1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种黄色黏球菌大片段敲除质粒及其敲除方法。


背景技术：

2.黏细菌能够产生结构新颖、种类丰富、作用机制多样的生物活性代谢产物，主要包括：肽类，大环类，芳香族等，在农业、医药等方面具有重要的研究和应用价值。由于绝大多数黏细菌存在聚团生长、菌落生长缓慢、难以形成单菌落等现象使得其很难进行遗传操作，严重阻碍了黏细菌中生物活性代谢产物的开发和利用。黄色黏球菌dk1622具有较好的分散性和较快的生长速度是研究黏细菌生物活性代谢产物异源表达的理想模式菌株。但是现有的敲除方法在构建基因组大片段敲除方面存在筛选强度大、突变体纯化时间长等问题，严重制约了dk1622作为底盘工程菌株的应用。


技术实现要素：

3.本发明的目的是提供一种黄色黏球菌大片段敲除质粒，即利用其构建黄色黏球菌大片段敲除的方法。本发明是基于同源重组技术利用两种不同的正负筛选技术，将dk1622基因组上的目的片段敲除。该方法不但提高了黏细菌突变体的筛选效率，而且缩短了获得突变体的时间。
4.本发明的第一个目的是提供大片段敲除质粒pbj116，将pila基因的启动子片段p
pila
和sacb基因的orf片段融合获得p
pila-sacb的模块，扩增出四环素抗性基因，获得p
tet-tcr模块，将p
pila-sacb模块和p
tet-tcr模块构建到pbj113载体的bamhi和xbai位点，获得质粒pbj116；
5.所述的pila基因的启动子片段p
pila
的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述的sacb基因的orf片段的核苷酸序列如seq id no.2所示)，所述的四环素抗性基因的核苷酸序列如seq id no.3所示。
6.优选，所述的大片段敲除质粒pbj116的核苷酸序列如seq id no.4所示。
7.本发明的第二个目的是提供敲除质粒pbj116在敲除目的片段中的应用。
8.优选是大片段敲除质粒pbj116在敲除黄色黏球菌中目的片段中的应用
9.本发明的第三个目的是提供一种大片段敲除的方法，设定待敲除基因的上游同源臂和下游同源臂序列，扩增后，将上游同源臂插入质粒pbj116的p
pila-sacb模块的前面，将下游同源臂插入质粒pbj116的p
tet-tcr模块的后面，获得敲除质粒，将敲除质粒转入宿主菌中与待敲除基因发生同源重组，利用卡那霉素正向筛选标记、半乳糖负向筛选标记、四环素正向筛选和蔗糖负向筛选模块，筛选获得敲除待敲除基因的宿主菌。
10.优选，所述的宿主菌是黄色黏球菌。
11.优选，所述的待敲除基因是myxochelin a编码基因mxan_3618。
12.优选，具体的步骤为：
13.首先构建mxan_3618基因的上游同源臂myxa-up-flank，利用引物myxa-1和myxa-2扩增上游同源臂1-2；同时利用引物myxa-3和myxa-4扩增上游同源臂3，以上游同源臂1-2和上游同源臂3为模板，利用myxa-1和myxa-4引物进行pcr扩增，获得上游同源臂的融合片段myxa-up-flank，利用同源重组将这该片段构建到pbj116质粒的saci和bamhi位点，获得pbj116-myxa(up)质粒；利用引物myxa-5和myxa-6扩增下游同源臂2，利用引物myxa-7和myxa-8扩增下游同源臂3-4，以下游同源臂2和下游同源臂3-4为模板，利用myxa-5和myxa-8引物进行pcr扩增，获得下游同源臂的融合片段myxa-down-flank，利用同源重组将这该片段构建到pbj116-myxa(up)质粒的xbai和sali位点，从而获得pbj116-myxa敲除质粒；将连接的质粒转化到大肠杆菌中，提取pbj116-myxa敲除质粒；
14.制得黄色黏球菌dk1622感受态，将pbj116-myxa敲除质粒转化到黄色黏球菌dk1622感受态中，利用含卡那霉素的培养基筛选，获得单交换菌株，再利用含半乳糖的培养基筛选双交换菌株，然后用含四环素的培养基筛选，再利用含有蔗糖的培养基筛选，获得基因mxan_3618敲除的黄色黏球菌；
15.引物名称序列(5
’‑3’
)myxa-1acggccagtgaattcgagctcgctcgtcctgagcgccgamyxa-2gtcactcactgctcttcggggagggtgagcmyxa-3cccgaagagcagtgagtgacccgcaggcmyxa-4cagcacgggtcttcaggatccctactgggatactgactcggtcgmyxa-5gcgcagggctttatttctagaatgactgacatctctcgggccmyxa-6gtcactcactgctcttcggggagggtgagcmyxa-7cccgaagagcagtgagtgacccgcaggcmyxa-8cttgcatgcctgcaggtcgacagcccacccgatctcccc
16.。
17.本发明第四个目的是提供敲除黄色黏球菌的myxochelina编码基因δmxan_3618在降低黄色黏球菌捕食铜绿假单胞菌中的应用。
18.本发明的质粒pbj116，其含有卡那霉素正向筛选标记、半乳糖负向筛选标记、四环素正向筛选和蔗糖负向筛选模块，通过两次正负筛选系统，实现黄色黏球菌基因组上大片段的敲除。经试验发现，本发明的方法获得的myxochelin a编码基因δmxan_3618突变体产生铁载体的水平显著降低，并且捕食铜绿假单胞菌的能力显著降低。并且该方法所需的时间较短。
附图说明
19.图1是pbj116敲除系统构建的示意图。(a)pbj116构建；(b)δmxan_3618突变体构建的流程图。
20.图2是δmxan_3618突变体pcr鉴定结果。
21.图3是δmxan_3618突变体突变位点的测序分析。
22.图4是竞争实验分析mxan_3618基因缺失对黏细菌捕食铜绿假单胞菌的影响。
myxa敲除质粒。通过电转化的方法将质粒转化到dk1622中，加入1ml的ctt液体培养基30℃，200rpm，震荡培养4-6h，采用软琼脂稀释涂布到ctt+kan(50μg/ml)平板，置于30℃培养箱中，培养3-7天。待长出转化子后，挑取转化子到新的ctt+kan(50μg/ml)平板上，刮取少量菌体，提取基因组，然后利用myxa-5det和pbj116-3det(或myxa-3det和pbj116-5det)进行单交换菌株的pcr验证，获得正确的单交换菌株。
30.采用半乳糖负向筛选第一次双交换的菌株，其方法是：刮取适量ctt+kan平板上生长的单交换菌株，进行梯度稀释。然后，采用软琼脂稀释涂布到ctt+1％半乳糖(质量百分比浓度)+盐酸四环素(tcr)(10μg/ml)的培养基筛选第一次双交换的菌株。待长出单菌落后，将单菌落转接到新的ctt+1％半乳糖+tcr平板上培养。提取基因组利用引物3618-5det和3618-3det对双交换菌株进行pcr验证，获得正确的含有sacb-tcr模块的双交换菌株。
31.采用蔗糖负向筛选获得目标的菌株，其方法是：刮取适量ctt+1％半乳糖+tcr平板上生长的双交换菌株，进行梯度稀释。然后，采用软琼脂稀释涂布到ctt+12％蔗糖(质量百分比浓度)的培养基筛选目标的菌株。在进行蔗糖负向筛选时选择的蔗糖浓度为12％，发现蔗糖的筛选效果比较好。同样，利用myxa-5det和myxa-3det引物对突变体进行鉴定，结果如图2所示，5号和9号突变体能够扩增出预期的3100bp左右的条带，表明δmxan_3618突变体构建成功。选择9号δmxan_3618突变体提取基因组，扩增敲除位点两侧的序列进行测序分析，结果如图3所示。结果表明，测序的结果与设计的位点一致，证明敲除突变体构建成功。该结果证实了利用pbj116质粒在dk1622中进行大片段的敲除是可行的。
32.我们采用竞争实验分析了mxan_3618基因缺失对捕食能力的影响，验证该方法获得突变体的功能。结果如图4所示，与dk1622相比，在tpm条件下，mxan_3618基因缺失的确导致粘细菌捕食能力的降低。
33.表1本发明中所涉及的引物序列
[0034][0035]
[0036]
以上所述的实施例仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。