一种调控番茄果实芳香物质合成的基因slect2及其应用
技术领域
1.本发明属于植物分子生物技术和基因工程技术领域，具体涉及一种调控番茄果实芳香物质合成的基因slect2及其应用。
背景技术：
2.果实是人类重要的食物，其品质主要包括色、香、味、质地和营养等。由于果实芳香品质与消费者喜好密切相关，有关果实芳香物质的形成与调控备受关注。番茄是研究果实芳香物质形成的模式材料，具有清晰的遗传背景，成熟的遗传转化体系和芳香物质物质分析方法。因此，深入研究番茄果实芳香物质形成及其调控机制对果实芳香品质改善和维持具有重要的理论价值和实践意义。
3.随着番茄果实的成熟，芳香物质含量增加。已鉴别出参与番茄重要芳香物质合成的基因，包括脂肪酸途径的slloxc、slhpl、sladh2和slaat1，类胡萝卜素途径slccd1以及支链氨基酸途径slbcat1等。目前番茄果实芳香物质合成的调控机制研究主要集中在转录因子和dna甲基化层面，是否存在其他层面的调控有待进一步探索。
4.表观遗传学是指基于非基因序列改变所致的基因表达水平的变化。在组蛋白修饰和dna甲基化基础上，rna甲基化修饰是目前表观遗传学研究领域的热点。rna修饰是一种转录后水平的调控方式，n6-甲基腺嘌呤(n6-methyladenosine,m6a)是含量最丰富的rna甲基化修饰。有关rna甲基化m6a识别蛋白slects的功能尚不清楚，在果实芳香物质合成中的作用也不明确。
技术实现要素：
5.本发明的目的是提供一种调控番茄果实芳香物质合成的基因slect2，slect2能够有效促进番茄果实芳香物质的合成。
6.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
7.本发明提供了一个有效调控番茄果实芳香物质合成的基因slect2。所述slect2基因的核苷酸序列如seq id no.1所示；slect2基因编码蛋白质的氨基酸序列如seq id no.2所示。
8.本发明提供了一种用于slect2基因突变的crispr/cas9基因编辑载体，所述载体为pylcrispr/cas9-slect2。所述载体可以表达靶向seq id no.1序列核酸分子的sgrna。所述sgrna的序列可为t1、t2、t3，所述t1序列为seq id no.1的第2001-2020位核苷酸，所述t2序列为seq id no.1的第1242-1261位核苷酸，所述t3序列为seq id no.1的第2022-2041位核苷酸。所述pylcrispr/cas9-slect2基因编辑载体为利用bsa i限制性内切酶在pylcrispr/cas9-p
ubi-h的多克隆位点间依次插入atu3d-t1-grna、atu3b-t2-grna和atu6-1-t3-grna得到的重组载体。
9.本发明提供了一种包含pylcrispr/cas9-slect2重组载体的微生物，所述微生物为农杆菌gv3101。
10.本发明提供的一个目的是提供所述基因slect2在有效调控番茄果实芳香物质含量中的应用，包括突变番茄中slect2基因可以显著降低番茄果实中芳香物质含量。
11.本发明的另一个目的是提供所述基因slect2作为番茄果实开展基因工程的重要候选基因在番茄育种以及改善番茄果实芳香品质中的应用。
12.本发明的有益效果：本发明提供了slect2基因在调控番茄果实芳香物质合成中的应用。突变slect2基因能够显著降低番茄果实芳香物质含量，说明slect2能够有效调控番茄果实芳香物质含量，可为培育芳香品质改善的优质番茄新品种提供新的候选基因资源。
附图说明
13.图1为slect2的3个靶序列(t1,t2,t3)及其在slect2基因上的具体位置。
14.图2为slect2基因纯合突变体slect2#17和slect2#22的基因编辑方式。
15.图3为slect2基因纯合突变体slect2#17和slect2#22的蛋白质突变结果。
16.图4为野生型和slect2基因纯合突变体成熟果实电子鼻分析结果。
17.图5为野生型和slect2基因纯合突变体成熟果实芳香物质含量分析结果。
具体实施方式
18.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细说明，实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三个生物学重复，结果取三者的平均值。
19.下述实施例中的野生型番茄品种solanum lycopersicum cv ailsa craig，简称ac(marian bemer et al.,the tomato fruitfull homologs tdr4/ful1 and mbp7/ful2 regulate ethylene-independent aspects of fruit ripening[j].the plant cell,2012,24(11):4437-4451)公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。实施例：slect2基因突变导致番茄果实芳香物质含量降低
[0020]
本实施例通过crispr/cas9技术突变番茄中slect2基因，发现该基因突变后成熟番茄果实中芳香物质含量与野生型相比显著降低。slect2基因dna序列为序列表中seq id no.1，编码序列表中seq id no.2所示的蛋白质。具体步骤如下：
[0021]
(一)pylcrispr/cas9-slect2基因编辑载体的构建
[0022]
靶序列的选择：所选靶位点序列为t1(seq id no.1的第2001-2020位核苷酸)、t2(seq id no.1的第1242-1261位核苷酸)、t3(seq id no.1的第2022-2041位核苷酸)，t1、t2和t3在seq id no.1中的位置如图1所示。
[0023]
启动子的选择：使用拟南芥来源的atu3d启动t1靶位点，atu3b启动t2靶位点，atu6-1启动t3靶位点。
[0024]
含有靶位点的sgrna表达盒的制备：经过2轮pcr，分别获得atu3d-t1-grna、atu3b-t2-grna和atu6-1-t3-grna3个dna片段。atu3d-t1-grna为包含靶向t1位点的sgrna的表达盒，其表达由atu3d启动子驱动；atu3b-t2-grna为包含靶向t2位点的sgrna的表达盒，其表达由atu3b启动子驱动，atu6-1-t3-grna为包含靶向t3位点的sgrna的表达盒，其表达由
atu6-1启动子驱动。制备方法如下：第一轮pcr反应体系为25μl，包含kod酶(toyobo)0.5μl、10
×
kod plus buffer(toyobo)2.5μl、dntp 2.5μl、mgso41.5μl、pylgrna-lacz-atu3d/atu3b/atu6-1质粒1μl、u-f引物(5μmol/l)1μl、gr-r引物(5μmol/l)1.0μl、gr-slect2-t1/t2/t3引物2.5μl、atu-slect2-t1/t2/t3引物2.5μl、ddh2o 10μl。pylgrna-lacz-atu3d质粒、pylgrna-atu3b质粒、pylgrna-atu6-1质粒均记载在文献(ma et al.,a robust crispr/cas9 system for convenient,high-efficiency multiplex genome editing in monocot and dicot plants[j].molecular plant,2015,8(8):1274-1284)中。第一轮pcr反应程序为：94℃60s；94℃10s，58℃15s，68℃20s，28个循环；68℃7min。pcr反应结束后，获得3种pcr产物。第二轮pcr反应体系为20μl，包含kod酶(toyobo)0.5μl、10
×
kod plus buffer(toyobo)2.0μl、dntp 2.0μl、mgso
4 1.2μl、第一轮pcr反应产物(稀释10倍)1.0μl、特异性引物对(pps-ggl、pgs-gg2或pps-gg2、pgs-gg3或pps-gg3、pgs-ggr，1.5μmol/l)2.0μl、ddh2o 11.3μl。第二轮pcr反应程序为：94℃60s；94℃10s，58℃15s，68℃20s，25个循环；68℃7min。第二轮pcr反应结束后，将3种pcr产物等量混合后进行纯化。两轮pcr反应中所用引物序列如表1所示。
[0025]
表1、载体构建引物序列载体构建引物序列
[0026]
pylcrispr/cas9-slect2重组载体的制备：采用golden gate cloning方法(ma et al.,robust crispr/cas9 system for convenient,high-efficiency multiplex genome editing in monocot and dicot plants[j].molecular plant,2015,8(8):1274-1284)完成目的sgrna表达盒与pylcrispr/cas9-p
ubi-h载体的酶切连接反应。反应体系为：10
×
cutsmart buffer(neb)1.5μl、pylcrispr/cas9-p
ubi-h载体2.0μl、经过纯化的atu3d-t1-grna、atu3b-t2-grna和atu6-1-t3-grna三个dna片段的混合物1.0μl、bsai-hf(neb)0.5μl、t4 dna ligase(promaga)1.0μl、10
×
t4 dna ligase buffer(promaga)1.5μl、ddh2o 7.5μl。反应条件为：37℃10min，10℃5min，20℃5min，3个循环；37℃3min，10℃5min，20℃5min，
10个循环；37℃5min。将连接产物转入大肠杆菌dh5α感受态细胞，挑取阳性菌落提取质粒，测序正确后转入农杆菌gv3101感受态细胞。
[0027]
(二)番茄的遗传转化
[0028]
采用农杆菌介导的叶盘转化法将pylcrispr/cas9-slect2基因编辑载体转化野生型ac番茄。所有操作均在无菌工作台中进行，具体操作步骤如下：
[0029]
(1)播种：取适量ac番茄种子于无菌培养皿中，分别用75％的乙醇和4％次氯酸钠溶液消毒5min和8min，用无菌水清洗数次后将种子播种于种子萌发培养基t0。
[0030]
种子萌发：将种子置于暗室培养直至出芽后置于光下培养，待子叶完全展开后用于下一步操作。
[0031]
预培养：将番茄子叶剪成5
×
5mm的方块，背面向上放置于铺有一层滤纸的t1预培养基上。
[0032]
制备侵染液：挑取转入pylcrispr/cas9-slect2基因编辑载体的农杆菌单菌落于3ml含有相应抗生素的lb培养基中，28℃过夜震荡培养。次日吸取300μl菌液于20ml含有相应抗生素的lb培养基中，28℃震荡培养至od
600
达到0.5-0.6。5000rpm离心10min收集菌体，用无菌水将菌液稀释至0d
600
＝0.1-0.2。
[0033]
共培养：将预培养2d的外植体置于侵染液中侵染5min后倒掉侵染液，将外植体重新放回预培养培养基t1中，于暗室中共培养2d。
[0034]
芽诱导培养：将外植体从暗室取出，背面向下置于芽诱导培养基t21中，25℃16h光照/8h黑暗条件下培养7d之后转入新鲜的t21培养基继代培养，直至外植体长出愈伤组织并长出小叶。
[0035]
芽伸长培养：待外植体长出小叶后转入芽伸长培养基t22中直至茎伸长至4-5cm。
[0036]
生根培养：茎伸长后剪去愈伤组织，转入生根培养基t3中直至根系发达。
[0037]
土培：将小苗从t3培养基中移出，洗净培养基后将小苗转入湿润的土盆中土培，注意保湿。
[0038]
培养基配方如下：t0：ms盐1.77g，蔗糖12g，调节ph至5.8，琼脂5.33g；t1：ms盐3.55g，蔗糖24g，调节ph至5.8，琼脂5.33g，灭菌后加6-ba 至浓度为1mg/l、iaa至浓度为0.1mg/l；t21：ms盐3.55g，蔗糖24g，调节ph至5.8，琼脂5.33g，灭菌后加入潮霉素至浓度为10mg/l、特美汀至浓度为200mg/l、玉米素至浓度为1mg/l、iaa至浓度为0.1mg/l；t22：ms盐3.55g，蔗糖24g，调节ph至5.8，琼脂5.33g，灭菌后加入潮霉素至浓度为10mg/l、特美汀至浓度为200mg/l、玉米素至浓度为0.5mg/l、ga至浓度为1mg/l；t3：ms盐1.77g，蔗糖24g，调节ph至5.8，琼脂5.33g，灭菌后加入潮霉素至浓度为5mg/l、特美汀至浓度为150mg/l、iba至浓度为2mg/l。
[0039]
(三)slect2基因突变纯合体的筛选
[0040]
以步骤(二)所得的slect2基因编辑植株的基因组dna为模板，分别利用每个靶序列上下游约300bp附近设计的pcr引物扩增靶序列附近的600bp左右的dna序列，并进行测序以检测slect2基因编辑方式，靶点pcr引物及测序引物见表2。
[0041]
表2、靶点检测引物序列
[0042]
测序成功后通过crispr靶点编辑方式分析网站dsdecode(http://dsdecode.scgene.com/)并结合人工读峰图的方式与基因标准序列进行比对，对各个靶序列及其上下游序列的编辑方式进行分析。
[0043]
通过上述方式筛选到的slect2基因纯合突变体slect2#17和slect2#22的基因编辑方式如图2所示。在slect2#17突变体中，t1位点发生14个核苷酸的缺失，即seq id no.1的第2004-2017位核苷酸gctgaagctgttgc缺失。在slect2#22突变体中，t1位点发生1个核苷酸的缺失，即seq id no.1的第2017位核苷酸c缺失。上述核苷酸缺失均导致slect2基因发生移码突变，蛋白翻译提前终止，yth结构域缺失，slect2#17获得剩余12个氨基酸的截短蛋白；slect2#22获得剩余23个氨基酸的截短蛋白，如图3所示。
[0044]
(四)基于电子鼻的番茄果实感官评价分析
[0045]
选取野生型、slect2#17和slect2#22突变体成熟果实(破色后7天)，每种样品各3个生物学重复，每个生物学重复为随机6个果实的混合物，用液氮研磨成粉末，称取1g粉末于10ml离心管中，加入5ml饱和nacl溶液，充分涡旋混匀。吸取2ml于进样瓶中(每个生物学重复设置2个技术重复)，置于冰上备用。每个进样瓶于40℃加热30min后，抽取2ml顶空气体用电子鼻(αfox4000，alpha-mos，法国)检测样品间的香味差异，载气为空气(杭州今工特种气体有限公司)，采集时间：120s，采集周期：1s，延滞时间：240s，(载气)流速：150ml/min，注射体积：500μl，注射速度：500μl/min。采用系统自带的判别函数分析(discriminant function analysis，dfa)方法进行数据分析。
[0046]
如图4的dfa分析结果可以看出：在df1维度，slect2#17和slect2#22突变体聚在一起，能够与野生型(wt)明显区分开来，说明slect2#17和slect2#22突变体和野生型成熟果实在香气方面存在显著差异。
[0047]
(五)番茄果实挥发性芳香物质含量分析
[0048]
选取野生型、slect2#17和slect2#22突变体成熟果实(破色后7天)，每种样品各3个生物学重复，每个生物学重复为随机6个果实的混合物，用液氮研磨成粉末，称取5g粉末于20ml液相色谱进样瓶，加入5ml饱和nacl溶液和20μl内标2-辛醇(0.8mg/ml)，涡旋混匀后放入样品盘。利用顶空固相微萃取(hs-spme)结合气相色谱质谱联用(gc-ms)技术测定芳香物质的成分与含量。样品经40℃恒温平衡30min后，用萃取头50/30μmdvb/car/pdms进行30min固相微萃取。萃取头在gc-ms(agilent 7890-5975)进样口解吸附15min后用db-wax毛细管色谱柱(0.25mm，30m，0.25μm，j&w scientific)进行分离。升温程序为从40℃以4℃
·
min-1
速率升至230℃，然后再以100℃
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min-1
速率升至260℃，保持11.7min。以1.0ml
·
min-1
氦气(杭州今工特种气体有限公司)为载气，ms离子源温度230℃，采用电子轰击电离方式，电子能量为70ev。芳香物质的定性通过与nist-8(nist/epa/nih，美国)标准谱库比对确定，
定量计算以内标的峰面积作为参考。
[0049]
野生型和slect2突变体成熟果实芳香物质含量见图5，slect2#17和slect2#22突变体成熟果实芳香物质含量均显著低于野生型，具体为与野生型相比降低了29.13％和26.84％。说明slect2基因突变可以显著降低番茄果实中芳香物质含量，slect2基因可以促进番茄果实中芳香物质的合成。