1.本发明属于生物检测领域，具体涉及一种检测尖音库蚊的环介导等温扩增引物、试剂盒和方法。


背景技术：

2.尖音库蚊(culex pipiens)是蚊科的吸血蚊子，通常是指包含尖音库蚊指名亚种、致倦库蚊亚种、淡色库蚊亚种和骚扰库蚊亚种的复合组，分布广泛，是全球传播疾病的重要媒介，能够引起人类疾病，例如由尖音库蚊作为主要传播媒介引起的班氏丝虫病。因此对尖音库蚊进行鉴别有助于防止尖音库蚊虫媒疾病的传播和扩散。
3.目前，对尖音库蚊的研究重要集中在基于基因测序的分子分类系统学上，对该蚊虫的鉴别方法也主要集中在通过医学媒介生物的传统形态鉴定，其存在很多问题，例如受发育状态、肢体残缺不全的限制以及近缘种影响等难以准确鉴定，另外还存在鉴定周期长、鉴定人员技术水平要求高、费时费力等缺陷。


技术实现要素：

4.针对现有技术中存在的问题的一个或多个，本发明的一个方面提供一种检测尖音库蚊的环介导等温扩增引物，其包括：
5.包含如seq id no：12所示的核苷酸序列的正向内引物fip，
6.包含如seq id no：13所示的核苷酸序列的反向内引物bip，
7.包含如seq id no：10所示的核苷酸序列的正向外引物f3，和
8.包含如seq id no：11所示的核苷酸序列的反向外引物b3。
9.上述环介导等温扩增引物还包括包含如seq id no：14所示的核苷酸序列的反向环引物lb。
10.本发明的另一方面还提供一种检测尖音库蚊的环介导等温扩增试剂盒，其包括上述的环介导等温扩增引物。
11.上述环介导等温扩增试剂盒还包括用于环介导等温扩增检测尖音库蚊的反应体系的反应缓冲液、荧光染料、dna聚合酶、dntp和mg
2+
。
12.上述环介导等温扩增试剂盒还包括用于环介导等温扩增检测尖音库蚊的反应体系的bst4.0 sybr green isoamp mastermix，其包含反应缓冲液、sybr green荧光染料、bst 4.0dna/rna聚合酶、dntp和mg
2+
。
13.本发明再一方面还提供一种检测尖音库蚊的环介导等温扩增方法，其包括以下步骤：
14.1)提取待测样品dna；
15.2)利用上述的环介导等温扩增试剂盒对步骤1)提取的待测样品dna进行环介导等温扩增，读取扩增曲线；
16.3)根据步骤2)读取的扩增曲线结果进行判定：
17.若阳性对照出现扩增曲线，且阴性对照不出现扩增曲线，则证明试验结果有效；
18.若待测样品的环介导等温扩增反应体系出现扩增曲线，则为阳性，表明在待测样品中含有尖音库蚊；若待测样品的环介导等温扩增反应体系不出现扩增曲线，则为阴性，表明在待测样品中不含尖音库蚊。
19.上述方法中，在步骤2)中对待测样品dna进行环介导等温扩增的20μl反应体系包含：2xbst4.0 sybr green isoamp mastermix 8-12μl，作为模板的待测样品dna 1-3μl，正向内引物fip和反向内引物bip的浓度分别为15-17μm、正向外引物f3和反向外引物b3的浓度分别为1-3μm，ddh2o补充至体积为20μl。
20.上述方法中，在步骤2)中对待测样品dna进行环介导等温扩增的20μl反应体系还包含反向环引物lb，其浓度为3-5μm。
21.上述方法中，在步骤2)中对待测样品dna进行环介导等温扩增的反应条件为：反应温度为60-66.4℃，反应时间为18-40min。
22.上述方法中，在步骤2)中对待测样品dna进行环介导等温扩增的反应条件为：反应温度为63-65℃，反应时间为18-20min。
23.基于以上技术方案提供的检测尖音库蚊的环介导等温扩增引物基于尖音库蚊基因组中的一段高保守性的coi基因序列设计得到，包括如seq id no：12所示的正向内引物fip，如seq id no：13所示的反向内引物bip，如seq id no：10所示的正向外引物f3，如seq idno：11所示的反向外引物b3，还可包括如seq id no：14所示的反向环引物lb。经实施例结果表明，基于本发明提供的检测尖音库蚊的环介导等温扩增引物的检测方法和检测试剂盒能够高灵敏度(检测最低限为0.5pg/μl)、高特异性检测尖音库蚊，并且具有检测周期短(可在20min内完成检测，检测效率高)、恒温检测、对设备要求低(不需要复杂仪器)、对鉴定检测人员水平要求低等特点，解决了现有技术中尖音库蚊鉴定多依赖于形态学鉴定而存在的问题。
附图说明
24.图1为实施例1中设计的1号、2号、3号引物组分别对尖音库蚊dna进行lamp扩增的荧光曲线；
25.图2为不同反应温度条件下使用本发明提供的3’号引物组对尖音库蚊dna进行lamp扩增的荧光曲线；
26.图3为本发明提供的3’号引物组对尖音库蚊检测的特异性结果荧光曲线；
27.图4为本发明提供的3’号引物组对尖音库蚊检测的敏感性结果荧光曲线；
28.图5为实施例4中2’号引物组对尖音库蚊检测的敏感性结果荧光曲线；
29.图6为本发明提供的检测尖音库蚊的lamp试剂盒对30份蚊样本dna的检测扩增荧光曲线。
具体实施方式
30.环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，lamp)是日本学者notomi在nucleic acids res杂志上公开的一种新的适用于基因诊断的恒温核酸扩增技术，目前已经广泛应用于核酸检测，但还未有将该环介导等温扩增技术用于检测鉴别尖
音库蚊的报道。发明人以尖音库蚊的coi基因片段作为靶基因设计用于检测尖音库蚊的lamp引物组，最终筛选获得一组可以用于高灵敏度和高特异性检测尖音库蚊的lamp引物，并基于该lamp引物组提供了用于检测尖音库蚊的环介导等温扩增试剂盒和方法。
31.以下结合具体实施例和附图详细说明本发明的内容。
32.在下文中，仅简单地描述了某些示例性实施例，各序号的实施例有助于阅读，其能各自独立实施以及相互关联实施而构成对本发明内容的有力支持。正如本领域技术人员可认识到的那样，在不脱离本发明的精神或范围的情况下，可通过各种不同方式修改所描述的实施例。因此，附图和描述被认为本质上是示例性的而非限制性的。
33.下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《分子克隆实验指南》(《molecular cloning:a laboratory manual》sambrook，j.，russell，david w.，molecularcloning:a laboratory manual，3rd edition，2001，ny，cold spring harbor)。
34.实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种试验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。
35.实施例中涉及的序列均可以通过现有技术合成。
36.实施例1：用于检测尖音库蚊的lamp引物的设计
37.鉴于coi基因在不同种类蚊之间存在较大的序列差异性，发明人利用尖音库蚊的coi基因序列(序列表中seq id no：1所示)在ncbi中进行blast分析，发现该基因序列在尖音库蚊种内高度保守，而在其它种类蚊之间存在可变性，因此发明人分析尖音库蚊的coi基因可以作为尖音库蚊检测的候选靶标基因。该实施例中以尖音库蚊的coi基因作为靶基因，使用在线lamp引物设计软件primerexplorer v5(http://primerexplorer.jp/lampv5e/index.html)设计用于检测尖音库蚊的lamp引物，设计获得了多组lamp引物组合，以下表1中列出其中三组。
38.表1：用于检测尖音库蚊的lamp引物组
[0039][0040]
分别使用上表1中的三组lamp引物对从尖音库蚊样品中提取的dna(例如利用市售的dna提取试剂盒按照说明书操作提取)进行lamp扩增，以从中选择确定最佳的lamp引物组合。其中可以在0.2ml ep反应管中加入用于lamp扩增检测的20μl反应体系，其包括下表2所示的试剂。反应体系配好后，置于荧光定量pcr仪中于65℃进行反应40min，每1min收集一次荧光信号，读取扩增曲线进行判读。
[0041]
表2：用于lamp扩增检测的20μl反应体系
[0042]
试剂体积2
×
bst4.0sybr green isoamp mastermix(产品编号a3824-03)10μl10
×
lamp primer mix2μl模板dna/rna2μlddh2o到总体积20μl
[0043]
注：10
×
lamp primer mix浓度：fip/bip分别为16μm、f3/b3分别为2μm。
[0044]
结果如图1所示，示出了表1中1号、2号和3号引物组分别对尖音库蚊dna的荧光扩增曲线，可见相对于1号和2号引物组，3号引物组的扩增效率最高，在9个循环后，即开始出现扩增曲线，并可获得相对强度较高的荧光信号；1号引物组的扩增效率最低，在13个循环后才开始出现扩增曲线，且获得的相对荧光强度较低。因此，本发明确定3号引物组作为扩增鉴别尖音库蚊dna的引物组。
[0045]
发明人还根据确定的3号引物组继续设计一条加速引物，即反向环引物lb，其核苷酸序列如下所示：ctttcaagtagtttagtag(seq id no：14)，以下实施例中利用3号引物组和该条反向环引物lb对尖音库蚊进行扩增检测，其中将3号引物组和该条反向环引物lb的组合命名为3’号引物组。
[0046]
实施例2：检测尖音库蚊的lamp反应温度的选择
[0047]
该实施例利用上述实施例1确定的3’号引物组在不同的反应温度条件下对尖音库蚊dna进行检测，以筛选确定本发明提供的检测尖音库蚊的lamp引物的最佳反应温度，其中20μl反应体系如上表2所示(其中10
×
lamp primer mix浓度为：fip/bip分别为16μm、f3/b3
分别为2μm、lb为4μm)，反应条件中温度梯度设置为：70℃，69.5℃，68.4℃，66.4℃，64℃，62℃，60.7℃，60℃，反应时间为40min，每1min收集一次荧光信号，读取扩增曲线进行判读。
[0048]
检测结果如图2所示，可见在60-66.4℃温度区间内，均可以获得扩增曲线，尤其是在64℃时，在15个循环后，即开始出现扩增曲线，并且可获得相对强度较高的荧光信号。因此，本发明确定检测尖音库蚊的lamp反应温度可为60-66.4℃，反应时间可为18-40min，优选反应温度为64℃左右，例如63-65℃，可在20min内获得检测鉴别结果。
[0049]
实施例3：检测尖音库蚊的lamp引物的特异性
[0050]
该实施例利用上述实施例1确定的3’号引物组对2株尖音库蚊和另外6株其它蚊种(白纹伊蚊、三带喙库蚊、骚扰阿蚊、中华按蚊)的dna作为模板进行检测，以评价本发明提供的检测尖音库蚊的lamp引物及检测方法的特异性。其中20μl反应体系如上表2所示(其中10
×
lamp primer mix浓度为：fip/bip分别为16μm、f3/b3分别为2μm、lb为4μm)，反应条件为：反应温度62.5℃，反应时间30min，每1min收集一次荧光信号，读取扩增曲线进行判读。
[0051]
结果如图3所示，可见所有尖音库蚊的检测结果均出现扩增曲线，而另外6株其它蚊种(白纹伊蚊、三带喙库蚊、骚扰阿蚊、中华按蚊)的检测结果均没有出现扩增曲线，表明本发明提供的用于检测尖音库蚊的lamp引物及检测方法具有良好的特异性。
[0052]
实施例4：检测尖音库蚊的lamp引物的敏感性
[0053]
该实施例利用上述实施例1确定的3’号引物组对不同浓度的尖音库蚊dna进行检测，以评价本发明提供的用于检测尖音库蚊的lamp引物及检测方法的敏感性，还同步利用2号引物组和针对该2号引物组继续设计的一条反向环引物lb’(其核苷酸序列如下所示：ctggatgaacagtgtatcc(seq id no:15)，将2号引物组和lb’引物的组合命名为2’引物组)对不同浓度的尖音库蚊dna进行检测。其中不同浓度的尖音库蚊dna的制备方法为：将提取的尖音库蚊的dna用超微量核酸检测仪测定浓度(50ng/μl)，后用ddh2o进行10倍梯度稀释，得到系列浓度的尖音库蚊dna作为模板：50ng/μl、5ng/μl、0.5ng/μl、50pg/μl、5pg/μl、0.5pg/μl、0.05pg/μl。20μl反应体系如上表2所示(其中10
×
lamp primer mix浓度为：fip/bip分别为16μm、f3/b3分别为2μm，当使用3’号引物组时，lb为4μm；当使用2’引物组时，lb’为4μm)，反应条件为：反应温度64℃，反应时间30min(使用2’号引物组时反应时间为35min)，每1min收集一次荧光信号，读取扩增曲线进行判读。
[0054]
利用3’号引物组对不同浓度的尖音库蚊dna进行检测的结果如图4所示，可见本发明提供的用于检测尖音库蚊的lamp引物及检测方法对尖音库蚊dna检测的最低限可以达到0.5pg/μl，而利用2’号引物组对尖音库蚊dna检测的最低限仅能达到5pg/μl，其检测结果如图5所示。
[0055]
实施例5：用于检测尖音库蚊的lamp试剂盒
[0056]
该实施例提供了用于检测尖音库蚊的lamp试剂盒，其包括上述实施例1确定的用于检测尖音库蚊的3号引物组，优选地，其还可以包括针对3号引物组设计的反向环引物lb，即该lamp试剂盒包括上述实施例1确定的用于检测尖音库蚊的3’号引物组。该lamp试剂盒还可以包括用于环介导等温扩增检测尖音库蚊的反应体系的反应缓冲液、荧光染料、dna聚合酶、dntp和mg
2+
，具体可以为bst4.0 sybr green isoamp mastermix(可以商购获得，例如产品编号为a3824-03的bst4.0 sybr green isoamp mastermix)。
[0057]
为了方便使用该实施例提供的试剂盒，在试剂盒中还可包括用于检测尖音库蚊的
环介导等温扩增方法，其可以包括以下步骤：
[0058]
1)提取待测样品dna；
[0059]
2)利用该实施例提供的试剂盒对步骤1)提取的待测样品dna进行环介导等温扩增，读取扩增曲线；
[0060]
3)根据步骤2)读取的扩增曲线结果进行判定：
[0061]
若阳性对照出现扩增曲线(例如典型的“s”型扩增曲线)，且阴性对照不出现扩增曲线，则证明试验结果有效；
[0062]
若待测样品的环介导等温扩增反应体系出现扩增曲线，则为阳性，表明在待测样品中含有尖音库蚊；若待测样品的环介导等温扩增反应体系不出现扩增曲线，则为阴性，表明在待测样品中不含有尖音库蚊。
[0063]
其中在步骤2)中对待测样品dna进行环介导等温扩增的20μl反应体系可以包含：2xbst4.0 sybr green isoamp mastermix 8-12μl，作为模板的待测样品dna 1-3μl，正向内引物fip和反向内引物bip的浓度分别为15-17μm、正向外引物f3和反向外引物b3的浓度分别为1-3μm，当还使用反向环引物lb时，其浓度可为3-5μm，ddh2o补充至体积为20μl。
[0064]
其中步骤2)中对待测样品dna进行环介导等温扩增的反应条件可以为：反应温度可为60-66.4℃，优选为63-65℃，反应时间可为18-40min，优选为18-20min。
[0065]
实施例6：尖音库蚊的临床样本检测
[0066]
该实施例中利用上述实施例5提供的试剂盒(其中包括反向环引物lb)按照试剂盒中提供的检测方法步骤对野外采集的30份蚊样本进行检测。首先使用传统形态鉴定方法对30份蚊样本进行鉴定，其中5份蚊样本为尖音库蚊，10份为白纹伊蚊，13份为三带喙库蚊，2份为中华按蚊。在用上述实施例5提供的试剂盒对30份蚊样本dna和阴性对照进行检测时，20μl反应体系如上表2所示，反应条件为：反应温度64℃，反应时间30min，每1min收集一次荧光信号，读取扩增曲线进行判读。
[0067]
检测结果如图6所示，在检测的30份蚊样本中，所有5份尖音库蚊样本的检测结果均出现扩增曲线，而其他蚊样本的检测结果均未出现扩增曲线，表明本发明提供的试剂盒和方法能够临床用于检测尖音库蚊。并且本发明提供的检测方法检测周期短(可以在30min内获得结果，优选可在20min内获得结果)、特异性强，灵敏度高(检测最低限可达到0.5pg/μl)，不需要复杂仪器。因此，本发明对于大量样本或残缺生物样本(待测样品dna浓度低)的尖音库蚊物种鉴定具有重要的应用价值。
[0068]
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。