1.本发明涉及微生物领域，更具体地，涉及重金属抗性菌及其应。


背景技术：

2.目前，重金属水污染越来越受到人们的重视，而采用微生物方法来修复重金属污染的水尤其受到重视。
3.例如，镍的用途极为广泛，它是制造不锈钢、合金钢及非铁合金的重要原料，在机械、冶金、电子、军工、宇航和原子能工业以及化工和轻工等部门均有重要用途。据报道，镀镍工业废水含镍为2-900mg/l，机械制造厂废水含镍0.5-35mg/l，金属加工业废水含镍为17-280mg/l。镍中毒不仅会引发过敏性皮炎，而且超量摄取或超量暴露，可导致人的心、脑、肝和肾退行性病变。2010年10月1日起正式实施的新国家标准《铜、镍、钴工业污染物排放标准》(gb 25467—2010)规定水体中镍的最高排放浓度为0.5mg/l。重金属治理，主要有物理、化学和生物修复。而生物修复由于经济、生态效益等优点，在重金属污染治理中占有重要地位。


技术实现要素：

4.本技术提供了一种重金属抗性菌，所述重金属抗性菌为伯克霍尔德菌，所述重金属抗性菌保藏于广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，保藏编号为：gdmcc no:61693。
5.在一些实施例中，重金属包括铜、锌、镍、锰、铅、钴。
6.本技术还提供了重金属抗性菌在重金属污染水治理中的应用。
7.本技术的重金属抗性菌对mn
2+
、ni
2+
、cu
2+
、pb
2+
、zn
2+
、co
2+
都表现较强的耐受能力。在镍的浓度为10mg/l时，该菌株对镍的吸附能达到90％以上。另外，对高浓度金属溶液，该菌株也表现出较高的吸附能力。低剂量的锰对该菌的生长影响较小。因此，该菌株可用于重金属污染水体的修复或治理。
附图说明
8.图1示出了本技术的重金属抗性菌在培养基上的形态的图片。
9.图2示出了本技术的重金属抗性菌在显微镜下观察的图片。
10.图3示出了本技术的重金属抗性菌的系统进化树。
11.图4示出了铜离子浓度对本技术的重金属抗性菌的生长的影响的曲线图。
12.图5和图6示出了锌离子浓度对本技术的重金属抗性菌的生长的影响的曲线图。
13.图7示出了镍离子浓度对本技术的重金属抗性菌的生长的影响的曲线图。
14.图8示出了铅离子浓度对本技术的重金属抗性菌的生长的影响的曲线图。
15.图9示出了锰离子浓度对本技术的重金属抗性菌的生长的影响的曲线图。
16.图10示出了钴离子浓度对本技术的重金属抗性菌的生长的影响的曲线图。
17.图11示出了ph值对本技术的重金属抗性菌的生长的影响的柱状图。
18.图12示出了吸附时间对本技术的重金属抗性菌去除镍的影响的曲线图。
19.图13示出了本技术的重金属抗性菌的菌体添加量和去除时间对镍离子去除的影响的曲线图。
20.图14示出了本技术的重金属抗性菌的菌体添加量和去除时间对锰离子去除的影响的曲线图。
21.本技术的重金属抗性菌，菌株属于变形杆菌亚门，伯克霍尔德菌burkholderia sp.，于2021年9月28日保藏于广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物菌种保藏中心 (gdmcc)，保藏编号为：gdmcc no:61693。
具体实施方式
22.下面的实施例可以使本领域技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
23.本技术提供一种重金属抗性菌，菌株属于变形杆菌亚门，伯克霍尔德菌burkholderia sp.，并于2021年9月28日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，保藏地址为：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为：gdmcc no:61693。该菌株表现出比较强的重金属耐受性能，对镍、铜、锌、铅、锰和钴有较强的吸附作用，可将该菌株用于重金属污染的水体和土壤的生物修复。
24.通过该重金属抗性菌对重金属污染物进行钝化吸附来降低水体和土壤中的毒性，具有成本低、效率高和不会产生二次污染等优点。
25.1.本技术的重金属抗性菌为伯克霍尔德菌(burkholderia sp.)，该菌株分离自广西锰矿周边土壤，能够耐重金属。该菌株的筛选步骤如下：土壤来自广西锰矿附近，这里的土壤含锰在60-188g/kg，含钴是100-200 mg/kg。将1mg土壤样品加入到装有50ml mh肉汤(mhb，牛肉粉2g/l，可溶性淀粉1.5g/l，酸水解酪蛋白17.5g/l，ph 7.4)的250ml锥形瓶中，将锥形瓶放置在35℃，150转每分钟，在摇床中培养24h后，取其中1ml 加入ni
2+
浓度为350mg/l的溶液中培养48h，再转入ni
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浓度为450mg/l 的培养基中继续培养48h。取最后溶液中的20μl培养液在含镍400mg/l 的固体培养基上划线培养。挑选不同形态的单克隆分别接种到未加任何金属离子的mh琼脂(mha，牛肉粉6g/l，可溶性淀粉1.5g/l，酸水解酪蛋白17.5g/l，琼脂17g/l，ph 7.3)中培养24h。直到培养出菌落特征一致的纯菌种。将分离得到的菌株进行多种重金属的最低抑菌浓度(mic) 测定。测定方法采用96孔板筛选。即用含锰、镍、铜、锌、钴等重金属浓度为100-3500mg/l的培养基在96孔板中对菌株进行重金属mic检测，于35℃培养基中培养48h，重复3次。选择其中对这些重金属耐受性最高的菌株为目标菌株，并进行菌株鉴定。
26.本技术的重金属抗性菌的特征如下：
27.形态：该菌株在mha平板上35℃，培养24h观察到圆形菌落，黄色，表面光滑，边缘整齐(图1)；菌株为短杆状(图2)，对该菌株进行革兰氏染色，显示为革兰氏阴性菌。
28.金属耐受性：将该菌株加入含镍(硝酸镍)0、100、400、500、600、 700mg/l的mhb培养液中，结果显示，ni
2+
的最大耐受为600mg/l，浓度为100mg/l的情况下细菌生长略有影响，在浓度为400mg/l的情况下，12h 后细菌才开始生长，500mg/l浓度下，细菌在24h后才开始生长。600mg/l 时ni
2+
在24h后也有生长。此外，该菌株对zn
2+
(硫酸锌)的最高耐受浓度为
4000mg/l，对铜(硫酸铜)最大耐受是800mg/l。对铅(硝酸铅)的最大耐受为3000mg/l；对锰(氯化锰)的最大耐受是4500mg/l。对钴(硫酸钴)的最大耐受为100mg/l。由此可知，该菌株对这几类重金属的耐受显著高于目前已知的一些菌株(例如，350mg ni/l；300mg cu
2+
/l；800mgzn
2+
/l)。
29.16s分析：从菌株纯培养物中提取基因组dna，利用通用软件27f和 1492r进行扩增和测序，进一步通过mega软件构建系统进化树(图3)。结果显示该菌为伯克霍尔德菌(burkholderia sp.)。
30.生理生化反应特征：该菌株的ph生长适宜范围为5-7，在这个ph范围内添加低剂量mn
2+
也不影响其生长。
31.该菌株的酶活检测结果显示，该菌株具有氧化酶、产硫化氢、产硫化氢、尿素反应呈阳性，如下表1所示，+表示阳性反应，-表示阴性反应。
32.表1菌株酶活性特性
[0033][0034][0035]
菌株抗生素抗性反应(表2)，结果显示菌株对氯霉素、头孢他啶、替加环素、环丙沙星、左氧氟沙星都敏感。在表2中，s表示敏感。
[0036]
表2菌株抗生素抗性
[0037]
抗生素抗性结果氯霉素s头孢他啶s替加环素s环丙沙星s
左氧氟沙星s
[0038]
下面讨论金属溶液的含量对菌株生长的影响。
[0039]
铜离子浓度的影响：将cu
2+
的浓度设为6个，单位为mg/l。0为不加任何金属离子的mhb，从图可以看出该菌对铜的最大耐受是700-800mg/l 之间的值。700mg/l的时候，菌株生长出现滞后，到6h后开始生长。重金属对细菌生长有抑制作用。在800-900mg/l的时候，菌株不生长，如图 4所示。
[0040]
锌离子浓度的影响：将zn
2+
的浓度设为5个，0为不加金属的mhb，从图5可以看出该菌株对锌的最大耐受超过2400mg/l，从图6可以看出菌株对锌的最大耐受为3g/l。
[0041]
镍离子浓度的影响：将ni
2+
的浓度设为5个，0为不加金属的mhb，从图7可以看出该菌株对ni
2+
的最大耐受低于600mg/l，溶度为100mg/l 的情况下细菌生长略有影响，在浓度为400mg/l的情况下，12h后细菌才开始生长，500mg/l浓度下，细菌在24h后才开始生长，ni
2+
浓度为700mg/l 的溶液在4天后发现有菌生长。
[0042]
铅离子浓度的影响：将pb
2+
的浓度设为4个，单位为g/l。0为不加任何金属离子的mhb，从图8可以看出该菌株对铅的最大耐受是 1.5g/l-3g/l之间的值。1.5g/l的时候，菌株生长出现滞后，到6h后开始生长。铅金属对细菌生长有抑制作用，在3g/l的时候，菌株不生长。
[0043]
锰离子浓度的影响：将mn
2+
的浓度设为4个，单位为g/l。0为不加任何金属离子的mhb，从图9可以看出该菌对mn
2+
的最大耐受大于4.5g/l。
[0044]
钴离子浓度的影响：将co
2+
的浓度设为3个，单位为g/l。0为不加任何金属离子的mhb，从图10可以看出该菌株对co
2+
的最大耐受小于 0.1g/l。但是菌的生长有滞后。
[0045]
ph值对菌株生长的影响：将活化16h的菌株以6％的接种量加在 ph＝2-7的溶液中(ph》7时金属离子会发生沉淀)的mhb中，做有无锰的对照。所有样品分成3份，150rpm摇床培养12h。用分光光度计检测，培养基校零。如图11所示，ph在5-7时细菌生长差值较小，ph在4以下时细菌无法生长。ph在4时，细菌的生长状态比较差。添加低剂量的mn
2+
，对细菌的生长影响较小。
[0046]
菌株对不同重金属的去除效率：
[0047]
将本技术提供的伯克霍尔德菌接种到10mg/l的镍水溶液中，3h对镍的去除率可达90％以上。其余重金属的吸附效果见表3。具体地，在10 mg/l ni
2+
溶液中投加3g/l湿菌体，于30℃下，120r/min振荡吸附，分别在10、20、30、40、50、60、90、120、150、180、210、270、330min 取样测定ni
2+
的含量，考察吸附时间对ni
2+
去除的影响。在低浓度的情况下，镍的含量在10mg/l时，菌对金属溶液的吸附达到91％以上，如图12 所示。将金属溶液配置成下表3的高浓度。重金属溶液的金属含量见下表 3，每组重复3次。菌株对高浓度金属溶液的最高去除效率见下表。
[0048]
表3菌株对不同重金属污染水体21h的去除效率
[0049][0050]
吸附实验过程：在mhb培养基中按2％的接种量接入菌株的种子液， 35℃，150rpm恒温摇床培养18h。8000r/min离心10min收集菌体，用超纯水洗涤菌体3次，将湿菌体作为生物吸附剂。在一定的ph(例如， 7.2)和温度(25℃)下，将湿菌体投加到已知浓度的重金属溶液中， 150rpm恒温振荡一定时间后，取样，8000r/min离心10min，用 spectraa220型原子吸收分光光度计测定上清中剩余ni
2+
的浓度，计算去除效率。
[0051]
菌株对重金属的去除效率r的计算方法
[0052][0053]
其中，r为重金属的去除效率，c0为重金属的初始浓度(mg/l)， ce为平衡时溶液中重金属的浓度(mg/l)。
[0054]
下面考察了菌体添加量和去除时间对ni
2+
金属去除效率的影响。将 ni
2+
金属溶液配制为10mg/l，在装有30ml mhb的50ml离心管中加入湿菌，如图13所示。如图13可知，针对同样的菌液量，吸附4h的吸附率要稍微高于吸附2h的吸附率。
[0055]
下面考察了菌体添加量和吸附时间对mn
2+
金属去除效率的影响。将 mn
2+
金属溶液配制为100mg/l，在装有30ml mhb的50ml离心管中加入湿菌，如图14所示。如图14可知，针对同样的菌液量，吸附6h的吸附率通常要高于吸附2h的吸附率。
[0056]
由上可知，本技术的重金属抗性菌对mn
2+
、ni
2+
、cu
2+
、pb
2+
、zn
2+
、 co
2+
都表现较强的耐受能力。在镍的浓度为10mg/l时，该菌株对镍的吸附能达到90％以上。另外，对高浓度金属溶液，该菌株也表现出较高的吸附能力。低剂量的锰对该菌的生长影响较小。因此，该菌株可用于重金属污染水体的修复或治理。
[0057]
本领域技术人员应理解，以上实施例仅是示例性实施例，在不背离本技术的精神和范围的情况下，可以进行多种变化、替换以及改变。