高效降解二甲基乙酰胺的赤红球菌hjm-8及应用
技术领域
1.本发明涉及微生物领域，尤其涉及一株高效降解二甲基乙酰胺的赤红球菌hjm-8及应用。
背景技术：
2.二甲基乙酰胺(dmac)是重要的化工原料和性能优良的溶剂，广泛应用于聚氨酯、腈纶、医药、农药、染料和电子等行业。dmac具有一定的毒性，排放到环境中会对环境和人类有毒害作用，同时也较难生物降解。
3.dmac是合成纤维如丙烯晴、聚氨酯纺织以及聚氨酯树脂合成工业中的重要溶剂，同时也可以作为c8镏分分离苯乙烯萃取溶剂被使用，由于其极强的互溶性，dmac在医药，高分子膜，染料涂料合成领域也受到广泛的使用。dmac废水的主要来源包括染料、皮革制造、化工合成等工业，其危害是高浓度、强毒性、难降解。生化法是利用细菌对废水中的污染物进行生物降解的方法，其工艺特点为低能耗，高处理效率，低处理成本等。在当今水处理产业中，生化法是使用最为广泛的一种工艺流程，在许多行业的水处理工艺中均得到认可。在不同废水处理方法中，生化处理有着成本低，处理效率高，没有二次污染的优势，故被广泛利用，是应用最多的水处理工艺。而如何提高生化处理效率便随之受到人们的研究与关注。生物强化技术，即生物增强技术，是从污泥或土壤中筛选一些优势菌种，并将其投入至废水中，可以有针对的去除废水中的某种或多种污染物，进而提高废水的生物处理效果的方法。该技术产生于上世纪七十年代中期，之后便得到很大的关注并得到很大的发展。生物增强的主要作用机制包括高效降解菌的直接作用和微生物的共代谢作用。高效降解菌的直接作用是微生物降解技术应用最为广泛、最为普遍的作用方式，将经过富集、驯化后，以目标污染物为唯一碳源或氮源等能源的高效降解菌株投入废水中去，使微生物在水体中能直接对目标污染物进行降解作用，达到去除污染物的目的。而微生物共代谢作用是指某些微生物只有伴随初级能源物质存在时才能与其共同对污染物进行降解的过程。
技术实现要素：
4.为了解决上述技术问题，本发明提供了一株高效降解二甲基乙酰胺的赤红球菌hjm-8及其在降解二甲基乙酰胺中的应用。
5.本发明的具体技术方案为：
6.第一方面，本发明提供了一株高效降解二甲基乙酰胺的赤红球菌，微生物分类命名为赤红球菌(rhodococcus ruber)hjm-8，已在2021年6月1日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为：中国武汉武汉大学，邮政编码为430072；保藏编号为cctcc no:m2021654；所述hjm-8的16s rrna序列如seq id no.1所示。
7.本发明的赤红球菌hjm-8来源于浙江某医药废水处理厂好氧池的污泥中，该赤红球菌经过分离及纯化获得，可利用二甲基乙酰胺作为其生长的唯一碳源。
8.所述赤红球菌hjm-8的特征为：菌落颜色为白色，菌落呈小型单个菌落，无芽孢，不
透明，表面光滑，边缘整齐，扫描电镜下观察该菌体的形态为杆菌。
9.第二方面，本发明提供了一株以高效降解二甲基乙酰胺的赤红球菌hjm-8为活性成分的含菌悬液及含菌悬液的制备方法。
10.所述含菌悬液的制备方法包括以下具体步骤：
11.(1)斜面培养：将高效降解二甲基乙酰胺的赤红球菌hjm-8接种至斜面培养基上，在30-38℃下培养1-3天，获得斜面菌体；所述斜面培养基终浓度组成为：k2hpo
4 1500mg
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，kh2po
4 500mg
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，nacl 1000mg
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，dmac 500mg
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，溶剂为水，ph值7.0-8.0，琼脂18-20g
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；
12.(2)种子培养：从斜面菌体挑取菌落接种至种子培养基，在30-38℃下培养18-24h，获得种子液；所述种子培养基终浓度组成为：nacl 10g
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，酵母浸粉5g
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，蛋白胨10g
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，溶剂为水，ph值7.0-8.0；
13.(3)发酵：将种子液以体积浓度1％的接种量接种至发酵培养基，在30-38℃下培养1-3天，获得发酵培养液即为含菌悬液；所述发酵培养基终浓度组成为：k2hpo
4 1500mg
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，kh2po
4 500mg
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，nacl 1000mg
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，dmac 500mg
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溶剂为水，ph值7.0-8.0。
14.第三方面，本发明提供了一种以高效降解二甲基乙酰胺的赤红球菌hjm-8为活性成分的含菌悬液在降解二甲基乙酰胺中的应用及其具体方法。
15.具体方法为：将所述含菌悬液接种至含有终浓度为500mg
·
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的二甲基乙酰胺的液体选择培养基中，以二甲基乙酰胺为唯一碳源，在30-40℃、160-300rpm恒温摇床上振荡培养，获得培养液；所述液体选择培养基的终浓度组成为：k2hpo
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，nacl 1000mg
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，dmac 500mg
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，溶剂为水，ph值8.0-9.0。
16.本发明的有益效果为：本发明提供了一株高效降解二甲基乙酰胺的赤红球菌hjm-8及去除废水中二甲基乙酰胺的应用，该菌株在24h内能对初始浓度为500mg
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的dmac降解率达到100％，该降解菌的发现对dmac生物降解的进一步研究具有重要意义。
附图说明
17.图1为菌株hjm-8的样品图和扫描电镜图，其中图1(a)为菌株hjm-8的样品图，图1(b)为菌株hjm-8的扫描电镜图；
18.图2为菌株hjm-8的系统发育树图；
19.图3为菌株hjm-8与对照组对dmac去除性能的比较；
20.图4不同dmac初始浓度下测试结果图，其中图4(a)为不同dmac初始浓度下二甲基乙酰胺(dmac)浓度变化图，图4(b)为不同dmac初始浓度下菌密度(od
600
)变化图；
21.图5不同温度下二甲基乙酰胺(dmac)浓度变化和菌密度(od
600
)变化图；
22.图6不同ph下二甲基乙酰胺(dmac)浓度变化和菌密度(od
600
)变化图；
23.图7不同接种量下二甲基乙酰胺(dmac)浓度变化和菌密度(od
600
)变化图。
具体实施方式
24.本发明提供一株高效降解二甲基乙酰胺的赤红球菌，微生物分类命名为赤红球菌
(rhodococcus ruber)hjm-8，已在2021年6月1日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为cctcc no:m 2021654；所述hjm-8的16s rrna序列如seq id no.1所示。
25.本发明提供了一种以高效降解二甲基乙酰胺的赤红球菌hjm-8为活性成分的含菌悬液，所述含菌悬液以高效降解二甲基乙酰胺的赤红球菌hjm-8经斜面培养、种子培养、发酵后制成。
26.所述含菌悬液的制备方法包括以下具体步骤：
27.(1)斜面培养：将高效降解二甲基乙酰胺的赤红球菌hjm-8接种至斜面培养基上，在30-38℃下培养1-3天，获得斜面菌体；所述斜面培养基终浓度组成为：k2hpo
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，kh2po
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，nacl 1000mg
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，dmac 500mg
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，溶剂为水，ph值7.0-8.0，琼脂18-20g
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；
28.(2)种子培养：从斜面菌体挑取菌落接种至种子培养基，在30-38℃下培养18-24h，获得种子液；所述种子培养基终浓度组成为：nacl 10g
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，酵母浸粉5g
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，蛋白胨10g
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，溶剂为水，ph值7.0-8.0；
29.(3)发酵：将种子液以体积浓度1％的接种量接种至发酵培养基，在30-38℃下培养1-3天，获得发酵培养液即为含菌悬液；所述发酵培养基终浓度组成为：k2hpo
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，kh2po
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，nacl 1000mg
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，dmac 500mg
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，溶剂为水，ph值7.0-8.0。
30.本发明提供了一种以高效降解二甲基乙酰胺的赤红球菌hjm-8为活性成分的含菌悬液在降解二甲基乙酰胺中的应用。
31.下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。
32.本发明所用的液体选择培养基的终浓度组成为：k2hpo
4 1500mg
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，kh2po
4 500mg
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，nacl 1000mg
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，dmac 500mg
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，溶剂为水。
33.实施例1：赤红球菌(rhodococcus ruber)hjm-8的分离、纯化及鉴定
34.1.赤红球菌(rhodococcus ruber)hjm-8的分离及纯化
35.赤红球菌(rhodococcus ruber)hjm-8是从浙江台州某医药废水处理厂好氧池污泥中筛得，具体步骤如下：
36.(1)采样：从浙江某医药废水处理厂好氧池的污泥中分别多点采样，作为筛选高效降解二甲基乙酰胺的赤红球菌(rhodococcus ruber)hjm-8的原材料；
37.(2)菌株分离：取适量好氧池中活性污泥，静置2h后，取10ml上清液接种至含100ml富集培养液的250ml培养瓶中，在30℃、160rpm恒温摇床上振荡培养24h，重复3次，所述富集培养液的终浓度组分为：胰蛋白胨2.5g
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，酵母膏1.25g
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，琼脂粉500mg
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，k2hpo
4 500mg
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，kh2po
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，nacl 1000mg
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；用无菌水将上述菌液稀释10-2
、10-3
、10-4
、10-5
、10-6
、10-7
倍；将所得到的菌液用液体选择培养基经多次平板划线分离纯化，得到单菌落，记为菌株hjm-8。
38.2.菌株hjm-8的鉴定
39.a、菌株hjm-8的生理生化特征
40.对所获得的菌株hjm-8进行形态观察和生理生化鉴定，结果表明该菌株hjm-8可在普通细菌lb培养基及终浓度为500mg
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的二甲基乙酰胺的液体选择培养基上生长，菌落
颜色为白色，菌落呈小型单个菌落，无芽孢，不透明，表面光滑，边缘整齐，菌株hjm-8如图1(a)所示，扫描电镜下观察该菌体的形态为杆菌如图1(b)所示，生长最适ph值为8.0，最适温度为35℃。
41.b、菌株hjm-8的16s rrna序列分析
42.通过16s rrna序列分析和生理生化实验鉴定，确定菌株hjm-8为rhodococcus ruber。
43.测序结果为：
44.cgatgaagccagcttgctgggtggattagtggcgaacgggtgagtaacacgtgggtgatctgccctgcacttcgggataagcctgggaaactgggtctaataccggataggacctcgggatgcatgttccggggtggaaaggttttccggtgcaggatgggcccgcggcctatcagcttgttggtggggtaacggcccaccaaggcgacgacgggtagccggcctgagagggcgaccggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattgcacaatgggcgcaagcctgatgcagcgacgccgcgtgagggatgacggccttcgggttgtaaacctctttcagtaccgacgaagcgcaagtgacggtaggtacagaagaagcaccggccaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtagggtgcgagcgttgtccggaattactgggcgtaaagagctcgtaggcggtttgtcgcgtcgtctgtgaaaacccgcagctcaactgcgggcttgcaggcgatacgggcagacttgagtactgcaggggagactggaattcctggtgtagcggtgaaatgcgcagatatcaggaggaacaccggtggcgaaggcgggtctctgggcagtaactgacgctgaggagcgaaagcgtgggtagcgaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacggtgggcgctaggtgtgggtttccttccacgggatccgtgccgtagctaacgcattaagcgccccgcctggggagtacggccgcaaggctaaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggcggagcatgtggattaattcgatgcaacgcgaagaaccttacctgggtttgacatacaccggaccgccccagagatggggtttcccttgtggtcggtgtacaggtggtgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgtcctgtgttgccagcacgtaatggtggggactcgcaggagactgccggggtcaactcggaggaaggtggggacgacgtcaagtcatcatgccccttatgtccagggcttcacacatgctacaatggccggtacagagggctgcgataccgcgaggtggagcgaatcccttaaagccggtctcagttcggatcggggtctgcaactcgaccccgtgaagtcggagtcgctagtaatcgcagatcagcaacgctgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacgtcatgaaagtcgg。
45.将hjm-8的16s rdna序列上传到genbank，获得genbank的登录号mz144119，与genbank中的基因序列进行同源性比较，图2为该菌株的系统发育树图。为了进一步确定鉴定结果的可靠性，经过生理生化实验，最终确定菌株hjm-8属于rhodococcus ruber，因此，将该菌株命名为赤红球菌(rhodococcus ruber)hjm-8。
46.实施例2以高效降解二甲基乙酰胺的赤红球菌hjm-8为活性成分的含菌悬液的制备过程
47.所述含菌悬液的制备过程：
48.(1)斜面培养：将高效降解二甲基乙酰胺的赤红球菌hjm-8接种至斜面培养基上，在30℃下培养3天，获得斜面菌体；所述斜面培养基终浓度组成为：k2hpo
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，kh2po4500mg
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，nacl 1000mg
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，dmac 500mg
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，溶剂为水，ph值7.0，琼脂18g
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；
49.(2)种子培养：从斜面菌体挑取菌落接种至种子培养基，在30℃下培养18h，获得种子液；所述种子培养基终浓度组成为：nacl 10g
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，酵母浸粉5g
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，蛋白胨10g
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，溶剂为水，ph值7.0；
50.(3)发酵：将种子液以体积浓度1％的接种量接种至发酵培养基，在30℃下培养24h，获得发酵培养液即为含菌悬液；所述发酵培养基终浓度组成为：k2hpo
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，kh2po4500mg
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，nacl 1000mg
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，dmac 500mg
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溶剂为水，ph值7.0。
51.实施例3：赤红球菌(rhodococcus ruber)hjm-8对二甲基乙酰胺降解性能的检测和降解条件筛选
52.1.赤红球菌(rhodococcus ruber)hjm-8对二甲基乙酰胺(dmac)降解性能的检测
53.将实施例2所制备的以高效降解二甲基乙酰胺的赤红球菌hjm-8为活性成分的含菌悬液接种至含有终浓度为500mg
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的二甲基乙酰胺的液体选择培养基中，以二甲基乙酰胺为唯一碳源，使培养基的初始ph值为8.0，取100ml置于250ml三角瓶中，在35℃、160rpm恒温摇床上振荡培养，获得培养液(作为实验组)；
54.同时以装有100ml含有终浓度为500mg
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的二甲基乙酰胺的液体选择培养基的250ml三角瓶，使培养基的初始ph值为8.0，在35℃、160rpm恒温摇床上振荡培养作为空白对照组。
55.培养过程中，间隔8小时分别提取实验组和空白对照组的培养液，测得二甲基乙酰胺的浓度并绘制dmac降解率图，如图3所示。检测方法如下：
56.二甲基乙酰胺浓度的检测采用高效液相色谱法(hplc)：样本处理，间隔8小时取1ml培养液，将培养液在10000rpm离心5min去除微生物获得上清液，然后进行hplc定量分析测得二甲基乙酰胺浓度。
57.从图3中可以看出赤红球菌(rhodococcus ruber)hjm-8对二甲基乙酰胺(dmac)有较好的降解效果，在24h对初始浓度为500mg
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的二甲基乙酰胺的降解率达到100％。
58.2.二甲基乙酰胺(dmac)初始浓度对赤红球菌(rhodococcus ruber)hjm-8降解二甲基乙酰胺的影响检测
59.将实施例2制备得到的以高效降解二甲基乙酰胺的赤红球菌hjm-8为活性成分的含菌悬液分别接种至含不同二甲基乙酰胺终浓度终浓度(1g
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、5g
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、10g
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、15g
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、20g
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)的液体选择培养基中，以二甲基乙酰胺为唯一碳源，使培养基的初始ph值为8.0，分别取100ml，分别置于5个250ml三角瓶中，在35℃、160rpm恒温摇床上振荡培养，间隔24h测得二甲基乙酰胺的浓度和菌密度(od
600
)，测得结果如图4所示。菌密度(od
600
)的检测方法如下：以岛津uv2401型紫外-可见光分光光度计，在波长600nm处测定反应液的吸光度。
60.图4(a)为不同dmac初始浓度下二甲基乙酰胺(dmac)浓度变化图，图4(b)为不同dmac初始浓度下菌密度(od
600
)变化图。
61.结果如图4所示，赤红球菌(rhodococcus ruber)hjm-8对二甲基乙酰胺(dmac)有较好的降解效果，dmac去除效率随着dmac初始浓度的增加而降低，同时每组的菌密度(od
600
)随着增加，对初始浓度为1g
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在72h时降解率到达100％，对初始浓度为5g
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在72h时降解率到达100％。
62.综合上述，赤红球菌(rhodococcus ruber)hjm-8对二甲基乙酰胺(dmac)有较好的降解效果，对高浓度二甲基乙酰胺废水有很强的降解能力，基本可以在很短的时间内将二甲基乙酰胺降到可以排放的标准。
63.3.赤红球菌(rhodococcus ruber)hjm-8对二甲基乙酰胺(dmac)降解的最佳温度
条件筛选
64.将实施例2制备得到的以高效降解二甲基乙酰胺的赤红球菌hjm-8为活性成分的含菌悬液分别接种至含二甲基乙酰胺终浓度为500mg
·
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的液体选择培养基中，使培养基的初始ph值为8.0，分别取100ml置于5个250ml三角瓶中，分别置于25℃、30℃、35℃、40℃或45℃，160rpm恒温摇床上振荡培养；振荡培养24h后测得二甲基乙酰胺的浓度和菌密度(od
600
)，测得结果如图5所示。
65.结果如图5所示：菌株hjm-8对30℃和35℃有很好的耐受性；以35℃为最佳，菌株hjm-8的dmac降解率在24h到达55％；在该实验条件下菌株hjm-8的最适生长繁殖温度为30-35℃，在该温度范围内菌株能更好地发挥降解性能。
66.4.赤红球菌(rhodococcus ruber)hjm-8对二甲基乙酰胺(dmac)降解的最佳ph值条件筛选
67.将实施例2制备得到的以具有二甲基乙酰胺降解能力的赤红球菌hjm-8为活性成分的含菌悬液分别接种至含二甲基乙酰胺终浓度为500mg
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的液体选择培养基中，分别取100ml置于5个250ml三角瓶中，分别调节培养基ph值为5.0、6.0、7.0、8.0或9.0，在30℃、160rpm恒温摇床上振荡培养；振荡培养24h后测得二甲基乙酰胺的浓度和菌密度(od
600
)，测得结果如图6所示；
68.结果如图6所示：菌株hjm-8对ph值为8.0和9.0有很好的耐受性；以ph值8.0为最佳，菌株hjm-8的dmac降解率在24h到达55％；在该实验条件下菌株hjm-8的最适生长繁殖ph值为8.0-9.0，在该ph值范围内菌株能更好地发挥降解性能。
69.5.赤红球菌(rhodococcus ruber)hjm-8对二甲基乙酰胺(dmac)降解的最佳接种量的筛选
70.将实施例2步骤(3)中种子液以体积浓度分别为1％、2％、3％、4％、5％的接种量接种至发酵培养基，实施例2的其他步骤不变，制备接种量为1％、2％、3％、4％、5％的以具有二甲基乙酰胺降解能力的赤红球菌hjm-8为活性成分的含菌悬液。
71.分别将接种量为1％、2％、3％、4％、5％的以具有二甲基乙酰胺降解能力的赤红球菌hjm-8为活性成分的含菌悬液接种至二甲基乙酰胺终浓度为500mg
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的液体选择培养基中，分别取100ml置于5个250ml三角瓶中，在30℃、160rpm恒温摇床上振荡培养；振荡培养24h后测得二甲基乙酰胺的浓度和菌密度(od
600
)，测得结果如图7所示；
72.结果如图7所示：随着接种量的增加，24h测得的dmac降解率随着增加；接种量为5％时，菌株hjm-8的dmac降解率在24h到达68％。