1.本发明属于铁皮石斛多糖纯化技术领域，具体涉及一种基于氨基化树枝状纳米介孔材料的铁皮石斛多糖纯化方法。


背景技术：

2.铁皮石斛作为一种传统名贵的中药材，是一种具有高药用价值的食用植物，其主要活性成分有多糖、生物碱、类黄酮、多酚、微量元素和氨基酸等，其中多糖含量最高，2020版《中国药典》记载铁皮石斛中多糖含量不低于25％。铁皮石斛多糖具有降血糖、护肝、抑菌、抗肿瘤、抗骨质疏松、保护肠胃、抗氧化和增强免疫力等功效。
3.铁皮石斛作为一种天然产物，其有效成分复杂而且含量低，难于富集，如何从复杂的天然产物中纯化和分离有效成分，是当前加快天然产物应用进程的一个重要问题。用传统的分离方法，例如大孔树脂，硅胶柱色谱等方法，这些方法虽然工艺简单，但是溶剂用量大、污染严重、耗时耗能、经济成本高，对于一些结构和性质相近的成分难以实现有效的分离。现有的铁皮石斛多糖分离方法，存在步骤繁琐，多糖得率低、损失严重的问题，因此，寻找高效、环保且低成本的铁皮石斛多糖纯化方法便成为关键。目前，本领域中仍然缺乏对铁皮石斛多糖进行富集分离、对其有效成分进行分离纯化的方法。


技术实现要素：

4.本发明的一个目的是针对以上要解决的技术问题，提供一种基于氨基化树枝状纳米介孔材料的铁皮石斛多糖纯化方法，其可以高效、环保、经济地实现铁皮石斛多糖的富集分离，同时可以为中药有效成分的富集分离方法的研究提供技术启示。
5.为了实现以上发明目的，本发明提供了一种基于氨基化树枝状纳米介孔材料的铁皮石斛多糖纯化方法，包括以下步骤：
6.s1：提取铁皮石斛多糖；
7.s2：采用热溶剂法合成氨基化树枝状纳米介孔材料dmsn-nh2：先制备树枝状介孔纳米颗粒undmsn，然后通过后接枝方法对其进行氨基修饰，得到dmsn-nh2；
8.s3：铁皮石斛多糖的纯化：将步骤s2制得的氨基化树枝状纳米介孔材料dmsn-nh2超声溶解在孵育溶液中，然后加入步骤s1提取的铁皮石斛多糖样品，利用旋转培养混合器振荡吸附至少3小时后，离心收集吸附了铁皮石斛多糖的氨基化树枝状纳米介孔材料dmsn-nh2，然后用10％sds洗涤三次，再用蒸馏水洗涤沉淀，用滤纸吸附多余的液体；接着加入70％的乙醇溶液置于25℃恒温摇床以150rpm振荡解吸24h，4000rpm离心15min，取上清，得到纯化后的铁皮石斛多糖。
9.相比于现有技术，本发明采用热溶剂法合成树枝状介孔材料dmsn-nh2，然后利用树枝状介孔材料dmsn-nh2对铁皮石斛多糖类化合物的良好的吸附和解吸性能，实现对铁皮石斛多糖的纯化，使铁皮石斛多糖含量由最初的6.55％,分别提高到51.14％。本发明的铁
皮石斛多糖纯化方法工艺简单，可实现高效、环保、经济地富集分离铁皮石斛多糖，且该纯化方法有望为食品产业中含糖物质的富集分离提供新思路。
10.优选地，步骤s1包括以下步骤：
11.s1a：将铁皮石斛原药材，除去杂质后剪成小段，50℃烘干，打粉，过筛备用；
12.s1b：称取铁皮石斛药材粉末和蒸馏水混合，然后采用回流提取法对铁皮石斛多糖进行提取。
13.优选地，步骤s1b中，所述铁皮石斛药材粉末和蒸馏水的质量比为1:100，提取次数为2次，提取时间为1.5h。
14.优选地，步骤s2包括以下步骤：
15.s2a：制备树枝状介孔纳米颗粒undmsn：将tea加入去离子水中并于80℃的油浴锅搅拌30分钟，然后添加ctab和nasal，继续搅拌1h后，滴加teos到上述混合的溶液中，在80℃下继续搅拌4h；反应结束后，通过9000rpm离心10min收集所得产物，并用乙醇和水洗涤各洗两次以除去残留的反应物；随后，将获得的沉淀物用hcl和乙醇的混合溶液在80℃下萃取两次以除去残留的有机模板，最后在50℃下真空干燥12h得到白色固体样品，即树枝状介孔纳米颗粒dmsn；
16.s2b：将步骤s2a制得的树枝状介孔纳米颗粒undmsn分散在乙醇中在超声处理10min后，继续搅拌15min，然后在剧烈搅拌下将氨水、去离子水和aptes加入上述溶液中，继续剧烈搅拌12h，最后将最终产物用乙醇洗涤，并在50℃真空中干燥8h以上。
17.优选地，步骤s2a中，tea、去离子水、ctab、nasal、teos的用量比例为0.68g:25ml:0.38g:0.168g:4ml。
18.优选地，步骤s2a中，所述hcl和乙醇的混合溶液中hcl和乙醇的体积比为1:9。
19.优选地，步骤s2a中，沉淀物用hcl和乙醇的混合溶液在80℃下萃取两次，每次萃取24h。
20.优选地，步骤s2b中，树枝状介孔纳米颗粒undmsn、乙醇、氨水、去离子水、aptes的用量比例为500mg:100ml:2.5ml:2.5ml:1ml。
21.优选地，步骤s3中，氨基化树枝状纳米介孔材料dmsn-nh2和孵育溶液的用量比为40mg:30ml。
22.优选地，步骤s3中，所述孵育溶液为去离子水。
23.本发明提出一种基于氨基化树枝状纳米介孔材料的铁皮石斛多糖纯化方法，其中氨基树枝状介孔纳米颗粒(dmsn-nh2)拥有高的比表面积、大的孔体积、内表面可及性等优势，是具有树枝状纤维形态的介孔材料。dmsn-nh2是由二氧化硅纤维或纳米褶皱作为结构单元构成的，它们沿颗粒的中心径向方向排列，经过0到4代的增迭过程，形成了中心辐射状的孔道结构，其孔径从颗粒内部到颗粒表面逐渐增大，因此，dmsn-nh2呈现树枝状形貌。此外，在迭代过程中，均匀的小介孔可被引入到纤维或皱纹中，因此dmsn-nh2具有多级孔结构，有着中心径向孔隙和均匀的小介孔，不规则地分布在二氧化硅球表面。这种独特的分层孔结构可以增强具有不同大小的客体分子在二氧化硅中的扩散，实现小分子分散在小介孔，而较大分子如生物分子、荧光分子等分散在中心径向的大孔中，因此具有多级孔道结构的树枝状介孔二氧化硅有望成为多功能载体。与均匀有序的六方介孔或无序大中孔msn相比，具有不规则孔结构的树枝状颗粒比具有均匀有序介孔和大中孔结构的msn有着更高的
负载能力。因此，将dmsn-nh2材料应用于铁皮石斛多糖的纯化中，为铁皮石斛多糖的富集分离提供一条髙效、环保、经济和工艺简单的途径，也为中药有效成分的富集分离方法的研究提供理论依据。
附图说明
24.图1为氨基树枝状介孔材料纳米颗粒dmsn-nh2的制备流程图
25.图2为undmsn和dmsn-nh2的红外光谱图
26.图3为undmsn和dmsn-nh2的n2吸附脱附等温线以及孔径分布图
27.图4为undmsn和dmsn-nh2的zeta电位分布图
28.图5为dmsn-nh2的扫描电镜图
29.图6为吸附了铁皮石斛多糖后的dmsn-nh2(a-i)的透射电镜图
30.图7为undmsn和dmsn-nh2的广角xrd衍射图
31.图8为dmsn-nh2的紫外可见吸收光谱
32.图9为介孔材料dmsn-nh2对铁皮石斛多糖的不同时间的吸附对比曲线图
33.图10为q
t
与t
0.5
的关系图
34.图11为dmsn-nh2对不同浓度多糖的吸附量柱状图
35.图12为不同洗脱液在介孔材料上的多糖洗脱率柱状图
具体实施方式
36.以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明，而非用于限制本发明的范围。
37.实施例中使用到的实验仪器和试剂如表1和表2所示：
38.表1.实验仪器
[0039][0040]
表2.实验试剂
[0041][0042]
实施例1：基于氨基化树枝状纳米介孔材料的铁皮石斛多糖纯化方法
[0043]
按以下步骤对铁皮石斛多糖进行纯化：
[0044]
s1：提取铁皮石斛多糖，包括以下步骤：
[0045]
s1a：将铁皮石斛原药材除去杂质后剪成小段，50℃烘干，打粉，过三号筛，备用。
[0046]
s1b：称取药材粉末0.5g，精密称定，加蒸馏水50ml，采用回流提取法对铁皮石斛多糖进行提取，提取时间为1.5h，提取2次。
[0047]
s2：采用热溶剂法合成氨基化树枝状纳米介孔材料dmsn-nh2，如图1所示，包括以下步骤：
[0048]
s2a：制备树枝状介孔纳米颗粒(undmsn)：将0.68gtea加入25ml去离子水于80℃的油浴锅搅拌30分钟，然后添加0.38gctab和0.168gnasal，继续搅拌1h后，将4mlteos用恒压滴液漏斗滴加到上述混合的溶液中，在80℃下继续搅拌4h。反应结束后，通过9000rpm离心10分钟收集所得产物，并用乙醇和水洗涤各洗两次以除去残留的反应物。随后，将获得的沉淀物用hcl和乙醇的混合溶液(hcl：乙醇＝1：9)在80℃下萃取两次(每次24h)以除去残留的有机模板，最后在50℃下真空干燥12h得到白色固体样品。
[0049]
s2b：合成氨基修饰的树枝状介孔纳米颗粒(dmsn-nh2)：氨基的修饰是通过后接枝方法进行的。首先将500mg树枝状介孔纳米颗粒(undmsn)分散在100ml乙醇中在超声处理10分钟后，继续搅拌15分钟。然后在剧烈搅拌下将2.5ml氨水、2.5ml去离子水和1mlaptes加入上述溶液中，继续剧烈搅拌12h，最后将最终产物用乙醇洗涤几次，并在真空中于50℃干燥过夜。
[0050]
s3：铁皮石斛多糖的纯化：称取40mg步骤s2制得的氨基化树枝状纳米介孔材料dmsn-nh2，超声溶解在30ml孵育溶液中，然后加入30mg步骤s1提取的铁皮石斛多糖样品，利用旋转培养混合器振荡吸附3小时后，离心收集吸附了铁皮石斛多糖的氨基化树枝状纳米介孔材料dmsn-nh2，然后用10％sds洗涤三次，再用100ml蒸馏水洗涤沉淀，用滤纸吸附多余的液体。再加入70％的乙醇溶液置于25℃恒温摇床以150rpm振荡解吸24h，4000rpm离心15min，取上清，得到纯化后的铁皮石斛多糖。孵育溶液为可以是ph3磷酸缓冲溶液、ph8磷酸缓冲溶液或去离子水，优选的，本实施例采用去离子水作为孵育溶液。
[0051]
测试例1：铁皮石斛多糖提取工艺优化
[0052]
多糖含量测定：以d-无水葡萄糖为对照，采用硫酸-苯酚显色法，测定多糖含量，标准曲线方程为y＝7.66812x+0.00000(r＝0.99926)，式中x为d-无水葡萄糖质量浓度(mg/ml)、y为吸光度，测定吸光度后，根据回归方程，计算多糖含量。
[0053]
本实施例对铁皮石斛多糖的提取工艺进行优化：取铁皮石斛药材粉末，精密称定，在单因素提取工艺考察基础上，考察料液比(a)、提取时间(b)和提取次数(c)3个因素，每个因素设3个水平。选用l9(33)表进行正交实验，以多糖含量为评价指标，计算标准偏差，以两独立样本均数比较t检验。
[0054]
(1)提取方法考察：分别取药材粉末0.5g，精密称定，加蒸馏水80ml，采用超声提取法、回流提取法两种方法对铁皮石斛多糖进行提取，采用紫外分光光度计测定吸光度。结果显示采用回流提取法多糖平均含量为26.25％，而超声提取多糖平均含量为17％，采用回流提取法铁皮石斛铁皮石斛多糖提取率最高。因此，实施例1步骤s1采用回流提取法对铁皮石斛铁皮石斛多糖进行提取。
[0055]
(2)提取次数考察：采用回流提取法，选取多糖提取时间1.5h、料液比0.5：40(g/ml)，考察提取次数，结果显示提取3次的多糖提取率较高，但多糖提取2次和3次的含量仅相差0.25％，从减少耗能和时间方面考虑，提取次数为2次较为合理。因此实施例1中步骤s1b中提取2次。具体考察结果如表3所示：
[0056]
表3提取次数考察结果
[0057][0058]
(4)提取时间考察：采用回流法提取，料液比为0.5：50(g/ml)、提取2次、考察提取时间对多糖得率影响，结果提取时间为1.5h多糖的得率最高，见表4。
[0059]
表4提取时间考察
[0060][0061][0062]
(5)正交实验
[0063]
根据单因素实验，考察料液比(a)、提取时间(b)和提取次数(c)3个因素，进行l9(33)安排正交实验。结果见表5。根据正交试验r值结果分析：料液比(a)》提取次数(c)》提取时间(b)。a因素中对指标影响k1最大，c因素中对指标影响k2最大，b因素中对指标影响k3最大，正交实验结果显示为a1b2c2测得含量最高，综合各工艺因素确定最佳提取方法为料液比1：100，提取时间为1.5h，提取2次，因此实施例1步骤s1采用上述最佳参数进行提取。
[0064]
表5正交实验结果
[0065]
编号abc平均含量(％)111120.65212230.12313327.91421215.95522315.69623115.70731329.12832122.04933227.30k126.2321.119.46 k215.7822.6224.46 k326.1523.6422.24 r10.4471.7304.99 [0066]
(6)多糖含量测定
[0067]
按照正交试验设计最佳提取工艺，每份取0.5g，共3份。置锥形瓶，加石油醚30ml，水浴加热30min，取出，弃滤液，保留滤渣蒸发干溶剂，加乙醇80ml，摇匀，水浴加热1h，取出，弃滤液，留滤渣蒸发干溶剂，加入50ml蒸馏水，加热回流2次，每次1.5h，过滤，合并两次滤液，放冷置200ml容量瓶，加纯水至刻度，摇匀，吸取1ml置25ml容量瓶，定容，摇匀，即得。结果铁皮石斛提取平均多糖含量为30.65％，rsd值为4.26％。正交试验提取平均多糖含量为30.12％，rsd值为1.06％。结果见表6。
[0068]
表6样品含量测定结果
[0069][0070]
可见，在单因素工艺考察中，回流提取法比超声提取法多糖含量明显要高，回流提取是直火加热的温度高，相比超声提取只有40℃，可能与提取温度密切相关。在提取次数中含量测定显示回流提取3次的多糖提取率较高，考虑到多糖提取2次和3次多糖含量仅相差0.25％，从减少耗能和时间方面考虑，采用提取2次。
[0071]
此外，经正交试验方法得出本实验最佳多糖提取工艺条件，通过紫外-可见光分光光度法对铁皮石斛铁皮石斛多糖含量进行测定，试验结果表明该提取工艺方法稳定，可靠。
[0072]
综上，铁皮石斛多糖提取的最佳实验条件：料液比为1：100，提取时间为1.5h，提取次数2次，通过验证实验确定在最佳条件下提取的铁皮石斛多糖平均多糖含量为30.65％。
[0073]
测试例2：氨基化树枝状纳米介孔材料dmsn-nh2的表征
[0074]
(1)undmsn和dmsn-nh2的红外光谱(ft-ir)测试
[0075]
称取约1mg粉末样品与100mg干燥的kbr粉末进行混合，在洁净干燥的玛瑙研钵中充分研磨混合。混合粉末用压片机压成透明薄片样品于4000-400cm-1
范围内进行扫描，得到红外光谱图。
[0076]
如图2所示，在446cm-1
和797cm-1
处的两个明显的特征峰是由si-o的振动引起的，在1090cm-1
处的强吸收峰源于si-o-si的不对称伸缩振动，是二氧化硅材料的特征吸收峰。修饰了氨基的dmsn-nh2与undmsn的红外数据相比，在2850～2950cm-1
处有两个弱的对称伸缩振动，这是硅烷中-ch
2-的特征吸收。在1546cm-1
处的振动峰是属于-n-h的特征吸收峰，这两组红外数据都表明aptes在undmsn表面进行硅烷化并在dmsn表面成功修饰上氨基。
[0077]
(2)氮气吸附脱附表征bamauer-enunett-teller(bet)
[0078]
将一定量的undmsn和dmsn-nh2固体样品于真空干燥箱干燥一定时间后，快速称取约100mg的样品并借助纸槽小心的倒入干燥的专用管中，记录差值，然后放入氮气吸附仪中测试。
[0079]
氮气吸附-脱附实验常用于分析介孔材料的孔体积、孔径和比表面积。如图3所示为undmsn和dmsn-nh2的bet曲线和bjh孔径分布图，两者的hi型滞后环都清晰可见，均属于典型的iv型曲线。根据bamauer-enunett-teller(bet)方法计算出undmsn和dmsn-nh2的比表面积和孔容，与纯的undmsn相比，修饰上氨基后dmsn-nh2的比表面积由414.39m2/g下降到239.04m2/g，总孔体积由1.17cm3/g下降到0.80cm3/g，这是因为aptes在dmsn-nh2表面水解，导致dmsn-nh2的比表面积、孔体积等参数都有不同程度的减少。这些结果表明aptes成功在dmsn-nh2表面上水解。此外，从孔径分布图可以看出，dmsn-nh2具有双峰孔径分布，说明其具有多级孔介孔，小介孔不规则分布的特点，主要集中在10-35nm的范围之间，根据barrett-joyner-halenda(bjh)方法处理得到这种材料的平均孔径为16.3nm，这个结果表明dmsn-nh2是中孔结构的。
[0080]
(3)纳米颗粒的zeta电位表征
[0081]
取少量的undmsn、dmsn-nh2分别分散在去离子水中，超声震荡分散15min。将分散好的溶液分别注入电位槽中，进行zeta电位测试。
[0082]
从下图4的zeta电位的变化可以看出，修饰前后以及负载前后的介孔材料的zeta电位值都有着明显的变化。纯的undmsn因为二氧化硅的表面有丰富的羟基，带负电，电位值为-24.5
±
0.5mv。修饰了氨基后的dmsn，表面被大量的-nh2修饰，电位变为正电26.8
±
0.8mv。高度正的电位值说明合成的纳米颗粒具有出色的稳定性。zate电位分布的明显变化表明氨基的成功修饰以及贵金属纳米颗粒的原位成功生成。
[0083]
(4)透射电镜表征(tem)和扫描电镜表征(sem)
[0084]
吸取少量的dmsn-nh2样品分散在乙醇中，超声分散均匀。然后用移液枪吸取少量待测液，滴加到tem专用铜网表面，用红外灯烘干，最后在透射电镜仪器中进行微观形态观察。取少量的dmsn-nh2固体样品均匀铺在导电胶上，喷金处理后，在扫描电镜仪器中观察样品的形貌。
[0085]
图5和图6分别是所制备的氨基化树枝状介孔材料的扫描电镜sem和透射电镜tem图(吸附铁皮石斛多糖后)。从图5的sem图可以看出，所合成的介孔材料具有明显的中央径向通道，其孔径尺寸从粒子内部到外部逐渐增大，呈现皱纹形态，由褶皱挤压形成的多级孔不均匀散布于二氧化硅球表面，孔径约为20nm，这种形貌符合n2吸附-脱附的结果，同时也
印证了bjh的孔径不均匀分布的结果。这种独特的形貌为铁皮石斛多糖的原位吸附提供充足的负载空间。从图6的tem图总体可以看出，所制备的纳米颗粒有着良好的分散性，且其具有独特的树枝状结构，每个树枝状介孔颗粒的粒径大约为160nm。此外，图6的a、d、g图是氨基化树枝状介孔材料吸附了不同质量铁皮石斛多糖后的tem图，对其进行区域放大(b、e、h)，然后随机选取一片被铁皮石斛多糖附着区域(c、f、i)进行分析，可以看出铁皮石斛多糖纳米颗粒能较好的被dmsn-nh2吸附，均匀地分布在树枝状中孔通道内，并且结构清晰，证明了石斛多糖已成功负载在dmsn-nh2内。
[0086]
(5)x-射线衍射表征(xrd)
[0087]
取适量的undmsn、dmsn-nh2样品，将样品研磨成细粉，压制到专用的玻璃样品台上扫描粉末衍射信号。
[0088]
xrd是验证纳米颗粒结晶度常用的表征手段。如图7所示，每个xrd谱图在22.9
°
处都有一个宽的特征峰，这归因于无定形二氧化硅的结构。undmsn和dmsn-nh2在2θ＝38.1
°
，44.3
°
，64.5
°
，77.5
°
和81.8
°
处的五个衍射峰，分别代表(111)，(200)，(220)，(311)和(222)的晶面。这些结果证实了dmsn-nh2中纳米颗粒的成功生成并且均保持良好的晶型结构。
[0089]
(6)紫外可见吸收光谱法分析(uv-vis)
[0090]
取少量的undmsn、dmsn-nh2分别分散在去离子水中，超声分散均匀。然后将分散好的溶液分别注入两面透光的比色皿中，在紫外可见分光光度计中测定特征吸光度。
[0091]
由于离子体共振效应，颗粒有明显的紫外可见吸收峰。从图8可以看出，dmsn-nh2在273nm处有特征的紫外吸收峰，进一步说明氨基在dmsn上的成功合成。
[0092]
测试例3：铁皮石斛多糖在介孔材料上的吸附动力学
[0093]
称取40mg介孔材料dmsn-nh2，孵育溶液分别为30mlph3磷酸缓冲溶液、ph8磷酸缓冲溶液以及去离子水，超声溶解5min。加入30mg多糖样品，利用旋转培养混合器分别振荡吸附，分别在0.5h、1h、1.5h、2h、3h、5h、7h、9h，吸取1ml吸附溶液，以10000r/min的转速离心10min，收集上清液。吸取0.1ml上清液，用苯酚-硫酸法测定上清液中的多糖含量。利用差值法计算得到多糖在介孔材料上的吸附量q，如式(1)所示。
[0094][0095]
其中m表示介孔材料的质量，g；v表示吸附液体积，ml；c0和c分别表示初始溶液和吸附后上清液中的多糖浓度，mg/ml。
[0096]
通过准一级(pfo)和准二级吸附动力学(pso)模型进行吸附动力学拟合，如式(2)个式(3)所示。
[0097]
ln(q
e-q
t
)＝lnq
e-k1t
ꢀꢀ
(2)
[0098][0099]
其中，q
t
表示t(min)时刻的吸附量，mg/g；qe表示平衡吸附量，mg/g；k1(min-1
)、k2(g
·
mg-1
·
min-1
)分别表示pfo和pso常数；v0＝k2q
e2
表示ps吸附初速度。
[0100]
在多糖浓度为1mg/ml、孵育溶液分别为水、ph3、ph8的磷酸缓冲溶液时，介孔材料dmsn-nh2对铁皮石斛多糖的不同时间的吸附结果如图9所示。从图中可以看出，随着吸附时间延长，吸附量上升。在不同ph值孵育溶液下，3h内都基本达到吸附平衡。其中孵育溶液为水时介孔材料dmsn-nh2的吸附量最大，最高可达350mg/g。介孔材料的表面含有大量羟基，
铁皮石斛多糖主要有葡萄糖组成，因此多糖和介孔材料之间靠亲水作用、氢键作用以及静电作用进行吸附，在碱性或酸性条件下，由于亲水作用被抑制、氢键作用被削弱、静电排斥等原因，吸附量下降。为了量化研究介孔材料dmsn-nh2的动力学吸附行为，将动力学数据带入模型，拟合结果如表7所示，通过对比拟合系数r'发现，准二级速率方程的线型相关系数r'》0.99，且拟合后q。与实验值接近，说明dmsn-nh2的动力学吸附行为符合准二级吸附动力学模型(pso)假设条件。准二级反应动力模型不仅包括吸附用的外表面扩散、表面吸附等，还包含了分子颗粒内部扩散的过程，与准一级动力学模型相比，该模型可以更确切地描述介孔材料对石斛多糖的吸附反应过程。
[0101]
表7多糖在介孔上的动力学吸附数据拟合
[0102][0103]
通常，吸附过程都由以下吸附步骤组成:(i)外扩散，溶质分子从水相主体扩散到吸附剂颗粒的表面，(ii)颗粒内扩散，表面吸附的溶质分子向颗粒内部的孔隙扩散，(iii)吸附，溶质分子在内部吸附位点吸附。一般，内部吸附点位的吸附较为迅速因而可以被忽略。因此，吸附速率控制步骤取决于外扩散或颗粒内扩散的快慢。若颗粒内扩散是吸附的速率控制因素，吸附量和时间的关系符合方程式(7)。
[0104]qt
＝kit
0.5
+c
ꢀꢀ
(7)
[0105]
式中，q
t
(mg/g)是t(min)的吸附量，c(mg/g)为与边界层厚度相关的系数，ki(mg
·
g-1
·
min-0.5
)为内扩散速率常数。当q
t
与t
0.5
呈良好的线性关系且通过原点时，说明颗粒内扩散过程是吸附速率的唯一控制步骤。
[0106]
由图10的q
t
与t
0.5
的关系图可以发现，曲线由多条线段组成，且不过原点，说明颗粒内扩散不是唯一的控制步骤，外扩散与内扩散均在其中起作用。吸附过程由两步组成，第一步快速吸附过程由多糖与表面活性位点的结合,第二步缓慢吸附过程由于吸附位点饱和使得吸附逐渐达到平衡.拟合方程中c值由第一阶段的98.473mg/g增大至第二阶段的247.67mg/g，说明随着吸附的进行边界层厚度在增加。
[0107]
测试例4：铁皮石斛多糖在介孔材料上的吸附热力学
[0108]
孵育溶液为去离子水，其他条件与动力学研究相同，进行吸附等温线测定，吸附时间为3h，多糖初始浓度分别为0.1、0.2、0.3、0.5、0.75、1、105mg/ml
[0109]
通过单层吸附的langmuir模型(式(4))和多层吸附的freundlich模型(式(5))对热力学吸附数据进行拟合。
[0110]
[0111][0112]
其中，qe表示某浓度下材料对目标物的平衡吸附容量，mg/g；ce表示达到吸附平衡时，溶液中残留的目标物浓度，mg/ml；k
l
表示吸附结合常数，ml/mg；q
max
表示材料对目标物的最大吸附容量，mg/g；kf和n是freundlich模型常数。
[0113]
介孔材料dmsn-nh2对石斛多糖的吸附热力学行为如图11所示。随着样品浓度升高，吸附量也随之升高。为了量化研究介孔材料dmsn-nh2对石斛多糖的热力学吸附行为，拟合结果如表8所示。通过对langmuir模型回归以及freundlich模型回归的拟合发现，二者均有较好的回归效果，其中，langmuir模型拟合系数大于0.99，表明该方程更符合dmsn-nh2对铁皮石斛多糖的吸附过程，同时说明dmsn-nh2的吸附过程主要为单分子层并伴随着多分子层的吸附。freundlich模型中参数n与吸附强度、和吸附剂-吸附质相互作用有关，n值大于1，说明铁皮石斛多糖易于吸附在dmsn-nh2的表面活性位。
[0114]
表8铁皮石斛多糖在dmsn-nh2上的热力学吸附数据拟合结果
[0115][0116]
测试例5：吸附在介孔材料dmsn-nh2上的石斛多糖的洗脱：洗脱液优化
[0117]
介孔与多糖样品振荡孵育3h后，离心收集吸附多糖的介孔材料，分别利用20％acn、1mol/lnacl、10％sds洗涤三次，离心测定上清液多糖洗脱量。洗脱率为洗脱量与吸附量的比值。如式(6)所示。式中，c(mg/ml)是洗脱液中多糖的浓度，v(ml)是洗脱液的体积，m(mg)是多糖的质量，q(mg/g)是多糖在介孔材料的吸附量。
[0118][0119]
不同洗脱剂(20％acn溶液、imol/lnac1、10％sds)对吸附在dmsn-nh2上的铁皮石斛多糖的脱附结果，如图12所示。树枝状介孔材料dmsn-nh2和多糖均含有丰富的羟基，两者均为亲水性物质，10％sds具有比水更强的极性，能够破坏dmsn-nh2与多糖之间的氢键作用，从而能够将吸附在dmsn-nh2表面的石斛多糖脱附:由于dmsn-nh2与多糖之间的静电作用力较弱，因此离子型洗脱剂nacl的洗脱能力有限；dmsn-nh2与多糖均为亲水性物质,两者间的疏水作用力很小，因此acn洗脱能力相对较低。
[0120]
测试例6：纯化后铁皮石斛多糖及其他含量的测定
[0121]
经dmsn-nh2吸附、10％sds洗脱的多糖透析脱盐后经pmp柱前衍生结合高效液相色谱法分析多糖组成，洗脱后铁皮石斛多糖的含量如下。(多糖、甘露糖含量及甘露糖与葡萄糖峰面积比测定按照《中国药典》的方法。采用统计软件spss20.0进行数据分析。)多糖洗脱后铁皮石斛多糖中各种糖类的摩尔含量分别为多糖31.22
±
2.36、甘露糖17.87
±
1.86％、甘露糖与葡萄糖峰面积之比3.26
±
0.72。通过分析，总糖的纯度较富集前提高了51.14％，这是因为蛋白类物质在极性的dmsn-nh2表面吸附较弱，而极性的糖类物质在极性的dmsn-nh2表面进行了选择性富集，所以富集后多糖纯度提高。
[0122]
目前，本领域中仍然缺乏对铁皮石斛多糖进行富集分离、对其有效成分进行分离纯化的方法。针对石斛多糖分离步骤繁琐，多糖得率低、损失严重的问题，本发明公开了一
种基于介孔材料dmsn-nh2的多糖富集新方法。实验结果显示介孔材料dmsn-nh2对铁皮石斛多糖的吸附量为350mg/g，吸附动力学符合准二级吸附动力学模型，吸附过程由外部扩散和颗粒内扩散控制；多糖在dmsn-nh2的吸附过程主要为单分子层并伴随着多分子层的吸附。本发明有望为食品产业中含糖物质的富集分离提供指导。
[0123]
本发明并不局限于说明书和实施方式所列运用，其完全可以被适用于各种适合本发明的领域，在不背离本发明精神及其实质的情况下，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改和变形，但这些相应的修改和变形都应属于本发明所要求的保护范围。
[0124]
以上所述仅为本发明的部分实施例，并非因此限定本发明的实施方式及保护范围，对于本领域技术人员而言，应当能够意识到凡运用本发明说明书内容所做出的等同替换和显而易见的变化所得到的方案，应当包含在本发明的保护范围内。