内支原体感染的药物制剂的有效使用剂量为0.01
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0.1mg司帕沙星/ml细胞培养基，每1-2天/次，持续使用7天。
17.与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
18.(1)本发明采用的司帕沙星具有强力的广谱抗菌作用，其杀菌作用强于细胞培养常用的青链霉素，但是其原药不溶于水，仅溶于二甲基亚砜，而二甲基亚砜对细胞有一定的损伤作用，特别是对感染支原体的细胞(此时细胞状态较差)有较强的诱导死亡作用；本发明采用碱溶液溶解法，将司帕沙星原药溶于0.1mol/l的naoh溶液中制备抗细胞内支原体感染的药物制剂，可替代青链霉素用于细胞培养抗菌，实现“一药多用”和“老药新用”。
19.(2)本发明中抗细胞内支原体感染的药物制剂一方面极少量的naoh溶于有较强缓存体系的细胞培养基中，不会改变细胞培养基的ph值，也不会造成细胞损伤；另一方面可以保证司帕沙星的抗菌效果不受损失，能在7天内快速清除支原体对细胞的污染。
20.(3)本发明的制剂毒性和耐药性低，有效杀伤支原体的同时对细胞损伤小，可有效预防支原体再次污染细胞。
附图说明
21.图1是实施例中司帕沙星抗细胞内支原体制剂对感染a549细胞的支原体清除效果。
22.图2是实施例中司帕沙星抗细胞内支原体制剂对a549细胞长期毒性效果。
23.图3是实施例中不同剂量的司帕沙星抗细胞内支原体制剂对a549细胞毒性效果，*,p《0.05vs0组。
具体实施方式
24.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合本发明实施例的
附图，对本发明实施例的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于所描述的本发明的实施例，本领域普通技术人员在无需创造性劳动的前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
25.司帕沙星(sparfloxacin)，别名斯帕沙星，是一种淡黄色粉末的化学品，cas号：110871-86-8，化学名称：5-氨基-1-环丙基-7-(顺式-3,5-二甲基-1-哌嗪基)-6,8-二氟-1,4-二氢-4-氧代-3-喹啉羧酸，分子式为c
19h22
f2n4o3，分子量为325.4242，结构式为司帕沙星为第三代喹诺酮类抗菌药，临床上主要用于由敏感菌引起的轻、中度感染，包括：1)呼吸系统感染，如急性咽炎、急性扁桃体炎、中耳炎、副鼻窦炎、支气管炎、支气管扩张合并感染、肺炎等；2)肠道感染，如细菌性痢疾、伤寒、感染性肠炎、沙门菌。
26.以下实施例中采用的司帕沙星市售可得。
27.实施例1
28.采用碱溶液溶解法制备司帕沙星抗细胞内支原体制剂，步骤如下：将4g氢氧化钠(naoh)溶于800ml超纯水中，充分溶解后定容到1l，得到浓度为0.1mol/l的naoh溶液，室温、避光、密封可保存6个月，naoh具有腐蚀性，操作需戴手套。将司帕沙星原药粉充分溶于0.1mol/l的naoh溶液中，得到终浓度为10mg/ml的司帕沙星抗细胞内支原体制剂，依次经0.45μm和0.22μm的过滤器过滤后保存，该药物制剂可以置于-20
°
或-80
°
长期保存，短期(1个月内)可置于4
°
避光保存，避免反复冻融。
29.实施例2
30.验证实施例1制备的司帕沙星抗细胞内支原体制剂对细胞内支原体的清除作用，步骤如下：去除原有细胞培养基，用pbs重新3次后换成新鲜培养基，将上述司帕沙星抗细胞内支原体制剂按照1:1000(1μl司帕沙星抗细胞内支原体制剂溶于1ml培养基)加到培养基中；每1-2天换液一次，持续使用7天。
31.为检测司帕沙星抗细胞内支原体制剂对细胞中支原体的清除能力，按照文献《detection of mycoplasma in cell cultures》(nat protoc.2010,5(5):929-34.doi:10.1038/nprot.2010.43)的方法应用pcr进行检测，方法如下：
32.(1)收集支原体污染细胞的培养基以及使用司帕沙星抗细胞内支原体制剂7天后的培养基(注：不可用纯血清进行检测)；
33.(2)设计并合成引物如下：
34.上游引物(forward primer):5
’‑
gggagcaaacaggattagataccct-3’；
35.下游引物(reverse primer):5
′‑
tgcaccatctgtcactctgttaacctc-3
′
。
36.(3)进行pcr反应，体系及反应条件如表1和2所示。
37.表1
38.名称体积(μl)2
×
pcr master mix(with dye)10
上游引物(10μm)1下游引物(10μm)1收集的培养基1超纯水7总体积20
39.表2
[0040][0041]
(4)将pcr产物使用2％的琼脂糖凝胶电泳检测。
[0042]
结果如图1所示，支原体感染的a549细胞在经过7天处理后未检测出支原体感染，持续用司帕沙星抗细胞内支原体制剂处理细胞至14天，未检测支原体感染。说明司帕沙星抗细胞内支原体制剂可有效清除支原体的感染，并持续保护细胞再次发生支原体感染。
[0043]
实施例3
[0044]
验证实施例1制备的司帕沙星抗细胞内支原体制剂对细胞毒性的作用，步骤如下：在细胞培养基中按照1:1000(1μl司帕沙星抗细胞内支原体制剂溶于1ml培养基)加入上述司帕沙星抗细胞内支原体制剂，然后按照常规操作对细胞传代，利用cck-8观察14天内细胞活力和生长情况，结果如图2所示，显示a549细胞14天内的生长状态不受影响。
[0045]
测试不同浓度的司帕沙星抗细胞内支原体制剂对短期细胞存活的影响，步骤如下：在细胞培养基中按照1:1000(1μl司帕沙星抗细胞内支原体制剂溶于1ml培养基)、1:500、1:200、1:100、1:50和1:25加入上述司帕沙星抗细胞内支原体制剂，分别测试24h和48h的吸光度，结果如图3所示，显示使用量为1:1000、1:500、1:200、1:100时对a549细胞活性无明显影响，不影响细胞的增殖，也无明显的细胞毒性，而在使用量为1:50和1:25时对细胞的活力有显著抑制作用。