用于牛膝及川牛膝药材、标准汤剂及中药配方颗粒多重pcr鉴别的引物及其应用
技术领域
1.本发明涉及中药鉴别技术领域，尤其涉及一种用于牛膝及川牛膝药材、标准汤剂及中药配方颗粒多重pcr鉴别的引物及其应用。


背景技术：

2.牛膝为苋科植物牛膝achyranthes videntata bi.的干燥根，有逐瘀通经、补肝肾、强筋骨、利尿通淋、引血下行功效，用经闭、痛经、腰膝酸痛、筋骨无力、淋证、水肿、头痛、眩晕、牙痛、口疮、吐血、衄血。川牛膝为苋科植物川牛膝cyathula officinalis kuan的干燥根，有逐瘀通经、通利关节、利尿通淋功效，用于经闭癥瘕、胞衣不下、跌打损伤、风湿痹痛、足痿筋挛、尿血血淋。牛膝与川牛膝外形相似，但功效差异较大，川牛膝无滋补肝肾功效。牛膝和川牛膝配方颗粒是经水加热提取后制得，采用传统鉴别方法对二者在失去药材性状后，难以进行有效的质量控制，质量控制的风险较大，亟需解决提取物在失去饮片外形特征后的真伪优劣评价问题。


技术实现要素：

3.本发明所要解决的技术问题在于，提供一种用于牛膝及川牛膝药材、标准汤剂及中药配方颗粒多重pcr鉴别的引物，其可有效鉴别牛膝及川牛膝。
4.本发明还要解决的技术问题在于，提供一种上述引物的应用。
5.本发明还要解决的技术问题在于，提供一种基于上述引物的鉴别方法。
6.为了解决上述技术问题，本发明提供了一种用于牛膝及川牛膝药材、标准汤剂及中药配方颗粒多重pcr鉴别的引物，其包括第一引物对和第二引物对；
7.其中，所述第一引物对的上游引物的序列如seq id no：1所示，其下游引物的序列如seq id no：2所示；
8.所述第二引物对的上游引物的序列如seq id no：3所示，其下游引物的序列如seq id no：4所示。
9.相应的，本发明还公开了一种上述引物在(1)或(2)中的应用：
10.(1)鉴别待测样品是否为牛膝和/或川牛膝；
11.(2)制备用于鉴别牛膝和/或川牛膝的试剂盒。
12.作为上述技术方案的改进，所述牛膝为药材、标准汤剂或中药配方颗粒，所述川牛膝为药材、标准汤剂或中药配方颗粒。
13.相应的，本发明还公开了一种上述引物在(1)或(2)中的应用：
14.(1)鉴别待测样品是否含有牛膝和/或川牛膝；
15.(2)制备用于鉴别待检测样品是否含有牛膝和/或川牛膝的试剂盒。
16.相应的，本发明还公开了一种试剂盒，其包括如上述的引物。
17.作为上述技术方案的改进，还包括pcr预混液。。
18.相应的，本发明还公开了一种基于上述的用于牛膝及川牛膝药材、标准汤剂及中药配方颗粒多重pcr鉴别的引物的鉴别方法，其包括：
19.提取待检测样品的基因组dna；
20.以所述基因组dna为模板，采用上述的引物进行pcr扩增，若扩增产物中含有160-170bp的dna条带，则待检测样品含有川牛膝药材、川牛膝标准汤剂和/或川牛膝中药配方颗粒；
21.若扩增产物中含有180-190bp的dna条带，则待检测样品含有牛膝药材、牛膝标准汤剂和/或牛膝中药配方颗粒。
22.作为上述技术方案的改进，提取待检测样品的基因组dna的方法如下：
23.取待检测样品，加入ctab沉淀液、蛋白酶k沉淀提取2～3次；取沉淀物加入ctab提取液、β-巯基乙醇提取，然后加入氯仿-异戊醇萃取2～3次；取萃取后上清液，加入异丙醇或异丙醇-乙酸钠沉淀提取，沉淀物经洗涤、孵育后用水溶解，即得待检测样品的基因组dna。
24.作为上述技术方案的改进，提取待检测样品的基因组dna的方法如下：
25.取待检测样品0.03～0.08g，研磨成粉末，置离心管中，加入1～1.8ml的ctab沉淀液、15～25μl蛋白酶k，混合均匀，在50～60℃下加热45～65min，冷却至室温后离心，弃去上清液；加入800～1000μl ctab沉淀液、15～25μl蛋白酶k，混合均匀，在50～60℃下加热45～65min，冷却至室温后离心，弃去上清液；取沉淀加入800～1000μl ctab提取液，5～15μlβ-巯基乙醇，混合均匀，在60～70℃加热100～150min，冷却至室温后取上清液，加入等体积的氯仿-异戊醇混合液，震荡混匀后离心，取上清液700～800μl，再加入等体积的氯仿-异戊醇混合液，震荡混匀后离心，取上清液400～500μl，加入等体积的异丙醇或异丙醇-乙酸钠混合液，于-30～-20℃静置30～60min，离心后弃去上清液，再用乙醇洗涤沉淀2～4次，弃去上清液，沉淀于35～38℃孵育20～40min，待乙醇挥发后，加入30～50μl灭菌水溶解，即得到待检测样品的基因组dna。
26.作为上述技术方案的改进，所述ctab沉淀液包括ctab、tris-hcl、edta和水；其中，ctab的浓度为1～3％(w/v)，tris-hcl的浓度为80～120mmol/l，edta的浓度为10～30mmol/l；
27.所述ctab提取液包括ctab、tris-hcl、edta、nacl、pvp40和水；其中，ctab的浓度为1～3％(w/v)，tris-hcl的浓度为80～120mmol/l，edta的浓度为10～30mmol/l；nacl的浓度为1～3mol/l，pvp40的浓度为10～30％(w/v)。
28.作为上述技术方案的改进，将模板、引物、pcr预混液、水混合均匀，得到pcr扩增体系；
29.将所述pcr扩增体系按照预设扩增程序进行扩增，得到扩增产物；
30.将所述扩增产物进行电泳分析，记录其电泳图谱，若图谱中含有164bp的dna条带，则待检测样品含有川牛膝药材、川牛膝标准汤剂和/或川牛膝中药配方颗粒；
31.若图谱中含有187bp的dna条带，则待检测样品含有牛膝药材、牛膝标准汤剂和/或牛膝中药配方颗粒。
32.作为上述技术方案的改进，所述pcr扩增体系由下述物质组成：
33.pcr预混液12.5μl；第一引物对上游引物、下游引物各0.3μl，第二引物对的上游引物、下游引物各0.3μl，模板1μl，ddh2o 10.3μl。
34.作为上述技术方案的改进，所述pcr扩增程序为：
35.将所述扩增体系在92～95℃预变性4～6min，然后在预设程序下循环35～45次，最后在71～75℃延伸4～6min；
36.其中，所述预设程序为：将扩增体系在94～96℃变性28～32s，然后在60～62℃退火26～32s，再在70～73℃延伸28～35s。
37.作为上述技术方案的改进，所述pcr扩增程序为：
38.将所述扩增体系在95℃预变性5min，然后在预设程序下循环40次，最后在72℃延伸5min；
39.其中，所述预设程序为：将扩增体系在95℃变性30s，然后在61℃退火30s，再在72℃延伸30s。
40.作为上述技术方案的改进，所述电泳分析方法为：将所述扩增产物稀释后点样于1.5～2％的琼脂糖凝胶上，于145～160v电压条件下电泳45～60min，经gelred显色，得到电泳图谱。
41.实施本发明，具有如下有益效果：
42.1，本发明的引物，可进行多重位点特异性pcr反应，有效鉴别牛膝及川牛膝，其效率高，检测精度高。
43.2，本发明中的引物、鉴别方法，可有效克服dna提取过程中辅料干扰的问题，且可解决标准汤剂、中药配方颗粒在失去形态后难以鉴别的难题。
附图说明
44.图1是实施例3中牛膝及川牛膝样品多重pcr扩增后电泳检测结果图；其中，m为dna分子量标准，1-10为牛膝药材，11-20为川牛膝药材，n为为空白对照(ddh2o)；
45.图2是实施例3中牛膝及川牛膝样品多重pcr扩增后电泳检测结果图；其中，m为dna分子量标准，21-30为牛膝标准汤剂(冻干粉)，31-40为川牛膝标准汤剂(冻干粉)，n为空白对照(ddh2o)；
46.图3是实施例3中牛膝及川牛膝样品多重pcr扩增后电泳检测结果图；其中，m为dna分子量标准，41-50为牛膝配方颗粒，51-60为川牛膝配方颗粒，n为空白对照(ddh2o)。
具体实施方式
47.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图及具体实施方式对本发明作进一步地详细描述。
48.本发明提供一种用于牛膝及川牛膝药材、标准汤剂、中药配方颗粒多重pcr鉴别的引物，其包括第一引物对和第二引物对，其具体序列如下表所示：
[0049][0050]
[0051]
上述引物可在同一pcr反应体系中进行多重pcr反应，其相互之间无干扰，易于扩增。
[0052]
基于上述特性，本发明中的引物可实现以下应用：
[0053]
(1)鉴别待检测样品是否为牛膝的药材、标准汤剂、中药配方颗粒；或川牛膝的药材、标准汤剂、中药配方颗粒。
[0054]
(2)鉴别待检测样品是否含有牛膝和/或川牛膝。
[0055]
(3)制备用于鉴别牛膝和/或川牛膝的试剂盒。
[0056]
(4)制备用于鉴别待检测样品是否含有牛膝和/或川牛膝的试剂盒。
[0057]
相应的，本发明公开了一种试剂盒，其包括上述引物，还包括pcr预混液和水。其中，pcr预混液可选用2
×
pfu pcr mix(天根生化科技(北京)有限公司，kp201)，但不限于此。
[0058]
本发明还公开了一种基于引物的鉴别方法，其包括：
[0059]
一、提取待检测样品的基因组dna；
[0060]
其中，待检测样品以固态形式提供，标准汤剂以冻干粉的形式提供(即将标准汤剂冷冻干燥后得到冻干粉)。
[0061]
具体的，提取方法如下：
[0062]
(一)取待检测样品，加入ctab沉淀液、蛋白酶k沉淀提取2～3次，得到沉淀物；
[0063]
具体的，取待检测样品0.03～0.08g，研磨成粉末，置离心管中，加入1～1.8ml的ctab沉淀液、15～25μl蛋白酶k，混合均匀，在50～60℃下加热45～65min，冷却至室温后离心，弃去上清液；加入800～1000μl ctab沉淀液、15～25μl蛋白酶k，混合均匀，在50～60℃下加热45～65min，冷却至室温后离心，弃去上清液，即得。
[0064]
其中，ctab沉淀液的组成为2％(w/v)ctab，100mmol/l tris-hcl(ph＝8.0)，20mmol/l edta(ph＝8.0)。
[0065]
(二)取沉淀物加入ctab提取液、β-巯基乙醇提取；然后加入氯仿-异戊醇萃取2～3次，得萃取后上清液；
[0066]
具体的，在沉淀物加入800～1000μl ctab提取液，5～15μlβ-巯基乙醇，混合均匀，在60～70℃加热100～150min，冷却至室温后取上清液，加入等体积的氯仿-异戊醇(24:1)混合液，震荡混匀后离心，取上清液700～800μl，再加入等体积的氯仿-异戊醇(24:1)混合液，震荡混匀后离心，取上清液400～500μl，即得。
[0067]
需要说明的是，在本步骤中，在采用ctab提取液、β-巯基乙醇提取结束后，可直接加入氯仿-异戊醇，也可取提取后所得上清液再加入氯仿-异戊醇，取上清液再加入氯仿-异戊醇可提升提取准确度。
[0068]
其中，ctab提取液：1～3％(w/v)ctab，80～120mmol/l tris-hcl(ph＝8.0)，10～30mmol/l edta(ph＝8.0)，1～3mol/lnacl，10～30％(w/v)pvp40。
[0069]
(三)取提取液加入异丙醇或异丙醇-乙酸钠沉淀提取，沉淀物经洗涤、孵育后用水溶解，即得待检测样品的基因组dna。
[0070]
具体的，取提取液，加入等体积的异丙醇或异丙醇-3mol/l乙酸钠混合液，于-30～-20℃静置30～60min，离心后弃去上清液，再用乙醇洗涤沉淀2～4次，弃去上清液，沉淀于35～38℃孵育20～40min，待乙醇挥发后，加入30～50μl灭菌水溶解，即得到待检测样品
的基因组dna。
[0071]
需要说明的是，申请人在面临牛膝/川牛膝标准汤剂、牛膝/川牛膝中药配方颗粒中基因组dna提取时，尝试了传统的ctab法、螯合树脂法、曲拉通-100法、sds法、碱式裂解法、dneasy blood&tissue kit法、磁珠法，但均得到了不溶性沉淀。故，本发明人在传统ctab法的基础上，对ctab沉淀液、ctab提取液以及提取程序加以改进，得到了上述提取方法。上述提取方法尽量多地保留牛膝/川牛膝标准汤剂、牛膝/川牛膝中药配方颗粒中的基因组dna信息，同时可克服辅料干扰的问题。
[0072]
二、形成pcr扩增体系，并进行扩增，得到扩增产物；
[0073]
具体的，将模板、引物、pcr预混液、水混合均匀，得到pcr扩增体系；
[0074]
更具体的，pcr扩增体系的总体积为25μl，其包括：pcr预混液12.5μl；第一引物对的上游引物、下游引物各0.3μl，第二引物对的上游引物、下游引物各0.3μl，模板1μl，ddh2o 10.3μl。
[0075]
其中，pcr预混液可选用2
×
pfu pcr mix(天根生化科技(北京)有限公司，kp201)，但不限于此。
[0076]
扩增程序为：92～95℃预变性4～6min；94～96℃变性28～32s，60～62℃退火26～32s，70～73℃延伸28～35s，循环35～45次；最后在71～75℃延伸4～6min。
[0077]
优选的，扩增程序为：95℃预变性5min，95℃变性30s，61℃退火30s，72℃延伸30s，循环40次，最后在72℃延伸5min。
[0078]
(3)将扩增产物进行分析；
[0079]
具体的，可采用电泳法或荧光染色法对扩增产物进行分析，但不限于此。
[0080]
优选的，采用电泳法对扩增产物进行分析，具体如下：
[0081]
取扩增产物，所述扩增产物稀释后点样于1.5～2％的琼脂糖凝胶上，于145～160v电压条件下电泳45～60min，经gelred显色，得到电泳图谱。
[0082]
若图谱中含有164bp的dna条带，则待检测样品含有川牛膝药材、川牛膝标准汤剂和/或川牛膝中药配方颗粒；若图谱中含有187bp的dna条带，则待检测样品含有牛膝药材、牛膝标准汤剂和/或牛膝中药配方颗粒。
[0083]
下面以具体实施例对本发明进行说明。
[0084]
实施例1引物设计
[0085]
以中国药典2020年版牛膝属药用植物的its、psba-trnh、matk、trnl-trnf等序列分析为基础，利用bioedit软件对genebank数据库中常见牛膝属药用植物的its序列进行同源比对，校对后分析川牛膝的特异性snp位点，将包含snp位点的碱基序列导入到primer premier 5软件中，进行引物设计。
[0086]
经序列对比发现，川牛膝在第70位特异性位点为c，而其他为t，在第204位特异性位点为a，而其他为c或g，确定该snp位点后，使snp位点分别接近正反向引物3’端，通过移动上游引物位置，调节引物得分及gc含量，并借助primer premier 5软件，进一步调节反向引物位置，通过最终引物评分、产物条带得分以确定最佳组合。在设计过程中，还需考虑到经高温提取后，对dna碱基序列的破坏作用。
[0087]
综合以上因素，获得的引物组合如下：
[0088]
nx-f：5
’‑
agcagaatgaccagcgaac-3’；
[0089]
nx-r：5
’‑
ccaggaaatccgagtaagg-3’；
[0090]
cnx-f：5
’‑
gttttcaagggtcctacgagc-3’；
[0091]
cnx-r：5
’‑
gtggggaaaggatgatgg-3’。
[0092]
实施例2鉴定方法建立
[0093]
(1)dna提取及浓度调节
[0094]
取干燥的样品0.05g，研磨成粉末，置于2ml离心管中，加入1.5ml在56℃预热的ctab沉淀液、20μl蛋白酶k，混匀，56℃水浴加热60min，冷却至室温后，以10000r/min离心5min，弃上清液，再加入900μl ctab沉淀液、20μl蛋白酶k，同法操作。向该离心管中依次加入900μl ctab提取液、10μlβ-巯基乙醇，混匀，65℃水浴加热120min，离心，待冷却至室温后取上清液；加入等体积的氯仿-异戊醇(24﹕1)，震荡3min，混匀；再以12000r/min，4℃离心10min，取上清液750μl加入新的2ml离心管中，加入等体积的氯仿-异戊醇(24﹕1)，震荡3min，混匀，12000r/min，4℃离心10min；再取上清液450μl于1.5ml离心管中，加入等体积异丙醇，于-20℃静置30～60min。取出该离心管以12000r/min离心5min，弃上清液，再分别用75％乙醇及无水乙醇洗涤沉淀两次，弃上清液，沉淀于37℃孵育30min，待乙醇挥发后，加灭菌水30μl使溶解。
[0095]
其中，ctab沉淀液组成如下：2％(w/v)ctab(上海源叶生物科技有限公司)，100mm tris-hcl(ph＝8.0)(beijing solarbio)，20mm edta(ph＝8.0)(shanghai yu bo biotech co.,ltd)。
[0096]
ctab提取液组成如下：2％(w/v)ctab(上海源叶生物科技有限公司)，100mm tris-hcl(ph＝8.0)(beijing solarbio)，20mm edta(ph＝8.0)(shanghai yu bo biotech co.,ltd)，2.5mol/l nacl(西陇科学股份有限公司)，20％pvp40(上海源叶生物科技有限公司)。
[0097]
取上述dna样品，采用biospec-nano微量紫外分光光度计测定dna浓度，同时记录od260/od230，od260/od280，并调整浓度到100ng/μl，得到dna模板。
[0098]
(2)设计引物
[0099]
引物序列如seq id no：1～6所示。
[0100]
(3)pcr扩增
[0101]
pcr扩增体系：2
×
pfu pcr mix(天根生化科技(北京)有限公司，kp201)12.5μl，10μmol/l的nx-f引物0.3μl，10μmol/l的nx-r引物0.3μl，10μmol/l的cnx-f引物0.3μl，10μmol/l的cnx-r引物0.3μl，100ng/μl的dna模板1μl，去离子水10.3μl。上述液体振荡混匀，瞬时离心，即得pcr扩增体系。
[0102]
pcr扩增程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，61℃退火30s，72℃延伸30s，共40个循环；最后72℃延伸5min。
[0103]
(4)电泳检测
[0104]
取扩增产物，加入6
×
loading buffer 5μl，混匀，取混合产物6μl点样于2％的琼脂糖凝胶上，于150v电压的条件下电泳45min，经gelred显色，最后于凝胶成像仪观察记录结果。
[0105]
若图谱中含有164bp的dna条带，则待检测样品含有川牛膝药材、川牛膝标准汤剂和/或川牛膝中药配方颗粒；若图谱中含有187bp的dna条带，则待检测样品含有牛膝药材、牛膝标准汤剂和/或牛膝中药配方颗粒。
[0106]
实施例3鉴定方法验证
[0107]
取不同产地、不同样品形态的牛膝、川牛膝样品60批次。采用实施例2建立的鉴别方法对样品进行鉴定。
[0108]
鉴定结果如图1、图2所示，从图中可以看出，牛膝药材、牛膝标准汤剂(冻干粉)、牛膝中药配方颗粒均存在187bp的条带；而川牛膝样品并无该条带。从图中可以看出，川牛膝药材、川牛膝标准汤剂(冻干粉)、川牛膝中药配方颗粒以均存在164bp的条带；而牛膝样品均未得到该条带。该结果表明，本发明中的鉴别方法准确率达到100％。
[0109]
以上所述是发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
[0110]
[0111]