一种猪
δ
冠状病毒检测引物组和探针、试剂盒及应用
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种猪δ冠状病毒检测引物组和探针、试剂盒及应用。


背景技术：

2.猪δ冠状病毒(porcine deltacoronavirus，pdcov)是一种新型的猪肠道病毒，可引起新生仔猪急性腹泻、呕吐、脱水甚至死亡。2014年2月，美国猪场出现了pdcov病毒，并在美国迅速传播。此后不久，在韩国猪群中发现了pdcov，后来在中国和泰国也相继发现。目前，该病在世界范围的流行呈上升趋势，对生猪养殖造成了巨大的经济损失。pdcov的临床症状不容易与tgev和pedv区分，因此需要依靠精确的诊断技术对其进行检测和鉴别。
3.目前，针对pdcov的检测方法主要有病原学检测和血清抗体检测两种，其中病原学检测技术主要包括常规rt-pcr、巢式-pcr、real-time pcr 和免疫组化分析等；血清抗体检测技术主要是间接免疫elisa等。血清抗体检测技术诊断结果准确度相对较高，但是其敏感性和特异性不能满足检测病毒的需求，基于pcr的技术在实际操作中会存在消耗的时间长、工作量大、易污染等缺点。因此，发明一种快速、特异性强、敏感性高的pdcov 检测方法具有重要的应用前景。
4.环介导等温扩增法(loop-mediated isothermal amplification，lamp)，是一种新型的核酸扩增方法，其特点是针对靶基因的多个区域设计多种特异引物，在链置换dna聚合酶(bst2.0dna聚合酶)的作用下，60～65℃恒温扩增，15-60分钟左右即可实现109～10
10
倍的核酸扩增，具有操作简单、特异性强、产物易检测等特点。lamp引物组一般由内引物fip(f1c+f2)和bip(b1c+b2)，外引物f3和b3以及环引物loopf/loopb 组成。环引物是设计在f1c和f2之间或者b1c和b2之间的引物，其主要是在lamp正常延伸反应启动的前提下，起到大大提高等温扩增效率的作用。然而，目前常见的lamp技术无法实现对pdcov的实时荧光定量探针法检测。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种猪δ冠状病毒检测lamp引物组和探针、试剂盒及应用，以解决上述现有技术存在的问题，利用实时荧光定量lamp 检测引物组和探针，实现了对猪δ冠状病毒高特异性、高敏感性的快速定量检测。
6.为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
7.本发明提供检测引物组和探针，包含核苷酸序列分别如seq id no： 1-5所示的fip、bip、f3、b3和loopf组成的引物组以及如seq id no： 6所示的探针probe。
8.优选的是，所述探针的5’端和3’端分别携带荧光基团fam和淬灭基团bhq1。
9.本发明还提供一种检测猪δ冠状病毒的扩增试剂盒，包含所述的检测引物组和探针。
10.本发明还提供所述的检测引物组和探针在制备检测猪δ冠状病毒产品中的应用。
11.优选的是，所述产品包括试剂盒或试剂。
12.优选的是，检测猪δ冠状病毒包括如下步骤：
13.(1)获取待测样品的rna；
14.(2)以所述rna为模板，利用权利要求1或2所述检测引物组和探针或者权利要求3所述试剂盒扩增所述生物样品，以测定是否含有猪δ冠状病毒。
15.优选的是，扩增体系包括：isothermal amplification buffer(10
×
)2.5μl、 bst 2.0dna polymerase 1μl、rt反转录酶0.5μl、 rnase h2酶0.3μl、dntps 5μl、mgso
4 1.5μl、fip+bip引物4μl、f3+b3 引物0.5μl、loopf 1.5μl、探针0.3μl、rna模板2μl、ddh2o 5.9μl。
16.优选的是，扩增条件为：64℃恒温反应30-60min。
17.本发明公开了以下技术效果：
18.(1)本发明利用bst 2.0dna聚合酶和rt 反转录酶在64℃实现等温扩增。
19.(2)本发明设计的荧光基团修饰的环引物探针，在相应位点设计可与靶基因位点相结合的rna碱基，当两者特异互补结合时，激活rnase h2 酶发生切割，报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，产生荧光信号；当不发生特异结合时不产生荧光信号，不仅可通过荧光定量扩增仪器进行实时观察，而且使得该方法具有非常好的特异性。
20.(3)本发明所提供的试剂盒，反应迅速，可以在40min内完成反应，最快可以在20min内完成。
21.(4)本发明提供的试剂盒特异性好，对传染性胃肠炎病毒(tgev)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(prrsv)、猪瘟病毒(csfv)、猪急性腹泻综合征冠状病毒(sads-cov)和猪轮状病毒(porv)都呈阴性反应；敏度性高，最低可以检测到10copies/μl的pdcov的rna模板，比普通rt-pcr方法敏感性高10～100倍，跟taqman探针法qpcr相当。
22.(5)本发明所提供的实时定量检测pdcov的探针法荧光定量lamp 试剂盒可快速、敏感的检测pdcov。该试剂盒操作简单、反应快速，反应结果易于观察，特异性好，可实现对pdcov的实时定量检测，非常适用于出口检疫、食品卫生以及畜牧养殖场的现场检测，易于大范围推广应用。
附图说明
23.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
24.图1为mg
2+
优化结果图，其中：设置不同终浓度的mgso4，a：8mm； b：6mm；c：4mm；d：2mm；
25.图2为dntp优化结果图，其中：设置不同终浓度的dntps，a：2.4mm； b：2.0mm；c：1.6mm；d：1.4mm；e：1.2mm；f：negative control；
26.图3为rnase h2酶用量的优化结果图，其中：设置不同终浓度的rnase
ꢀꢀ
h2酶，a：4.0u/ml；b：3.2u/ml；c：2.4u/ml；d：1.6u/ml；e：0.8u/ml；
27.图4为温度优化结果图，其中：设置不同的反应温度，a：60℃；b： 61℃；c：62℃；d：63℃；e：64℃；f：65℃；
28.图5为探针优化结果图，其中：不同终浓度的探针probe，a：0.16μm；b：0.12μm；c：0.08μm；d：0.04μm；e：negative control；
29.图6为特异性结果图，其中，a：pdcov；b：为猪流行性腹泻病毒 (pedv)；c：传染性胃肠炎病毒(tgev)；d：猪繁殖与呼吸综合征病毒 (prrsv)；e：猪瘟病毒(csfv)；猪急性腹泻综合征冠状病毒(sads-cov) 和猪轮状病毒(prov)；g：阴性对照。
30.图7为敏感性结果图，其中：10倍倍比稀释pdcov的标准品rna，按以下拷贝数进行检测，a：1
×
106copies/μl；b；1
×
105copies/μl；c： 1
×
104copies/μl；d：1
×
103copies/μl；e：1
×
102copies/μl；f：1
×
101copies/μl；
31.图8为本发明引物在pdcov的n基因保守区域上的位置。
具体实施方式
32.现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
33.应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
34.除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
35.在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本技术说明书和实施例仅是示例性的。
36.关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
37.①
引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成；bst 2.0 dna polymerase、rt反转录酶购自new england 公司；rnase h2酶购自idt公司；荧光定量pcr仪(roche公司，货号：96sw 1.1)为本实验室保存。
38.②
猪δ冠状病毒(porcine deltacoronavirus，pdcov)、传染性胃肠炎病毒(tgev)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(prrsv)、猪瘟病毒(csfv)、猪急性腹泻综合征冠状病毒(sads-cov)和猪轮状病毒(porv)保存于广东省农业科学院动物卫生研究所。
39.实施例1
40.一、引物设计
41.根据引物设计原则，针对pdcov的n基因保守区域的序列，应用 primerexplorer v5软件进行引物设计，按照我们的经验保证引物的gc含量在40％～60％之间，各引物tm值在55℃左右。通过初步筛选，我们得到了一套理论值较优的引物。引物和探针由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，合成后的引物用灭菌三蒸水稀释成浓度为10μm，-20℃保存。包括一对内部引物(fip和bip)、1对外部引物(f3和b3)、一条环引物 loop f和一条探针probe引物，见表1。引物位置如图8所示，其中fip 由f1c和f2组成，bip由b1c和b2组成，其中f1c为f1的反向互补序列，b1c、b2c、b3c为b1、b2、b3的反向互补序列。
42.表1引物名称和序列
[0043][0044]
二、病毒基因组rna的提取
[0045]
采用axygen公司的小量rna提取试剂盒，按照试剂盒说明书提取各实验组病毒样本的总rna模板，用于后续实验。
[0046]
三、lamp检测方法的建立
[0047]
1.反应体系的优化
[0048]
依次对mgso4、探针、dntps、rnase h2酶浓度比例进行优化，对得到的结果在荧光定量pcr仪上进行分析。
[0049]
通过设置不同终浓度的mgso4：2mm、4mm、6mm、8mm，同时以水替代核酸模板设置空白对照(见图1)；不同终浓度的dntps：1.2mm， 1.4mm，1.6mm，2mm，2.4mm，同时以水替代核酸模板设置空白对照(见图2)；不同终浓度rnase h2酶：(a)0.8u/ml,(b)1.6um/l,(c)2.4u/ml,(d) 3.2u/ml,(e)4.0u/ml，同时以水替代核酸模板设置空白对照(见图3)。检测条件为64℃恒温60min。结果如图1-图3所示，根据所得的实验结果，最终确定优化的检测体系，如表2所示。
[0050]
表2扩增反应体系
ctacgctgctgattcctgctttatc)，进行pcr扩增，然后将含有rna 聚合酶启动子的pcr产物进行纯化，进而作为体外转录的模板，使用试剂盒，按照操作说明进行转录。转录后，用氯化锂沉淀法去除未结合核苷酸和大部分蛋白质，纯化回收rna，紫外分光光度计测定rna模板浓度为18.1ng/μl，然后对转录的rna模板用灭菌纯水进行10倍梯度稀释，将稀释后的样品各取2μl样品液进行lamp 扩增检测(见表2所示体系和引物)、普通rt-pcr检测(如表3)和taqman 探针法荧光定量pcr检测(如表4)。
[0066]
表3普通rt-pcr反应体系
[0067][0068]
普通rt-pcr程序如下：50℃30min反转录；94℃预变性3min；94℃ 30s，58℃30s，72℃1min为一个循环，运行35个循环；最后72℃延伸 5min；4℃保存。(普通rt-pcr所用试剂盒为诺唯赞hiscript ii one steprt-pcr kit(货号：p611-011))。
[0069]
taqman探针法荧光定量real-time pcr引物为：
[0070]
pdcov-m-f：5
′‑
cgaccacatggctccaattc-3
′
；
[0071]
pdcov-m-r：5
′‑
cagctcttgcccatgtagctt-3
′
；
[0072]
探针pdcov-probe：
[0073]5′‑
fam-cacaccagtcgttaagcatggcaagc-tamra-3
′
；
[0074]
以为pdcov-m-f和pdcov-m-r为引物进行real-time pcr，反应体系如表4所示：
[0075]
表4 taqman探针法荧光定量real-time pcr的反应体系
[0076][0077]
taqman探针法荧光定量real-time pcr的反应程序如下：45℃10min 反转录；95℃
预变性10min；95℃15s，60℃45s，72℃20s为一个循环，运行40个循环，最后37℃延伸30s；4℃保存。(taqman探针法所用试剂盒为诺唯赞hiscript ii one step qrt-pcr probe kit(货号：q222-01))。
[0078]
分别比较上述探针法实时荧光定量lamp检测法、普通rt-pcr和 taqman探针法荧光定量real-time pcr检测方法的敏感性。结果显示，探针法实时荧光定量lamp检测法的敏感性是普通rt-pcr方法的10-100 倍；探针法实时荧光定量lamp检测方法的敏感性与taqman探针法荧光定量real-time pcr检测方法相比，两者敏感性一致，最低可以检测到 10copies/μl。总之，本发明提供的探针法实时荧光定量lamp检测法与 taqman探针法荧光定量real-time pcr检测方法具有相等的敏感性，但与 taqman探针法荧光定量real-time pcr检测方法相比，探针法实时荧光定量lamp检测法具有操作更加简单(64℃等温即可反应)，反应时间更短 (只需40min)。此外，探针法实时荧光定量lamp检测法中的探针在相应位点设计可与靶基因dna相结合的rna碱基，在反应中二者形成特异互补结合时，rnase h2酶被激活并发生切割，报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，产生荧光信号，大大降低了非特异性反应的发生。
[0079]
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。