1.本发明属于金钗石斛技术领域，特别是涉及一种具有微弱抗氧化活性的金钗石斛次代谢产物。


背景技术：

2.金钗石斛是兰科石斛属多种年生的附生型草本植物，属于《中国药典》所收录的药用石斛，具有滋阴清热、益胃生津的功效；含有生物碱类、黄酮类、多糖类等多种化学成分，药理活性主要在抗白内障、抗肿瘤、调节免疫力等方面。石斛多糖具有免疫调节、抗氧化和保肝作用；生物碱类具有抗白内障和神经保护作用；芳香族化合物和倍半萜类具有抗血管生成、抗肿瘤和抗诱变作用，然而现有的在对金钗石斛在提取目标化合物时不能提取更多的成分，同时在提取时纯度较低，因此我们对此进行改进，提出了一种具有微弱抗氧化活性的金钗石斛次代谢产物。


技术实现要素：

3.本发明的目的在于提供一种具有微弱抗氧化活性的金钗石斛次代谢产物，以解决了现有的问题：现有的在对金钗石斛在提取目标化合物时不能提取更多的成分，同时在提取时纯度较低。
4.为解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案实现的：
5.本发明为一种具有微弱抗氧化活性的金钗石斛次代谢产物，包括原料、二氯甲烷浸膏的制备、dn-1、dn-2和dn-3的制备、抗氧化活性测试、制备 dn-4、dn-5和dn-6，所述原料为金钗石斛干燥茎，所述金钗石斛干燥茎的重量为10kg。
6.进一步地，所述二氯甲烷浸膏的制备包括以下步骤：
7.步骤一：对金钗石斛干燥茎原料经过粉碎、过筛得到均一粉末；
8.步骤二：金钗石斛干燥茎粉末经过60％的乙醇溶液回流提取后，过滤浓缩得到醇提物，且提取时间为2n，提取次数为3次；
9.步骤三：过滤，浓缩滤液，得到乙醇浸膏；
10.步骤四：乙醇浸膏用5％盐酸水溶液溶解至无块状，用浓氨水调节溶液的ph为10，制备为碱水液；
11.步骤五：碱水液经过石油醚、二氯甲烷萃取(每种萃取剂萃取至有机层无色)，浓缩有机层，得到二氯甲烷浸膏(35g)，萃取时间为2n，萃取次数为3次。
12.进一步地，所述dn-1、dn-2和dn-3的制备包括以下步骤：
13.步骤一：二氯甲烷浸膏经硅胶柱层析，伴样选用的是60-100目硅胶，上柱选用的是100-200目硅胶，洗脱剂为二氯甲烷-甲醇(v/v；0:1、100:1、 50:1、10:1、8:1、5:1、0:1)梯度洗脱，结合薄层色谱分析(展开剂二氯甲烷-甲醇，10:1)，每个梯度收集3-5个柱体积，合并得到5个馏分(fr. a～e)；
14.步骤二：fr.b经过硅胶柱层析洗脱体系为二氯甲烷-甲醇(v/v， 100:1-8:1)，根据
薄层色谱图特点，合并共得到4个次级馏分(fr. b-1～b-4)，fr.b-2经过ods柱层析，洗脱剂为75％甲醇-水溶液，合并得到的下一级馏分fr.b-2-5挥干溶剂后，用色谱甲醇溶解，过0.22μm滤膜，离心，上清液经半制备液相制备，制备条件38％色谱甲醇-水，收集保留时间为15min的色谱峰，收集完成后，用旋转蒸发仪蒸干制备液，得到单体化合物dn-1，蒸干样品取出部分干燥样品溶于cd3od用于核磁测试，通过一维核磁共振手段(1hnmr，13cnmr)鉴定了化合物dn-1的结构，为二氢松柏醇；
15.步骤三：fr.c经过凝胶柱层析，洗脱剂为二氯甲烷-甲醇(v/v，1:1)，通过薄层色谱图的特点，合并得到5个次级馏分(fr.c-1～c-5)。fr.c-3 挥干溶剂后，用色谱甲醇溶解，过0.22μm滤膜，离心，上清液经半制备液相制备，制备条件42％色谱甲醇-水，分别收集保留时间为13min的色谱峰和保留时间为15min的色谱峰，收集完成后，用旋转蒸发仪蒸干制备液，得到单体化合物dn-2和dn-3，蒸干样品取出部分干燥样品溶于dmso-d6用于核磁测试，通过一维核磁共振手段(1hnmr，13cnmr)鉴定了化合物dn-2 和dn-3的结构，分别为5-甲基-异芳香树脂醇、丁香脂素。
16.进一步地，所述制备dn-4、dn-5和dn-6包括以下步骤：
17.步骤一：馏分d经过凝胶色谱柱分离、硅胶色谱柱分离和半制备液相制备和纯化得到化合物dn-4、dn-5；
18.步骤二：馏分e经过硅胶柱色谱柱分离和半制备液相制备和纯化得到化合物dn-6。
19.进一步地，所述抗氧化活性测试包括以下步骤：
20.步骤一：准确称取0.7886mgdpph；
21.步骤二：用甲醇定容于10ml容量瓶中，制备为浓度为0.2mmol/l的 dpph溶液；
22.步骤三：用甲醇将样品制备成浓度为1mg/ml的样品溶液；
23.步骤四：将不同浓度的样品溶液100μl和0.2mmol/l的dpph溶液 100μl加入96孔板中；
24.步骤五：以维生素c为阳性对照，以不含dpph溶液的样品溶液作为对照空白对照，以仅含dpph溶液的孔为阴性对照；
25.步骤六：每组平行4个复孔，将96孔板置于酶标仪中，震荡1min并于此条件下保存，30min后测试其在517nm处的吸光度a值；
26.步骤七：自由基清除率＝[adpph
·
control-(asample-asample
· control)]/adpph
·
control
×
100％，
[0027]
其中adpph
·
control为阴性对照组吸光度的平均值；asample为样品组吸光度的平均值；asample
·
control为空白对照组吸光度的平均值。
[0028]
本发明具有以下有益效果：
[0029]
1、本发明在现有的提取技术上修改了乙醇浓度，改为60％，可以提取出更多的成分，修改了萃取剂，本发明是采用二氯甲烷这种中极性的萃取剂，能富集植物中的大极性的抗氧化成分的，运用二氯甲烷-甲醇体系进粗分，更有效的将相同极性的化合物集中，运用本发明能更高效、更准确的获得目标化合物。
[0030]
2、本发明的产品来源于天然植物，运用于药物开发更安全，本发明提供了的上述产品的核磁共振谱图数据，用于结构的确定更准确，按照本发明的制备技术得到的产品纯度可达95％以上，得到的产品结构单一，同时可以证明到的产品确实具有抗氧化活性。
[0031]
当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有优点。
附图说明
[0032]
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0033]
图1为本发明中dn-1到dn-6的具体结构示意图。
具体实施方式
[0034]
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
[0035]
请参阅图1所示，本发明为一种具有微弱抗氧化活性的金钗石斛次代谢产物，包括原料、二氯甲烷浸膏的制备、dn-1、dn-2和dn-3的制备、抗氧化活性测试、制备dn-4、dn-5和dn-6，原料为金钗石斛干燥茎，金钗石斛干燥茎的重量为10kg。
[0036]
二氯甲烷浸膏的制备包括以下步骤：
[0037]
步骤一：对金钗石斛干燥茎原料经过粉碎、过筛得到均一粉末；
[0038]
步骤二：金钗石斛干燥茎粉末经过60％的乙醇溶液回流提取后，过滤浓缩得到醇提物，且提取时间为2n，提取次数为3次；
[0039]
步骤三：过滤，浓缩滤液，得到乙醇浸膏；
[0040]
步骤四：乙醇浸膏用5％盐酸水溶液溶解至无块状，用浓氨水调节溶液的ph为10，制备为碱水液；
[0041]
步骤五：碱水液经过石油醚、二氯甲烷萃取(每种萃取剂萃取至有机层无色)，浓缩有机层，得到二氯甲烷浸膏(35g)，萃取时间为2n，萃取次数为3次。
[0042]
dn-1、dn-2和dn-3的制备包括以下步骤：
[0043]
步骤一：二氯甲烷浸膏经硅胶柱层析，伴样选用的是60-100目硅胶，上柱选用的是100-200目硅胶，洗脱剂为二氯甲烷-甲醇(v/v；0:1、100:1、 50:1、10:1、8:1、5:1、0:1)梯度洗脱，结合薄层色谱分析(展开剂二氯甲烷-甲醇，10:1)，每个梯度收集3-5个柱体积，合并得到5个馏分(fr. a～e)；
[0044]
步骤二：fr.b经过硅胶柱层析洗脱体系为二氯甲烷-甲醇(v/v， 100:1-8:1)，根据薄层色谱图特点，合并共得到4个次级馏分(fr. b-1～b-4)，fr.b-2经过ods柱层析，洗脱剂为75％甲醇-水溶液，合并得到的下一级馏分fr.b-2-5挥干溶剂后，用色谱甲醇溶解，过0.22μm滤膜，离心，上清液经半制备液相制备，制备条件38％色谱甲醇-水，收集保留时间为15min的色谱峰，收集完成后，用旋转蒸发仪蒸干制备液，得到单体化合物dn-1，蒸干样品取出部分干燥样品溶于cd3od用于核磁测试，通过一维核磁共振手段(1hnmr，13cnmr)鉴定了化合物dn-1的结构，为二氢松柏醇；
[0045]
步骤三：fr.c经过凝胶柱层析，洗脱剂为二氯甲烷-甲醇(v/v，1:1)，通过薄层色谱
图的特点，合并得到5个次级馏分(fr.c-1～c-5)。fr.c-3 挥干溶剂后，用色谱甲醇溶解，过0.22μm滤膜，离心，上清液经半制备液相制备，制备条件42％色谱甲醇-水，分别收集保留时间为13min的色谱峰和保留时间为15min的色谱峰，收集完成后，用旋转蒸发仪蒸干制备液，得到单体化合物dn-2和dn-3，蒸干样品取出部分干燥样品溶于dmso-d6用于核磁测试，通过一维核磁共振手段(1hnmr，13cnmr)鉴定了化合物dn-2 和dn-3的结构，分别为5-甲基-异芳香树脂醇、丁香脂素。
[0046]
制备dn-4、dn-5和dn-6包括以下步骤：
[0047]
步骤一：馏分d经过凝胶色谱柱分离、硅胶色谱柱分离和半制备液相制备和纯化得到化合物dn-4、dn-5；
[0048]
步骤二：馏分e经过硅胶柱色谱柱分离和半制备液相制备和纯化得到化合物dn-6。
[0049]
抗氧化活性测试包括以下步骤：
[0050]
步骤一：准确称取0.7886mgdpph；
[0051]
步骤二：用甲醇定容于10ml容量瓶中，制备为浓度为0.2mmol/l的 dpph溶液；
[0052]
步骤三：用甲醇将样品制备成浓度为1mg/ml的样品溶液；
[0053]
步骤四：将不同浓度的样品溶液100μl和0.2mmol/l的dpph溶液 100μl加入96孔板中；
[0054]
步骤五：以维生素c为阳性对照，以不含dpph溶液的样品溶液作为对照空白对照，以仅含dpph溶液的孔为阴性对照；
[0055]
步骤六：每组平行4个复孔，将96孔板置于酶标仪中，震荡1min并于此条件下保存，30min后测试其在517nm处的吸光度a值；
[0056]
步骤七：自由基清除率＝[adpph
·
control-(asample-asample
·
control)]/adpph
·
control
×
100％，
[0057]
其中adpph
·
control为阴性对照组吸光度的平均值；asample为样品组吸光度的平均值；asample
·
control为空白对照组吸光度的平均值。
[0058]
实施例一：
[0059]
1.产品的核磁共振数据为分别为：
[0060]
dn-1：二氢松柏醇(dihydroxyconiferylalcohol)，无色油状，1h-nmr (500mhz，cd3od)δh：6.77(1h，d，j＝2hz，h-5)，6.70(1h，d，j＝8hz， h-2)，6.63(1h，dd，j＝8，2hz，h-6)，3.84(3h，s，3-ome)，3.56 (2h，t，j＝7.5hz，h-9)，2.59(2h，m，h-7)，1.80(2h，m，h-8)； 13c-nmr(125mhz，cd3od)δc：148.9(c-3)，145.6(c-4)，135.0(c-1)， 121.8(c-6)，116.1(c-5)，113.2(c-2)，62.3(c-9)，56.4(3-ome)， 35.8(c-8)，32.7(c-7)。
[0061]
dn-2：5-甲氧基-(+)-异芳香树脂醇 (5-methoxy-(+)-isolariciresinol)，无色油状，1h-nmr(500mhz， dmso-d6)δh：6.61(h，s，h-2
′
)，6.35(2h，s，h-2，h-6)，6.12 (h，s，h-5
′
)，3.75(h，d，j＝10hz，h-7)，3.71(3h，s，3
′‑
ome)， 3.69(6h，s，3，5-ome)，3.59(h，dd，j＝11hz，6hz，h-9
′
b)，3.45 (2h，m，h-9)，3.18(h，dd，j＝11hz，6hz，h-9
′
a)，1.86(h，m， h-8
′
)，1.64(h，m，h-8)；13c-nmr(125mhz，dmso-d6)δc：147.8 (c-3，c-5)，145.5(c-3
′
)，144.1(c-4
′
)，136.2(c-1)，133.7 (c-4)，132.5(c-6
′
)，127.1(c-1
′
)，116.2(c-5
′
)，111.7(c-2
′
)， 106.6(c-2，c-6)，63.5(c-9
′
)，59.7(c-9)，56.0(3，5-ome)，55.5(3
′‑
ome)，46.5(c-7)，45.6(c-8)，38.0(c-8
′
)，32.3(c-7
′
)。
[0062]
dn-3：丁香脂素(lyoniresinol)，无色油状，1h-nmr(600mhz，dmso-d6) δh：6.54(h，s，h-2
′
)，6.25(h，s，h-2，h-6)，4.20(h，d，j＝4.8hz， h-7)，3.74(3h，s，3
′‑
ome)，3.60(6h，s，3，5-ome)，3.69(h， m，h-9
′
a)，3.40(h，m，h-9
′
b)，3.27(3h，s，5
′‑
ome)，3.19(h， m，h-9)，2.58(h，dd，j＝15hz，4.2hz，h-7
′
a)，2.39(h，dd，j＝14.4hz， 11.4hz，h-7
′
b)，1.90(h，m，h-8)，1.44(h，m，h-8
′
)；13c-nmr (150mhz，dmso-d6)δc：147.5(c-3，c-5)，146.9(c-3
′
)，146.4 (c-5
′
)，137.8(c-1)，137.2(c-4
′
)，133.3(c-4)，128.6(c-1
′
)， 125.0(c-6
′
)，106.5(c-2
′
)，105.8(c-6
′
)，64.6(c-9
′
)，63.2 (c-9)，59.0(5
′‑
ome)，56.1(3，5-ome)，55.7(3
′‑
ome)，46.7 (c-8)，40.9(c-7)，40.1(c-8
′
)，32.3(c-7
′
)。
[0063]
2.产品的氧化活性结果：
[0064]
以vitc为阳性对照，按dpph法测试了本发明产品的抗氧化活性。实验结果如下表所示：
[0065][0066]
根据活性实验结果可以看出：本发明的产品均具有抗氧化活性，其活性与酚羟基的个数和所处的化学环境有关，dn-1酚羟基数量最少，活性最弱；dn-2与dn-3酚羟基个数一致，但化学环境不同导致两者的活性不一致，综上，考虑金钗石斛中的3个化合物的抗氧化活性与化合物中酚羟基的个数和所处的化学环境有关。
[0067]
本实施例的一个具体应用为：准备金钗石斛干燥茎10kg，然后对金钗石斛干燥茎原料经过粉碎、过筛得到均一粉末，金钗石斛干燥茎粉末经过 60％的乙醇溶液回流提取后，过滤浓缩得到醇提物，且提取时间为2n，提取次数为3次，过滤，浓缩滤液，得到乙醇浸膏，乙醇浸膏用5％盐酸水溶液溶解至无块状，用浓氨水调节溶液的ph为10，制备为碱水液，碱水液经过石油醚、二氯甲烷萃取(每种萃取剂萃取至有机层无色)，浓缩有机层，得到二氯甲烷浸膏(35g)，萃取时间为2n，萃取次数为3次，然后制备 dn-1、dn-2和dn-3，二氯甲烷浸膏经硅胶柱层析，伴样选用的是60-100 目硅胶，上柱选用的是100-200目硅胶，洗脱剂为二氯甲烷-甲醇(v/v；0:1、 100:1、50:1、10:1、8:1、5:1、0:1)梯度洗脱，结合薄层色谱分析(展开剂二氯甲烷-甲醇，10:1)，每个梯度收集3-5个柱体积，合并得到5个馏分(fr.a～e)，fr.b经过硅胶柱层析洗脱体系为二氯甲烷-甲醇(v/v， 100:1-8:1)，根据薄层色谱图特点，合并共得到4个次级馏分(fr. b-1～b-4)，fr.b-2经过ods柱层析，洗脱剂为75％甲醇-水溶液，合并得到的下一级馏分fr.b-2-5挥干溶剂后，用色谱甲醇溶解，过0.22μm滤膜，离心，上清液经半制备液相制备，制备条件38％色谱甲醇-水，收集保留时间为15min的色谱峰，收集完成后，用旋转蒸发仪蒸干制备液，得到单体化合物dn-1，蒸干样品取出部分干燥样品溶于cd3od用于核磁测试，通过一维核磁共振手段(1hnmr，13cnmr)鉴定了化合物dn-1的结构，为二氢松柏醇，fr.c经过凝胶柱层析，洗脱剂为二氯甲烷-甲醇(v/v，1:1)，通过薄层色谱图的特点，合并得到5个次级馏分(fr.c-1～c-5)。fr.c-3 挥干溶剂后，用色谱甲醇溶解，过0.22μm滤膜，离心，上清液经半制备液相制备，制备条件42％色谱甲醇-水，分别收集保留时间为
13min的色谱峰和保留时间为15min的色谱峰，收集完成后，用旋转蒸发仪蒸干制备液，得到单体化合物dn-2和dn-3，蒸干样品取出部分干燥样品溶于dmso-d6用于核磁测试，通过一维核磁共振手段(1hnmr，13cnmr)鉴定了化合物dn-2 和dn-3的结构，分别为5-甲基-异芳香树脂醇、丁香脂素，然后制备dn-4、 dn-5和dn-6，馏分d经过凝胶色谱柱分离、硅胶色谱柱分离和半制备液相制备和纯化得到化合物dn-4、dn-5，馏分e经过硅胶柱色谱柱分离和半制备液相制备和纯化得到化合物dn-6，然后进行抗氧化活性测试，准确称取 0.7886mgdpph，用甲醇定容于10ml容量瓶中，制备为浓度为0.2mmol/l 的dpph溶液，用甲醇将样品制备成浓度为1mg/ml的样品溶液，将不同浓度的样品溶液100μl和0.2mmol/l的dpph溶液100μl加入96孔板中，以维生素c为阳性对照，以不含dpph溶液的样品溶液作为对照空白对照，以仅含dpph溶液的孔为阴性对照，每组平行4个复孔，将96孔板置于酶标仪中，震荡1min并于此条件下保存，30min后测试其在517nm处的吸光度a值，自由基清除率＝[adpph
·
control-(asample-asample
·
control)]/ adpph
·
control
×
100％，其中adpph
·
control为阴性对照组吸光度的平均值；asample为样品组吸光度的平均值；asample
·
control为空白对照组吸光度的平均值。
[0068]
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
[0069]
以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为所述的具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。