一种麦根腐平脐蠕孢的lamp检测引物组、试剂盒及lamp检测方法
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，具体地涉及一种麦根腐平脐蠕孢的lamp检测引物组、试剂盒及lamp检测方法。


背景技术：

2.麦根腐平脐蠕孢(bipolaris sorokiniana)是半活体营养型植物致病菌，可危害多种禾本科植物，是引起玉米根腐病的重要病原菌之一。麦根腐平脐蠕孢引起的玉米根腐病一般在3～6叶期即出现症状，表现为植株矮化，下部叶片黄化或枯死，根或茎基部组织上有水渍状或黑褐色病斑，或腐烂，或缢缩，严重影响植株地上部生长。发病轻的植株可逐渐恢复，但长势明显减弱，后期造成产量损失；重者死亡，造成缺苗断垄。
3.玉米根腐病是典型的土传性病害，其病原菌组成十分复杂，目前已知能够引起玉米根腐病的病原菌有40余种。玉米根腐病可由1种病原菌单独侵染或2种以上病原菌复合侵染引起发病，给病害的精准防控带来巨大挑战。因此，准确鉴定病原菌种类尤为重要。传统形态学鉴定技术对于人员的专业和经验要求较高，且大多情况下无法准确鉴定病原菌种类。随着pcr技术日臻成熟，基于pcr技术的快速分子诊断方法，被广泛应用于包括麦根腐平脐蠕孢在内的植物病原菌研究领域。较常规显微镜形态观察检测方法，pcr检测更为精准、高效和灵敏。
4.环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，lamp)是一种新的等温扩增技术，因其操作简单快速、特异性、灵敏度高、成本低等特点，逐渐成为可以替代传统pcr的新的核酸扩增检测技术。它是针对靶基因的6个区域设计4条特异引物，利用bstdna聚合酶的链置换活性在同一反应体系中恒温高效扩增，大量合成目的dna的同时，产生副产物-白色焦磷酸镁沉淀。由于扩增反应依赖于靶dna的6个独立的区域，因此特异性非常高，反应在等温条件下进行，则不需要pcr仪等昂贵设备，仅用水浴锅等能够维持稳定恒温的设备即可完成，检测成本大大降低，应用范围显著扩大，可以在田间进行实时监测。由于lamp技术多方面的优点，近年来在病原物检测等方面应用广泛。专利cn111088394a以小麦根腐病菌索氏平脐蠕孢(b.sorokiniana)的its为靶序列，建立了索氏平脐蠕孢寄主的lamp检测技术，该反应体系在64℃水浴锅中反应60min，其检测的灵敏度为1pg，灵敏度较低，检测时间较长。


技术实现要素：

5.本发明的目的是以参与黑色素合成途径的相关基因1,3,8-三羟基萘还原酶基因(3hnr)为靶标，提供一种麦根腐平脐蠕孢的lamp检测引物组，可快速检测麦根腐平脐蠕孢，灵敏度高，特异性强。
6.为了实现上述目的，本发明采取以下技术方案：
7.本发明的一个目的在于提供一种麦根腐平脐蠕孢的lamp检测引物组，所述引物组
包括外引物对bsf3和bsb3、内引物对bsfip和bsbip、以及环引物对bslf和bslb，各引物对的序列如下：
8.bsf3：gaggagttcgaccgtgtc；
9.bsb3：gcacctggtgaaagtctca；
10.bsfip：catctccatgcgcttgtacgcaccatcaacactcgtgg；
11.bsbip：atcctcatgggatccatcaccgtttgagccagagtagacagc；
12.bslf：ttggcaacgaagaactga；
13.bslb：gtcaggcaaagggtgt。
14.本发明的另外一个目的为提供一种检测麦根腐平脐蠕孢的试剂盒，所述试剂盒包括本发明的上述引物组、rm反应缓冲液、bst dna聚合酶和染料。
15.作为优选的，本发明的试剂盒还包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照包括麦根腐平脐蠕孢基因组dna或者含麦根腐平脐蠕孢3hnr基因的质粒dna，所述阴性对照不含麦根腐平脐蠕孢基因组dna或麦根腐平脐蠕孢3hnr基因。
16.优选的，本发明的试剂盒，包括2
×
rm反应缓冲液，100μm的外引物bsf3和bsb3，100μm的内引物bsfip和bsbip，100μm的环引物bslf和bslb，8000u/ml的bst dna聚合酶，tvr染料，麦根腐平脐蠕孢基因组dna或者101～105copies/μl含麦根腐平脐蠕孢3hnr基因的质粒dna，阴性对照。
17.本发明还提供了上述lamp检测引物组及试剂盒用于检测麦根腐平脐蠕孢中的应用。
18.本发明的另一个目的还在于提供一种检测麦根腐平脐蠕孢的lamp检测方法，该方法包括：提取待测样品的总dna，用本发明的上述引物组在lamp反应体系中进行扩增，通过反应体系的颜色变化判断麦根腐平脐蠕孢的有无。
19.优选的，本发明所述反应体系为：2
×
rm反应缓冲液12.5μl，100μm外引物bsf3和bsb3各0.1μl，100μm内引物bsfip和bsbip各0.4μl，100μm环引物bslf和bslb各0.2μl，8000u/ml bst dna聚合酶1μl，dna模板1μl，tvr染料1μl，灭菌去离子水补足至25μl。
20.优选的，本发明所述扩增条件为：61℃～68℃反应20～40min，进一步优选所述扩增在66℃～68℃下扩增25～30min。
21.优选的，若反应体系呈现亮绿色为阳性反应，若反应体系呈无色为阴性反应。
22.本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：
23.(1)灵敏度高：本发明通过lamp检测引物组对麦根腐平脐蠕孢进行lamp扩增，检测下限能够达到10copies/μl dna(相当于40ag/ul)，灵敏度大大提高。
24.(2)特异性强：本发明以麦根腐平脐蠕孢3hnr基因序列为靶标设计了一套lamp特异引物，对麦根腐平脐蠕孢进行特异性识别，特异性强，能够快速准确完成麦根腐平脐蠕孢的检测。
25.(3)操作简便快捷：本发明提供的检测麦根腐平脐蠕孢的lamp方法，克服了现有生物与化学检测方法样品处理繁琐，检测周期长、费时费力及需要pcr热循环仪等问题，该方法无需pcr反应中的退火、复性等温度的变化，最短20min即可完成检测，大大提高了检测的效率。
26.(4)成本低：本方法无需昂贵、精密的试验仪器设备，仅需要恒温水浴锅或保温杯
即可完成检测，且实验过程中所用均为常规试剂，价格低廉。因此本方法实用性强，可满足麦根腐平脐蠕孢的快速检测。
附图说明
27.图1为本发明lamp反应不同温度条件下的扩增曲线。
28.图2为本发明lamp反应敏感性扩增曲线；
29.图3为本发明lamp反应敏感性可视化检测；
30.图2-3中，a～g:105,104,103,102,101,100,10-1
copies/μl模板dna，h:阴性对照。
31.图4为本发明lamp反应特异性扩增曲线；
32.图5为本发明lamp反应特异性可视化检测；
33.图4-5中，a：麦根腐平脐蠕孢基因组dna；b：含麦根腐平脐蠕孢3hnr基因的质粒dna(102copies/μl)；c～l：嘴突凸脐孢，链隔孢，弯孢菌，小柄凸脐蠕孢，拟轮枝镰孢，层出镰孢，禾谷镰孢，尖孢镰孢，玉米生平脐蠕孢，无菌水。
具体实施方式
34.本发明以麦根腐平脐蠕孢3hnr基因序列为靶标，进行lamp特异引物设计。根据3hnr基因部分序列的6个区域设计了由2条外引物、2条内引物和2条环引物组成的引物组，各引物的序列分别如seq id no.1～6所示。利用本发明的引物组能够准确、快速的对麦根腐平脐蠕孢进行检测，特异性强。
35.本发明利用上述引物组提供了一种检测麦根腐平脐蠕孢的试剂盒，所述试剂盒包括本发明所述的引物组、rm反应缓冲液、bst dna聚合酶和染料。进一步还包括阳性对照和阴性对照。
36.本发明所述试剂盒中，rm反应缓冲液可以为本领域中的已知产品，优选包括40mm tris-hcl(ph 8.8)、20mm kcl、16mm mgso4、20mm(nh4)2so4、0.2％tween20、1.6m betaine、2.8mm dntps(每种)。
37.本发明所述试剂盒中的染料可选择本领域中已知的lamp核酸染料，包括但不限于tvr染料、fdr染料、hnb染料等。在本发明具体实施例中，优选采用tvr染料，根据反应前后颜色的变化判断麦根腐平脐蠕孢的有无。本领域技术人员可根据本领域的常规方式添加合适量的染料。
38.本发明中的阳性对照为包括麦根腐平脐蠕孢基因组dna或者含麦根腐平脐蠕孢3hnr基因的质粒dna。由于本发明检测麦根腐平脐蠕孢的灵敏度能够达到10copies/μl dna，因此本发明的试剂盒中，麦根腐平脐蠕孢基因组dna或者含麦根腐平脐蠕孢3hnr基因的质粒dna大于10copies/μl均可以作为阳性对照。
39.本发明中的阴性对照不含麦根腐平脐蠕孢基因组dna或麦根腐平脐蠕孢3hnr基因，在本发明实施例中，优选无菌水作为阴性对照。
40.作为一种实施方式，本发明的麦根腐平脐蠕孢lamp检测试剂盒优选为，包括2
×
rm反应缓冲液，100μm的外引物bsf3和bsb3，100μm的内引物bsfip和bsbip，100μm的环引物bslf和bslb，8000u/ml的bst dna聚合酶，tvr染料，102copies/μl含麦根腐平脐蠕孢3hnr基因的质粒dna，阴性对照。
41.利用本发明的上述lamp引物组或lamp试剂盒检测麦根腐平脐蠕孢具有灵敏度高，特异性好，检测时间短，方便快速的优点。
42.本发明提供了一种麦根腐平脐蠕孢的lamp检测方法，该方法包括，提取待测样品的总dna，用本发明所述的引物组在lamp反应体系中进行扩增，通过反应体系的颜色变化判断麦根腐平脐蠕孢的有无。
43.本发明对dna的提取方法没有特殊限定，本领域中已知的dna提取方法均可用于本发明中。在本发明实施例中，采用真菌基因组dna快速提取试剂盒提取真菌dna。
44.本发明中，所述反应体系优选为：2
×
rm反应缓冲液12.5μl，外引物bsf3和bsb3各0.1μl，内引物bsfip和bsbip各0.4μl，环引物bslf和bslb各0.2μl，bst dna聚合酶1μl，dna模板1μl，tvr染料1μl，灭菌去离子水补足至25μl。
45.本发明中，所述lamp扩增条件为：61℃～68℃反应20～40min，进一步优选为66～68℃下扩增25～30min，更优选的为66℃下扩增25min。
46.本发明根据染料的不同，通过反应体系的颜色变化判断麦根腐平脐蠕孢的有无。当反应体系中选用tvr染料时，反应体系呈现亮绿色为阳性反应，样品中有麦根腐平脐蠕孢；反应体系呈无色为阴性反应，样品中无麦根腐平脐蠕孢。当反应体系中选用fdr染料时，反应体系呈现绿色为阳性反应，样品中有麦根腐平脐蠕孢；反应体系呈橙色为阴性反应，样品中无麦根腐平脐蠕孢。当反应体系中选用hnb染料时，反应体系呈现天蓝色为阳性反应，样品中有麦根腐平脐蠕孢；反应体系呈紫色为阴性反应，样品中无麦根腐平脐蠕孢。
47.本发明对lamp扩增所用的设备没有特别限定，只要是能提供恒温温度的设备都能用于本发明中。所述设备包括但不限于恒温水浴锅、金属浴或保温箱。在本发明具体实施例中，采用浊度仪提供lamp反应的恒温条件。
48.下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
49.实施例1
50.麦根腐平脐蠕孢dna的提取：麦根腐平脐蠕孢接种到马铃薯葡萄糖琼脂培养基中(pda：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂粉20g，蒸馏水1l，高温、高压灭菌20min)，28℃黑暗培养至少7d，收集菌丝体。采用真菌基因组dna快速提取试剂盒(购自北京艾德莱生物科技有限公司)，按照使用说明书的操作方法提取麦根腐平脐蠕孢的基因组dna，并将dna保存在-20℃备用。
51.麦根腐平脐蠕孢3hnr基因扩增：以麦根腐平脐蠕孢基因组dna为模板，采用引物brn01和brn02扩增麦根腐平脐蠕孢参与黑色素合成途径的相关基因1,3,8-三羟基萘还原酶基因3hnr。
52.brn01：gccaacatcgagcaaacatgg；
53.brn02：gcaagcagcaccgtcaataccaat。
54.pcr反应体系：2
×
easytaq pcr supermix 12.5μl，引物brn01和brn02(10μm)各0.5μl，模板dna 1μl，ddh2o补足至25μl。
55.反应条件：95℃，5min；95℃，30s，55℃，30s，72℃1min，35个循环；72℃，10min。
56.pcr产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测。
57.质粒构建：采用easypure quick gel extraction kit回收扩增的3hnr基因片段，将其连接至pmd19-t克隆载体并转化至dh5α感受态细胞，挑取单克隆进行菌液pcr验证，阳性克隆由上海生工生物工程股份有限公司完成测序。采用质粒提取试剂盒提取质粒dna，-20℃保存备用。
58.实施例2
59.麦根腐平脐蠕孢lamp引物设计
60.以获得的麦根腐平脐蠕孢3hnr基因序列为靶标，根据3hnr基因部分序列的6个区域设计了由2条外引物、2条内引物和2条环引物组成的引物组，并由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列见表1。
61.表1麦根腐平脐蠕孢的lamp检测引物组
[0062][0063]
实施例3
[0064]
lamp引物最佳反应温度筛选
[0065]
检测麦根腐平脐蠕孢的lamp扩增反应体系包括：2
×
rm反应缓冲液12.5μl，实施例2合成的100μm外引物bsf3和bsb3各0.1μl，100μm内引物bsfip和bsbip各0.4μl，100μm环引物bslf和bslb各0.2μl，8000u/ml bst dna聚合酶1μl，102copies/μl实施例1制备的质粒dna模板1μl，去离子水补足至25μl。
[0066]
使用实时浊度仪对引物的最佳反应温度进行检测，预设温度为61～68℃，共8个处理。扩增反应条件为预设温度条件下孵育40min，然后在95℃孵育15min终止反应。通过分析浊度曲线，确定引物的最佳反应温度。
[0067]
分析实时扩增浊度曲线(图1)，结果表明，在61℃～68℃条件下本发明引物组均能实现扩增。相较于61℃～65℃，实时扩增浊度曲线在66℃～68℃条件下起峰更早，浊度值更高，扩增效率更好。在66℃、67℃和68℃条件下实时扩增浊度曲线相近，考虑过高的温度会对bst dna聚合酶的活性造成更大影响，所以选择66℃为该引物组的最佳反应温度。
[0068]
实施例4
[0069]
lamp反应的灵敏度检测
[0070]
为检测lamp反应的灵敏度，将实施例1中制备的含有3hnr基因的质粒dna进行倍数稀释，分别以105、104、103、102、101、100、10-1
copies/μl的质粒作为模板dna，同时以灭菌去离子水作为阴性对照的模板。
[0071]
扩增体系为：2
×
rm反应缓冲液12.5μl，本发明实施例2合成的100μm外引物bsf3和
bsb3各0.1μl，100μm内引物bsfip和bsbip各0.4μl，100μm环引物bslf和bslb各0.2μl，8000u/ml bst dna聚合酶1μl，dna模板1μl，tvr染料1μl，最后用灭菌去离子水补足至25μl。
[0072]
使用实时浊度仪采集扩增曲线，反应条件为66℃孵育40min，然后在95℃孵育15min终止反应。通过分析浊度曲线，同时采用可视颜色法直接观察反应液是否发生颜色变化，阳性反应呈亮绿色，而阴性呈无色，判断lamp反应的最低检测浓度。
[0073]
实时扩增浊度曲线表明，以105～101copies/μl dna为模板的反应均有扩增，而以100和10-1
copies/μl dna为模板的反应没有检测到扩增曲线(图2)。可视颜色法的结果显示，当模板dna为101～105copies/μl时，反应液呈现亮绿色的阳性反应，而以100和10-1
copies/μl dna为模板的反应液呈无色的阴性反应(图3)，与实时浊度法的检测结果一致。由此可见，本发明针对麦根腐平脐蠕孢建立的lamp检测技术的检测下限为10copies/μl dna。
[0074]
此外，根据实时浊度曲线显示，最低检测限浓度的模板仅需18min就有扩增反应，因此，在实际应用时推荐恒温扩增时间为20～30min，以25min为宜。
[0075]
实施例5
[0076]
lamp反应的特异性检测
[0077]
本实施例以从玉米根腐病样本上分离到的几种病原真菌的基因组dna为模板进行扩增，同时以含有麦根腐平脐蠕孢3hnr基因的102copies/μl质粒dna为阳性对照，以无菌水为阴性对照，检测lamp扩增反应的特异性。纯化、鉴定后的菌株信息见表2。
[0078]
表2供试病原菌菌株
[0079][0080]
上述病原菌菌株基因组dna的提取同实施例1，lamp扩增反应的反应体系、条件及检测方法同实施例4。
[0081]
实时扩增浊度曲线表明，以麦根腐平脐蠕孢基因组dna和102copies/μl质粒dna为模板的反应均有扩增，而以玉米生平脐蠕孢、嘴突凸脐孢、链隔孢、弯孢菌、小柄凸脐蠕孢、
拟轮枝镰孢、层出镰孢、禾谷镰孢和尖孢镰孢等菌株基因组dna为模板的反应以及阴性对照均没有检测到扩增曲线(图4)。可视颜色法的结果显示，当模板为麦根腐平脐蠕孢基因组dna和102copies/μl质粒dna时，反应液呈现亮绿色的阳性反应，而以其他菌株基因组dna为模板的反应液以及阴性对照呈无色的阴性反应(图5)，与实时浊度法的检测结果一致。由此可见，本发明基于麦根腐平脐蠕孢3hnr基因建立的lamp检测技术能够特异性检测麦根腐平脐蠕。
[0082]
上述实施例为本发明最佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。