一株高产乳酸的格氏乳球菌wbt0008及其应用
技术领域
1.本发明涉及微生物，特别是一株高产乳酸的格氏乳球菌wbt0008及其应用。


背景技术：

2.乳酸菌作为和人类生活接触最为密切的一类的益生菌，广泛地应用在食品、饲料、医学等多个领域，是公认的食品级安全菌株。在食品业，乳酸菌的应用历史悠久，其在肉、蛋、奶等多种食物中均有应用，可以改善食物的风味，提高食物的营养价值。在饲料业，乳酸菌可以提高饲料利用率，提高养殖效率，减少化学药和抗生素的使用。在医学领域，乳酸菌可以调节机体肠道菌群平衡，防治心血管疾病，提高机体抗氧化能力和免疫力。乳酸菌不仅具备多种益生功能，还能产生多种活性代谢产物，其中乳酸作为乳酸菌发酵产生的主要代谢产物能够对多种有害菌表现出抑制生长的能力。研究发现食物中的致病菌往往是导致食物腐败、影响食物安全的重要因素，由于目前所用的化学和物理保鲜手段对保鲜食物的口感影响较大，使得生物保鲜手段在食品保鲜应用上成为一种新型技术。格氏乳球菌作为一种重要的益生菌，近年来在食品发酵方面应用较多，但在高产乳酸及抑制有害菌生长及延长食物保鲜时间方面的应用较少，因此利用格氏乳球菌生产乳酸及其发酵产物来抑制食物中有害菌的生长、延长食物的保鲜时间能够克服以往的技术缺陷，表现出明显优势，应用前景广阔，但至今未见有公开报导。


技术实现要素：

3.针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一株高产乳酸的格氏乳球菌wbt0008及其应用，可有效解决高产乳酸及制备保鲜剂，抑制有害菌的问题。
4.本发明解决的技术方案是，一株高产乳酸的格氏乳球菌wbt0008，分类命名为格式乳球菌(lactococcus garvieae)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号cgmcc no.22576，保藏日期2021年5月20号，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；
5.该格氏乳球菌wbt0008在高产乳酸中的应用；
6.该格氏乳球菌wbt0008在制备抑制有害菌菌剂的应用，所述的有害菌为金黄色葡萄球菌、沙门氏菌或大肠菌群；
7.该格氏乳球菌wbt0008在制备新鲜牛排保鲜剂中的应用。
8.本发明是新筛选的一株格氏乳球菌wbt0008，可有效用于高产乳酸的制备、抑制有害菌的应用及新鲜牛排保鲜的应用，制备和应用方法简单，绿色环保，既提供了一株新的格氏乳球菌，又开拓了格氏乳球菌的新用途，具有广阔的应用前景，经济和社会效益巨大。
附图说明
9.图1为本发明格氏乳球菌24h乳酸含量变化图。
具体实施方式
10.以下结合具体情况和实施例对本发明的具体实施方式作详细说明。
11.实施例1
12.本发明在具体实施中，一种高产乳酸菌株wbt0008，分类命名为格氏乳球菌(lactococcus garvieae)，取河南省济源市猪场周边土壤样品，称取1g土壤样品用无菌水制成10ml悬液，然后依次稀释成10-3
、10-4
、10-5
样品稀释液，然后分别吸取0.1ml涂布于碳酸钙筛选平板上，于37℃恒温培养箱培养48h，观察透明圈，选择透明圈较为明显的菌株，筛选得到编号为wbt0008的菌株，所述的碳酸钙筛选平板：蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母膏5g、柠檬酸二铵2g、乙酸钠5g、葡萄糖20g、吐温80ml、硫酸镁0.5g、硫酸锰0.25g、碳酸钙10g、琼脂18g，加蒸馏水至1000ml，121℃灭菌25分钟，冷却备用，而后制备平板；筛选得到编号为wbt0008的菌株，分类命名为格式乳球菌(lactococcus garvieae)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号cgmcc no.22576，保藏日期2021年5月20号，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
13.实施例2
14.本发明菌株wbt0008在高产乳酸中的应用，包括以下步骤：
15.(1)菌种活化及种子培养：将冻存保藏菌株wbt0008，活化以后按照接种量1％接种于种子培养基中，37℃、180r/min培养24h；所述种子培养基为：葡萄糖50g、蛋白胨10g、酵母膏10g、乙酸钠5g、柠檬酸二铵0.2g、磷酸氢二钾0.2g，吐温80ml、硫酸镁0.2g、硫酸锰0.02g、硫酸亚铁0.01g、ph6.3-6.6，加蒸馏水至1000ml，121℃灭菌25分钟，冷却备用；
16.(2)乳酸制备：将上述种子液按照mrs培养基体积量2％接种于mrs培养基中，37℃、180r/min摇床培养发酵48h，得发酵液，即为乳酸；
17.所述mrs液体培养基为：蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母膏5g、柠檬酸二铵2g、乙酸钠5g、葡萄糖20g、吐温80ml、硫酸镁0.5g、硫酸锰0.25g，加蒸馏水至1000ml，ph6.2-6.4，121℃灭菌25分钟，冷却制成；
18.(3)乳酸含量测定：
19.将制得的发酵液乳酸在4h、8h、12h、16h、20h、24h取样，每组三个重复，并于4℃、12000r/min条件离心8min，取上清测定乳酸含量，乳酸在乳酸脱氢酶的作用下氧化生成丙酮酸，同时还原mtt生成紫色物质，该物质在570nm处有特征吸收峰，利用其与乳酸浓度成正比关系计算乳酸含量为2～11g/l/ml，测定公式为：
[0020][0021]
式中：a表示发酵上清的吸光度，a0表示空白吸光度，k表示标准曲线斜率，b表示标准曲线截距，1176.67表示换算系数。
[0022]
如图1所示，菌株wbt0008在24h内的乳酸最高产生量达到10.60g/l，说明该菌株在较短时间内能够实现乳酸的高产量，其是一种高效发酵生产乳酸的优良菌株。
[0023]
实施例3
[0024]
本发明格氏乳球菌wbt0008在制备抑制有害菌菌剂中的应用方法，包括以下步骤：
[0025]
(1)乳酸菌制备
[0026]
格氏乳球菌wbt0008接种于mrs液体培养基37℃摇床培养48小时，培养菌体浓度在1×
108cfu/ml，而后菌液于在4℃、12000r/min离心20min取上清液，得抑制有害菌的抑菌剂；
[0027]
所述的有害菌为金黄色葡萄球菌、沙门氏菌或大肠菌群。
[0028]
(2)抑菌活性测试
[0029]
抑菌活性测试采用滤纸片法，有害菌接种于lb液体培养基，37℃摇床培养24小时，吸取菌液200μl均匀涂布于营养琼脂平板，然后将灭菌的直径5mm滤纸片放置于涂布好的平板上，在滤纸片上滴加格氏乳球菌剂离心上清液10μl，37℃培养24小时，观察并测定抑菌圈直径。
[0030]
实施例4
[0031]
本发明格氏乳球菌wbt0008在抑制有害菌中的应用，包括以下步骤：
[0032]
(1)乳酸菌制备
[0033]
格氏乳球菌wbt0008接种于mrs液体培养基37℃摇床培养48小时，培养菌体浓度在1
×
108cfu/ml，而后菌液于在4℃、12000r/min条件离心20min取上清液作抑菌测试备用。
[0034]
(2)抑菌活性测试
[0035]
抑菌活性测试采用滤纸片法，沙门氏菌atcc14028接种于lb液体培养基37℃摇床培养24小时，吸取菌液200μl均匀涂布于营养琼脂平板，然后将两片灭菌的直径5mm滤纸片放置于涂布好的平板上，实验组在滤纸片上滴加菌株wbt0008离心上清液10μl，对照组滴加无菌水10μl，37℃培养24小时，观察并测定抑菌圈直径，发现实验组沙门氏菌抑菌圈外径达到12.6毫米，证明菌株wbt0008上清液确实可以抑制沙门氏菌的生长，且效果显著。
[0036]
实施例5
[0037]
本发明菌株格氏乳球菌wbt0008在抑制有害菌中的应用，包括以下步骤：
[0038]
(1)乳酸菌制备
[0039]
格氏乳球菌wbt0008接种于mrs液体培养基37℃摇床培养48小时，培养菌体浓度在1
×
108cfu/ml，而后菌液于在4℃、12000r/min条件离心20min取上清液作抑菌测试备用。
[0040]
(2)抑菌活性测试
[0041]
抑菌活性测试采用滤纸片法，金黄色葡萄球菌atcc25923接种于lb液体培养基37℃摇床培养24小时，吸取菌液200μl均匀涂布于营养琼脂平板，然后将两片灭菌的直径5mm滤纸片放置于涂布好的平板上，实验组在滤纸片上滴加菌株wbt0008离心上清液10μl，对照组滴加无菌水10μl，37℃培养24小时，观察并测定抑菌圈直径，发现实验组金黄色葡萄球菌抑菌圈外径达到10.7毫米，证明菌株wbt0008上清液确实可以抑制金黄色葡萄球菌的生长，且效果显著。
[0042]
实施例6
[0043]
本发明菌株格氏乳球菌wbt0008在抑制有害菌中的应用，包括以下步骤：
[0044]
(1)乳酸菌制备
[0045]
格氏乳球菌wbt0008接种于mrs液体培养基37℃摇床培养48小时，培养菌体浓度在1
×
108cfu/ml，而后菌液于在4℃、12000r/min条件离心20min取上清液作抑菌测试备用。
[0046]
(2)抑菌活性测试
[0047]
抑菌活性测试采用滤纸片法，大肠杆菌atcc25922接种于lb液体培养基37℃摇床培养24小时，吸取菌液200μl均匀涂布于营养琼脂平板，然后将两片灭菌的直径5mm滤纸片
放置于涂布好的平板上，实验组在滤纸片上滴加菌株wbt0008离心上清液10μl，对照组滴加无菌水10μl，37℃培养24小时，观察并测定抑菌圈直径，发现实验组金大肠杆菌抑菌圈外径达到11.2毫米，证明菌株wbt0008上清液确实可以抑制大肠杆菌的生长，且效果显著。
[0048]
实施例7
[0049]
本发明菌株wbt0008在新鲜牛排保鲜中的应用，包括以下步骤：
[0050]
(1)乳酸菌制备
[0051]
格氏乳球菌wbt0008按照接种量2％接种于mrs液体培养基37℃摇床培养48小时，培养菌体浓度在3
×
108cfu/ml，而后菌液于在4℃、12000r/min条件离心20min取上清液作抑菌测试备用。
[0052]
(2)牛排保鲜测试
[0053]
取用新鲜程度一致的牛排，将发酵上清用洁净无菌喷壶均匀喷洒于新鲜牛排的表面，对照采用无菌水均匀喷洒于牛排表面，而后用无菌保鲜膜完全覆盖。按照国家标准《gb 4789.10-2016金黄色葡萄球菌检验》、《gb 4789.4-2016沙门氏菌检验》、《gb 4789.3-2010大肠菌群计数》分别于6h、12h、18h、24h、30h进行金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠菌群计数。结果如表1、2、3所示，与对照组相比，喷洒上清液的实验组的金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌数量明显低于对照组，30h内的保鲜效果提高了2～6倍，说明菌株wbt0008在牛排保鲜过程效果较好，具有较高的应用价值。
[0054]
表1牛排保鲜测试金黄色葡萄球菌数量变化(lg cfu/ml)
[0055][0056]
注：表中对照组和实验组均为三次重复的平均值
±
标准差
[0057]
表2牛排保鲜测试沙门氏菌数量变化(lg cfu/ml)
[0058][0059]
注：表中对照组和实验组均为三次重复的平均值
±
标准差
[0060]
表3牛排保鲜测试大肠杆菌数量变化(lg cfu/ml)
[0061][0062]
注：表中对照组和实验组均为三次重复的平均值
±
标准差
[0063]
本发明菌株是新筛选出的一株高产乳酸的菌株wbt0008，分类命名为格氏乳球菌(lactococcus garvieae)，并经实地应用取得了非常好的有益技术效果，有关资料如下：
[0064]
1、菌株wbt0008的筛选
[0065]
取河南省济源市猪场周边土壤样品，称取1g土壤样品用无菌水制成10ml悬液，然后依次稀释成10-3
、10-4
、10-5
样品稀释液，然后分别吸取0.1ml涂布于碳酸钙筛选平板上，于37℃恒温培养箱培养48h，观察透明圈，选择透明圈较为明显的菌株，筛选得到编号为wbt0008的菌株，所述的碳酸钙筛选平板：蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母膏5g、柠檬酸二铵2g、乙酸钠5g、葡萄糖20g、吐温80ml、硫酸镁0.5g、硫酸锰0.25g、碳酸钙10g、琼脂18g，加蒸馏水至1000ml，121℃灭菌25分钟，冷却备用，而后制备平板。
[0066]
2、菌株的鉴定
[0067]
(1)形态学观察
[0068]
菌株wbt0008菌落较小呈白色、表面光滑有光泽，近圆形、边缘整齐、成链排列，无分泌物，革兰氏染色呈阳性。
[0069]
(2)生理生化分析
[0070]
通过生理生化实验，发现菌株能够分解七叶苷、纤维二糖、麦芽糖、甘露醇、水杨苷、蔗糖、菊糖、乳糖、马尿酸钠，不能分解山梨醇、棉子糖，具体结果参见表4。
[0071]
表4格氏乳球菌wbt0008生化反应结果
[0072][0073]
注：+表示阳性，-表示阴性
[0074]
(3)分子生物学分析
[0075]
经16s rdna序列分析，利用细菌基因组提取试剂盒对wbt0008菌株的基因组进行提取。而后进行pcr，引物序列：27f:5'-agagtttgatcctggctcag-3'1492r:5'-ggttaccttgttacgactt-3'。反应体系50μl：ddh2o 21μl，1492r 1.5μl、27f 1.5μl，taqmix酶25μl，样菌模板dna1μl。pcr程序：94℃预变性4min，96℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s，32个循环，72℃延伸10min。而后将pcr产物送华大基因公司测序，序列信息见序列表。将16s rdna序列在ncbi官网的数据库进行blast比对，构建系统发育树，进行同源性比较分析，发现该菌株与格氏乳球菌同源相近。结合形态学结果、生理生化结果及16s rdna序列分
析结果，确定其为格氏乳球菌，分类命名为格式乳球菌(lactococcus garvieae)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号cgmcc no.22576，保藏日期2021年5月20号，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
[0076]
16s rdna序列：
[0077][0078]
上述筛选得到的格氏乳球菌wbt0008经实地应用，具有很好的高产乳酸，具体试验情况见实施例2，在24h内的乳酸最高产生量达到10.60g/l，说明该菌株在较短时间内能够实现乳酸的高产量；在制备抑制有害菌菌剂中的应用，抑制沙门氏菌抑菌圈外径达到12.6毫米，证明菌株wbt0008上清液确实可以抑制沙门氏菌的生长，抑制金黄色葡萄球菌抑菌圈外径达到10.7毫米，证明菌株wbt0008上清液确实可以抑制金黄色葡萄球菌的生长，抑制大肠杆菌抑菌圈外径达到11.2毫米，证明菌株wbt0008上清液确实可以抑制大肠杆菌的生长，且效果显著；在新鲜牛排保鲜中的应用，抑菌保鲜效果显著，在30h内，单位lg cfu/ml，金黄色葡萄球菌数2.66
±
0.01、沙门氏菌数量1.28
±
0.01、大肠杆菌数量1.39
±
0.03，详见表1～表3，30h内的保鲜效果提高了2～6倍。
[0079]
由上述可以清楚表明，本发明是新筛选的一株格氏乳球菌wbt0008，可有效用于高产乳酸的制备、抑制有害菌的应用及新鲜牛排保鲜的应用，制备和应用方法简单，能有效提高食物保鲜效果，绿色环保，既提供了一株新的格氏乳球菌，又开拓了格氏乳球菌的新用途，具有广阔的应用前景，经济和社会效益巨大。