基于秋石斛转录组序列开发的est-ssr标记及应用
技术领域
1.本发明属于分子标记领域，具体涉及秋石斛转录组序列开发的est-ssr标记、引物及其应用。
背景技术：
2.秋石斛(dendrobiumhybrida)是指以原产于热带地区的常绿石斛为亲本，经过杂交选育出来的一大类石斛优良品种，是石斛兰中最具观赏价值的种群之一，因其花型花姿优美、色彩丰富艳丽、花期及瓶插期较长，深受人们喜爱，是观赏兰花中的重要切花和盆花。近年来深受消费者的喜爱，已成为兰花市场中新兴的、具发展潜力的兰花新种类，市场前景广阔。目前，有关秋石斛的研究主要集中在组织培养技术、栽培技术、花期调控等方面，对于秋石斛遗传多样性、遗传图谱构建、基因定位等方面的研究还很少。秋石斛中用于以上研究的分子标记仅为一些通用引物如rapd，srap等，这大大限制了秋石斛分子育种的进程。
3.表达序列标签微卫星(est-ssr)是一种基于表达序列标签的简单序列重复设计的新型分子标记，具多态性高、共显性遗传、重复性好、开发成本低等优点，且其来自基因组的编码区，与功能基因紧密连锁，更容易获得基因表达的信息。随着est数据库不断丰富和高通量测序技术发展，est-ssr在植物上被大量开发和应用，但有关est-ssr在秋石斛中的应用研究还未见报道。
4.因此，建立一种基于秋石斛花序转录组筛选est-ssr引物方法，筛选出杂交兰est-ssr引物，对秋石斛植物的种质资源遗传多样性进行分析、遗传图谱构建和标记辅助育种是本领域技术人员亟需解决的问题。
技术实现要素：
5.本发明的目的在于提供一种基于秋石斛转录组序列开发的est-ssr标记，20对est-ssr标记引物来自于秋石斛花芽转录组序列，引物的多态性丰富、扩增稳定、扩增条带易于鉴定，是稳定存在的新标记，填补了秋石斛基于转录组开发ssr引物的空白。
6.为了实现上述目的，本发明的技术方案为：提供一种基于秋石斛转录组序列开发的est-ssr标记，微卫星标记编号为：den2、den7、den12、den17、den18、den19、den24、den27、den38、den46、den47、den51、den57、den60、den63、den72、den75、den82、den94和den95；其核苷酸序列分别如seq id no.1～seq id no.20所示。
7.前期进行了秋石斛花芽转录组测序，获得了大量的秋石斛花发育调控基因。在获得的转录组序列中，采用microsatellite(misa)软件识别和定位ssr位点，并用primer premier 5.0软件设计ssr引物，引物设计选择位点的重复单元为二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸，最少重复次数分别为9次、7次、6次、5次、4次，且位点距离序列两端大于50bp的序列利用设计引物，引物长度控制在17-24bp，预期产物长度100-300bp，最终筛选出100对引物。以8个品种的秋石斛dna为模板，利用上述100对ssr引物进行pcr扩增，pcr反应体系为20μl，其中包括：40ng的dna模板，1
×
taq buffer，0.4μl of dntp(10mm)，
0.15mm/l mg
2+
，1.0μl的上下游引物，1.0μl of taq dna polymerase(1u,fermentas)，反应程序为95℃预变性3min，然后进行36个循环，每个循环包括：94℃变性45s，60℃复性30s，72℃延伸90s，最后延伸10min。pcr产物经过2.5％琼脂糖凝胶电泳初步筛选，之后用全自动毛细管电泳仪qiaxcel advanced(德国qiagen生物公司)验证，最终获得20对条带清晰、多态性高、重复性好的ssr标记引物，引物如表1所示。
8.表1秋石斛est-ssr引物序列表
[0009][0010][0011]
本发明还提供一种基于转录组的秋石斛est-ssr引物在秋石斛品种鉴定、遗传谱系分析、遗传图谱构建、种质资源的保护和辅助育种领域的应用：利用20对ssr引物对42个秋石斛品种进行亲缘关系分析，具有重复性好，谱带清晰，多态性高等特点，可广泛应用于秋石斛品种鉴定、高密度遗传连锁图谱构建、多样性分析。
[0012]
本发明还提供一种基于转录组的秋石斛est-ssr引物在石斛属植物种类鉴定、遗传谱系分析、种质资源的保护和辅助育种领域的应用：利用20对ssr引物对石斛属的40个种进行亲缘关系分析，20对引物在40种石斛原生种中具有很好的迁移能力，可将本发明提供的标记应用于石斛属植物的遗传多样性分析研究、系统进化研究、遗传连锁图谱构、目标性状关键基因定位、分子标记辅助育种等研究中。
附图说明
[0013]
图1是利用20对引物在42个秋石斛品种资源的聚类分析图。
[0014]
图2是利用20对引物在40个石斛属原生种资源的聚类分析图。
具体实施方式
[0015]
通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0016]
【实施例1】多态性高的秋石斛的est-ssr引物的开发
[0017]
本发明提供的基于转录组高通量测序，并结合生物信息学方法进行ssr序列查找和ssr标记引物设计和验证，其具体实施方式如下：
[0018]
富含ssr位点的unigene序列筛选：选取秋石斛花芽提取总rna，构建转录组测序文库，采用illumina四代测序仪进行高通量测序。测序数据进过严格的过滤后进行组装，得到unigene，将其作为后续ssr引物开发的背景数据。采用misa软件对unigene进行ssr位点搜索，搜索标准为：二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸，最少重复次数分别为9、7、6、5、4次。从秋石斛转录组的63101条unigene序列中发现了5174个ssr位点，分布在4486个unigene中，发生频率为7.11％。其中，含有2个及2个以上ssr位点的unigene序列有552条，平均每11.01kb出现1个ssr位点。转录组中检测到的ssr位点种类包括一、二、三、四、五、六核苷酸重复单元类型以及混合ssr，其中，二、三核苷酸重复单元的位点较多，分别有2960个和1910个，出现的频率分别为57.21％和36.92％。
[0019]
用primer premier 5.0软件设计ssr引物，引物设计选择位点的重复单元为二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸，最少重复次数分别为9次、7次、6次、5次、4次，且位点距离序列两端大于50bp的序列利用设计引物，引物长度控制在17-24bp，预期产物长度100-300bp，最终设计了5289对引物，随机挑选100对引物用于扩增。
[0020]
采集8个秋石斛品种(dendrobiumtongchai gold，dendrobiumburana charming，dendrobiumenobi purple'splash'，dendrobium sunny red，dendrobiumaridang blue，dendrobiumcoerulea blue，dendrobium bangkok green，dendrobium candy stripe)的幼嫩叶片，采用天根多糖多酚植物dna提取试剂盒提取待测样品的，操作参照试剂盒说明书进行，获得的dna稀释50倍，用分光光度计法检测浓度，用电泳法检测质量，调整浓度为40ng/l作为工作液备用，其余母液保存于-80℃。
[0021]
以8个品种的秋石斛dna为模板，利用上述100对ssr引物进行pcr扩增，pcr反应体系为20μl，其中包括：40ng的dna模板，1
×
taq buffer，0.4μl of dntp(10mm)，0.15mm/l mg
2+
，1.0μl的上下游引物，1.0μl of taq dna polymerase(1u,fermentas)，反应程序为95℃预变性3min，然后进行36个循环，每个循环包括：94℃变性45s，60℃复性30s，72℃延伸90s，最后延伸10min。pcr产物经过2.5％琼脂糖凝胶电泳初步筛选，之后用全自动毛细管电泳仪qiaxcel advanced(德国qiagen生物公司)验证，最终获得20对条带清晰、多态性高、重复性好的ssr标记引物。
[0022]
【实施例2】20个标记应用于42个秋石斛品种材料遗传多样性分析
[0023]
(1)提取表2中秋石斛品种的基因组dna，调整浓度至40ng/l。
[0024]
(2)以上述dna为模板，利用表1中所示引物进行扩增，pcr反应体系为20μl，其中包括：40ng的dna模板，1
×
taq buffer，0.4μl of dntp(10mm)，0.15mm/l mg
2+
，1.0μl的上下游引物，1.0μl of taq dna polymerase(1u,fermentas)，反应程序为95℃预变性3min，然后
进行36个循环，每个循环包括：94℃变性45s，60℃复性30s，72℃延伸90s，最后延伸10min。pcr产物通过abi 3730xl dna analyzer进行分析，扩增条带通过genemarker2.2软件在genescan
tm
500进行统计。
[0025]
(3)获得的条带数据通过mega5.0进行聚类图构建，获得42个秋石斛品种的聚类分析图。
[0026]
(4)聚类分析见图1，结果显示(表2)，在0.150处可以将42个品种划分为5类。其中i类包含33个品种，植株均较高，这33个品种又可以分为3小类，ia类包含21个品种，这21个品种具有的共同性状是植株高，花瓣较圆正平展，花朵底色为白色；ib类包含7个品种，共同性状是植株高，花瓣较细长平展，花色为紫红色；ic类包含5个品种，共同性状是植株高，花瓣较细长，花色为粉红色。ii类包含2个品种，植株中型，花瓣扭曲。iii类包含5个品种，植株较矮，花瓣较细长，花色为粉红色。iv类含1个品种，株型较小，花朵数多，花小，具香味。v类含1个品种，株型中等，花朵数多，花瓣扭曲。划分的5大类均具有各自相同的性状，且具有与其它类别具有差异性状，说明这20对引物可以用于秋石斛品种资源遗传多样性分析和亲缘关系的研究中。
[0027]
表2测试品种的聚类结果及其共有性状
[0028][0029]
【实施例3】20个标记应用于40个石斛属原生种资源遗传多样性分析
[0030]
(1)提取表3中40个石斛属原生种的基因组dna，调整浓度至40ng/l。
[0031]
(2)以上述dna为模板，利用表1中所示引物进行扩增，pcr反应体系为20μl，其中包括：40ng的dna模板，1
×
taq buffer，0.4μl of dntp(10mm)，0.15mm/l mg
2+
，1.0μl的上下游
引物，1.0μl of taq dna polymerase(1u,fermentas)，反应程序为95℃预变性3min，然后进行36个循环，每个循环包括：94℃变性45s，60℃复性30s，72℃延伸90s，最后延伸10min。pcr产物通过abi 3730xl dna analyzer进行分析，扩增条带通过genemarker2.2软件在genescan
tm
500进行统计。
[0032]
(3)获得的条带数据通过mega5.0进行聚类图构建，获得40个石斛属原生种的聚类分析图。
[0033]
(4)聚类分析见图2，结果显示(表3)，40个原生种根据来源地不同共分8大类，第i类共含29种，均为来自热带亚热带地区，其中ia类包含13种，均来自云南，均为模式组；ib类含4种，包括2个灯笼组，1个模式组和一个鳞叶组，均是收集自印度；ic类包含8种，其中3个为鸟脚组，2个为模式组，1个为鸟脚组，1个为剑叶组，1个为圆柱鳞叶组，均是收集自越南；id类包含4各种，均为模式组，收集自海南。ii类包含4种，包括3个鸟脚组和1个澳洲组，均收集自澳大利亚。iii类2种，均为模式组，均收集自广西。第iv、v、vi、vii和viii均只有1个种，分别收集自贵州、泰国、马来西亚和印度尼西亚。聚类分析可以将相同来源的原生种归为一类，说明这20对引物可以用于石斛属资源遗传多样性分析和亲缘关系的研究中。
[0034]
表3测试原生种的聚类结果及其来源地
[0035][0036][0037]
以上所揭露的仅为本发明的较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属于本发明所涵盖的范围。