与烟草黑胫病1号生理小种抗性基因qbs1连锁的ssr标记
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种与烟草黑胫病1号生理小种抗性基因qbs1紧密连锁的共显性ssr标记及其应用。


背景技术：

2.烟草黑胫病(tobacco black shank)是世界烟草生产中危害最严重的病害之一，也是中国烟叶生产的主要病害之一。目前生产上烟草黑胫病优势生理小种呈现0号到1号的转换趋势。为了培育出具有黑胫病1号生理小种抗性的烟草新品种，受微效多基因控制且呈水平抗性的数量性状抗源受到烟草育种工作者的重视。
3.而针对具有1号生理小种抗性的研究，则主要是利用雪茄烟品种florida 301和beinhart1000-1中受微效多基因控制的数量性状抗性。vontimitta等进行了beinhart 1000抗黑胫病qtl分析，检测到6个qtl与黑胫病抗性相关，贡献率最大的主效qtl位点位于8号连锁群(vontimitta v,lewis r s.mapping of quantitative trait loci affecting resistance to phytophthora nicotianae in tobacco(nicotiana tabacum l.)line beinhart-1000.mol breeding,2012,29:89-98.)。zhang等在beinhart 1000-1中也定位到效应最大qtl(qbs7)，ma等进一步分析了该qtl(定名为phn7.1)的位置和效应，通过开发snp提高标记密度，利用一系列近等基因系(nil)将定位区间缩小到约3cm的区间，可用于分子标记辅助选择育种和候选基因克隆(zhang y,guo x,yan x,ren m,jiang c,cheng y,wen l,liu d,zhang y,sun m,feng q,yang a,chenga l.identification of stably expressed qtl for resistance to black shank disease in tobacco(nicotiana tabacum l.)line beinhart 1000-1.the crop j.,2018,6:282-290；ma j m,heim c,humphry m,nifong j m,lewis r s.genetic analysis of phn7.1,a major qtl conferring partial resistance to phytophthora nicotianae in nicotiana tabacum.mol breeding,2019,39:11.)。
4.此外，针对上述属于数量性状的烟草黑胫病1号生理小种抗性基因/qtl开发的标记，目前尚未报道。专利zl 2017 1 1124725.1虽然涉及到烟草黑胫病1号生理小种，但提供的基因是属于质量性状，且对黑胫病1号生理小种的抗性源也不同。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种用于烟草黑胫病1号生理小种抗性育种和检测中的分子标记，且其抗源是受微效多基因控制的数量性状。
6.本发明提供了一种与烟草黑胫病1号生理小种抗性基因qbs1紧密连锁的共显性ssr标记，可用于检测烟草基因组dna中是否存在烟草黑胫病1号生理小种抗性基因qbs1。
7.本发明的目的是这样实现的，为简捷、精准、高效的选择具有抗烟草黑胫病1号生理小种的品种，有针对性的选择含抗黑胫病基因qbs1的后代材料，以高抗黑胫病1号生理小种的雪茄烟品种beinhart1000-1和易感病烤烟品种红花大金元为亲本，通过杂交、连续套
袋自交，构建了一个含有341份株系的烟草重组自交系(rils_f
7:8
)为作图群体，利用数量性状连锁分析(qtl)法和单粒黑胫病菌谷创伤接种法，在烟草全基因组范围内筛选获得与烟草黑胫病1号生理小种抗性基因qbs1紧密连锁的共显性ssr标记，以加速分子标记辅助选择(mas)在烟草抗黑胫病1号生理小种新品系选育中的精准、高效利用。
8.所述与烟草黑胫病1号生理小种抗性基因qbs1紧密连锁的共显性ssr标记的编号为tmc44177和tmc61373，其pcr扩增产物核苷酸序列分别如seq id no:1和seq id no:2、seq id no:3和seq id no:4所示。
9.本发明所述的与烟草黑胫病1号生理小种抗性基因qbs1紧密连锁的共显性ssr标记中，可以用于检测烟草基因组dna中是否存在黑胫病1号生理小种抗性基因qbs1。检测方法是：
10.分别以tmc44177序列的引物和tmc61373序列的引物扩增待检测烟草基因组dna，检测pcr扩增产物，并按以下方式进行判别：
11.如果pcr扩增产物中同时含有如seq id no:1和seq id no:3所示序列，即为该烟草植株具有黑胫病1号生理小种抗性的纯合等位基因r1r1；
12.如果pcr扩增产物中同时含有如seq id no:2和seq id no:4所示序列，则为待测烟草植株不存在黑胫病1号生理小种抗性的纯合等位基因r1r1；
13.如果pcr扩增产物中含有如seq id no:1和seq id no:2所示序列，或含有如seq id no:3和seq id no:4所示序列，或含有如seq id no:1、seq id no:3和seq id no:4所示序列，或含有如seq id no:3、seq id no:1和seq id no:2所示序列，即为待测烟草植株中含有黑胫病1号生理小种抗性的杂合基因r1r1。
14.所述的分子标记所对应的2个位点的引物序列分别为：
15.tmc44177引物序列为：
16.tmc44177f：seq id no:5；
17.tmc44177r：seq id no:6；
18.tmc61373引物序列为：
19.tmc61373f：seq id no:7，
20.tmc61373r：seq id no:8。
21.本发明提供的共显性ssr标记tmc44177和tmc61373，具有精准、高效、稳定、便捷和低成本的特点，能够提高分子标记辅助选择的效率，提高抗黑胫病1号生理小种烟草品种选育的效率。因此该分子标记可以在烟草黑胫病1号生理小种抗病育种中，用于抗黑胫病基因qbs1的辅助选择。
22.与现有技术相比，本发明的有益效果为：
23.1、抗源类型不同，本发明是数量性状抗性
24.现有技术的黑胫病抗性基因标记的抗源均是受单基因控制的质量性状，来源于非栽培烟草－野生烟草种(n.plumbaginifolia和n.longiflora)和黄花烟草种(n.rustica)；而本发明中所涉及的黑胫病抗源则是受微效多基因控制的数量性状，来源于栽培烟草种－雪茄烟beinhart1000-1。
25.2、抗性水平不同，本发明涉及的黑胫病抗病性是水平抗性
26.现有技术涉及的黑胫病抗病性是垂直抗性，抗性虽强但长时间大面积推广应用
后，极易失去抗性或促使其他生理小种转变为优势小种，而导致具有含基因ph或wz失去对其他优势生理小种的黑胫病抗性；而本发明中所涉及的黑胫病抗病性则是水平抗性，其对黑胫病1号生理小种均具有抗性且抗性持久。
27.3、本发明涉及的黑胫病抗性基因不存在连锁累赘
28.现有技术的黑胫病抗性基因均与非栽培烟草(野生烟草种和黄花烟草种)基因组片段紧密连锁，导致连锁累赘，且这些连锁累赘通常都是烟叶生产中不利性状，故此，在将已授权专利中的黑胫病抗性基因转移到栽培烟草中时，也因存在无法打破的连锁累赘而使育成的烟草黑胫病抗性品种无法在生产中推广应用；
29.而本发明中所涉及的黑胫病抗性基因qbs1则来源于栽培烟草beinhart1000-1，因此，不存在影响其大面积推广应用的连锁累赘存在。
30.4、更精细的qtl定位结果
31.相较于文献报道的雪茄烟beinhart1000-1黑胫病抗性qtl定位结果，本发明提供的与烟草黑胫病1号生理小种抗性基因qbs1两侧紧密连锁标记间的遗传距离更小、定位结果更精确，因此，用作烟草黑胫病抗性选育的分子标记进行辅助选择的结果也更精准。
32.序列信息:
33.seq id no:1：是利用ssr标记tmc44177在待测烟草基因组dna中进行pcr扩增时，获得具有黑胫病1号生理小种抗性的核苷酸序列。
34.seq id no:2：是利用ssr标记tmc44177在待测烟草基因组dna中进行pcr扩增时，获得不具有黑胫病1号生理小种抗性的核苷酸序列。
35.seq id no:3：是利用ssr标记tmc61373在待测烟草基因组dna中进行pcr扩增时，获得具有黑胫病1号生理小种抗性的核苷酸序列。
36.seq id no:4：是利用ssr标记tmc61373在待测烟草基因组dna中进行pcr扩增时，获得不具有黑胫病1号生理小种抗性的核苷酸序列。
37.seq id no:5：是ssr标记tmc44177的上游引物核苷酸序列。
38.seq id no:6：是ssr标记tmc44177的下游引物核苷酸序列。
39.seq id no:7：是ssr标记tmc61373的上游引物核苷酸序列。
40.seq id no:8：是ssr标记tmc61373的下游引物核苷酸序列。
附图说明
41.图1是基于烟草重组自交系群体(rils_f
7:8
；红花大金元
×
beinhart1000-1)的黑胫病抗性qtl分析曲线图。
42.其中，qtl定位软件为：winqtlcart v2.5；参数设置：定位方法为cim：composite interval mapping qtl，迭代次数为1000(permutation times＝1000)，显著性为0.01(significance＝0.01)，步长为0.5cm(walk speed＝0.5cm)。上图中横坐标为烟草基因组中的染色体或连锁群编号；纵坐标为lod值。下图中横坐标为遗传距离(单位：厘摩cm)；纵坐标为lod值。图中的横向虚线是在0.01显著性阈值下的lod值＝3.7；lod曲线最高点为黑胫病1号生理小种抗性主效基因(qbs1_15)。
具体实施方式
43.下面实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照相关产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。
44.本发明所述的与烟草黑胫病1号生理小种抗性基因qbs1紧密连锁的共显性ssr标记的编号为tmc44177和tmc61373，其pcr扩增产物核苷酸序列分别为seq id no:1和seq id no:2、seq id no:3和seq id no:4所示。
45.下面以具体实施案例对本发明做进一步说明：
46.实施例1
47.采用数量性状连锁分析(qtl)法并结合单粒黑胫病菌谷创伤接种法，在烟草全基因组范围内筛选与烟草黑胫病1号生理小种抗性基因qbs1连锁的共显性ssr标记
48.一、实验材料
49.以综合性状优良但易感黑胫病1号生理小种的烤烟品种红花大金元为母本，以高抗黑胫病1号生理小种的雪茄烟品种beinhart1000-1为父本，经杂交、连续自交，获得341份株系的重组自交系(rils_f
7:8
)作为遗传作图群体。
50.二、亲本及rils_f
7:8
群体黑胫病1号生理小种抗性表型数据获得
51.采用单粒黑胫病菌谷创伤接种法，具体如下：
52.(a)烟苗的准备
53.取hd、beinhart1000-1、f1及341份rils_f
7:8
种子，按常规漂浮育苗方式育苗，50～60天后移栽至装有育苗基质的花盆中，1株/盆，8株/处理，4次重复/黑胫病1号生理小种，置温室煅苗7天，烟苗成活后，剪叶、整苗，待接种黑胫病菌。
54.(b)接种方法
55.采用单粒菌谷创伤根茎部接种法。烟草疫霉由本实验室分离鉴定，其中pn 68为1号生理小种，病菌活化2～3次后，在燕麦培养基(oa)平板上28℃恒温培养箱培养7～10天，待培养基表面长满黑胫病菌菌丝后，接种到燕麦固体培养基上28℃恒温培养箱培养14～18天，待菌丝长满燕麦粒后，掏出、分散成单粒，作为接种体。
56.将烟苗根茎部一侧的基质掏开，用一次性注射器针头创伤，将1粒长满菌丝的燕麦粒贴于烟苗根茎部的创伤口处，再用基质填平，然后浇灌少量的蒸馏水使基质表面完全湿润，小花盆置于盛自来水的托盘中维持湿度。
57.每批次接种黑胫病1号生理小种均以抗病亲本beinhart1000-1、感病品种红花大金元及其子一代(f1)同样处理作对照。
58.接种后的烟苗放置在28℃、相对湿度75％以上、12小时光照12小时黑暗的人工气候室培养。
59.(c)病情调查及数据处理
60.接种后3天观察发病情况，按国家标准gb/t 23222-2008烟草病虫害分级及调查方法分别在接种后第7、14和21天进行3次调查，统计病情指数(di：disease index)。
61.上述获得的341份rils_f
7:8
黑胫病1号生理小种抗性di值作为表型数据，用于下一步的qtl连锁分析。
62.三、ssr标记分析
63.烟草基因组dna提取：
64.采用常规ctab法或植物组织dna提取试剂盒均可，方法可参考已有的文献或试剂盒中的说明书。
65.pcr扩增及电泳检测：
66.pcr扩增体系是常规的体系可参照已发表的文献，其中，本发明所提供的标记退火温度均为60℃；pcr扩增程序信息可参照相关文献；电泳检测也是采用常规的方法，可参照已发表的相关文献。
67.利用本实验室分别基于烤烟红花大金元和雪茄烟beinhart1000-1基因组信息开发的约50000个ssr标记，对rils_f
7:8
群体的双亲(红花大金元和beinhart1000-1)和子一代(f1)进行多态性筛选。最终，筛选获得2001个多态性ssr标记。再利用筛选获得2001个多态ssr标记，对341份rils_f
7:8
样品进行基因型分析。
68.其次，利用遗传连锁作图软件joinmap 4.0对341份rils_f
7:8
样品的基因型数据进行连锁分析，绘制一张含有24条连锁群且均匀分布1974个ssr标记，覆盖烟草基因组长度为3213.138cm的高质量雪茄烟遗传连锁图谱，作为rils_f
7:8
群体的基因型值，用于下一步的qtl连锁分析。
69.四、雪茄烟beinhart1000-1抗黑胫病基因(qbs1)的全基因组qtl分析
70.利用qtl定位分析软件winqtlcart v2.5对rils_f
7:8
群体的基因型数据和表型数据，对抗黑胫病基因qbs1进行全基因组qtl扫描。
71.其中，相关参数设置为：定位方法选cim：composite interval mapping qtl，迭代次数为1000(permutation times＝1000)，显著性为0.01(significance＝0.01)，步长为0.5cm(walk speed＝0.5cm)。最后，在全基因组范围内的lod＝3.7条件下，位于第15号连锁群的6.50cm处定位获得烟草黑胫病1号生理小种抗性的1个主效qtl(暂命名为qbs1_15)。该主效qtl可解释约13.68％的表型变异率，且此时的lod值约为4.67。
72.详见图1和表1。
73.表1源于beinhart1000-1抗黑胫病qtl(qbs1_15)信息统计
[0074][0075]
注：bs_di1_14d表示烟草rils群体在接种烟草黑胫病0号生理小种14天的平均病情指数(di)。
[0076]
实施例2共显性连锁标记在rils_f
8:9
群体单株中的验证
[0077]
利用获得的与烟草黑胫病1号生理小种抗性基因qbs1两侧紧密连锁的共显性ssr标记tmc44177和tmc61373，对苗期的rils_f
8:9
群体(红花大金元
×
beinhart1000-1)单株进行基因型分析，获得rils_f
8:9
群体各单株的基因型数据。
[0078]
另一方面，采用单粒黑胫病菌谷创伤接种法对各株系进行黑胫病1号生理小种接种鉴定并获得各株系的抗性表型值。
[0079]
最后，分析341份rils_f
8:9
群体的基因型数据与黑胫病1号生理小种抗性表型值，
发现本发明公布的两个共显性ssr标记tmc44177和tmc61373的基因型值与表型值完全吻合，即，一致率达100％。
[0080]
具体的分析方法为：通过单粒黑胫病菌谷创伤接种法鉴定获得的各株系黑胫病1号生理小种di值低于或等于抗病亲本beinhart1000-1时，该株系的基因型中也是同时呈现如seq id no:1(276bp)和seq id no:3(216bp)所示序列即为抗黑胫病1号生理小种的纯合基因型r1r1；鉴定获得的各株系黑胫病1号生理小种di值等于或高于感病亲本红花大金元时，该株系的基因型中也是同时呈现如id no.2(306bp)和seq id no:4(222bp)所示序列即为感黑胫病1号生理小种的纯合基因型r1r1；而当鉴定获得的各株系黑胫病1号生理小种di值介于感病亲本红花大金元与抗病亲本beinhart1000-1之间，也即与子一代(f1)相近时，该株系的基因型中也是同时呈现如seq id no:1和seq id no:2所示序列，或含有seq id no:3和seq id no:4所示序列，或含有seq id no:1、seq id no:3和seq id no:4所示序列，或含有seq id no:3、seq id no:1和seq id no:2所示序列即为抗黑胫病1号生理小种的杂合基因型r1r1。
[0081]
以上结果表明，共显性标记tmc44177和tmc61373分别与源自烟草黑胫病1号生理小种抗性基因qbs1紧密连锁，且该两个标记位于目的基因/qtl(qbs1_15)两侧。
[0082]
利用上述两个共显性紧密连锁ssr标记，不仅可以精准、高效、便捷且低成本的实现烟草任何生育期的黑胫病1号生理小种抗性鉴定，而且也可清晰鉴别待测植株中的黑胫病1号生理小种抗性基因型状态，此既提高了具有黑胫病1号生理小种抗性烤烟新品种选育的科学性、可预测性，又加速了育种进程。