biological chemistry,278(48),47744-52.。
6.目前，在现有技术中，公开了具有kelch样结构域的蛋白质磷酸酶在植物中的生长和发育的作用，如文献，maselli gustavo a,slamovits claudio h,bianchi javier i,vilarrasa-blasi josep,-delgado ana i,mora-garc
í
a santiago.revisiting the evolutionary history and roles of protein phosphatases with kelch-like domains in plants.[j].plant physiology,2014,164(3):，其主要是基于系统发育、功能和遗传证据重新评估了bsl(brassinosteroid insensitive suppressor油菜素类固醇不敏感抑制剂)基因在拟南芥中的作用，特别强调了bsl1、bsl2和bsl3，进一步表明这三个基因在所有陆生植物中都高度保守；相比之下，bsu1型基因仅在十字花科中发现，并且具有异常发散的序列，这使它们在其他保守的家族中脱颖而出。
[0007]
虽然现有技术公开了一些蛋白磷酸酶及抑制剂的在植物生长、发育以及进化的作用，还未见烟草蛋白磷酸酶抑制因子的克隆和研究的相关报道，也未见用于调控烟草中钾含量的报道。


技术实现要素：

[0008]
为弥补上述领域存在的不足及空白，本发明为调控烟叶钾离子含量并克隆鉴定了一个烟草ntypi1基因，crispr/cas9编辑该基因发现，该基因在调控烟草钾离子含量方面发挥功能；并提供了一种可调控烟叶钾含量的ntypi1基因的应用。本发明研究结果对于解析烟草钾离子含量的分子调控具有重要的参考，也为通过基因表达调控培育钾含量提高的烟草提供新的思路。
[0009]
本发明请求保护的技术方案如下：
[0010]
一种可调控烟叶钾含量的ntypi1基因，其核苷酸序列为seq id no.1所示。
[0011]
一种可调控烟叶钾含量的蛋白，其特征在于，其氨基酸序列为seq id no.2所示；或根据所述的ntypi1基因编码为seq id no.2所示的氨基酸序列的蛋白。
[0012]
一种可调控烟叶钾含量的ntypi1基因的应用，其特征在于，使用所述的ntypi1基因或所述的蛋白在调控烟草钾离子含量中的应用。
[0013]
一种利用crispr/cas9技术敲除所述ntypi1基因编辑后的烟草，或通过过表达所述ntypi1基因编辑后的烟草。
[0014]
一种利用crispr/cas9技术编辑所述ntypi1基因并测量编辑后的烟草钾含量的应用，包括以下过程：
[0015]
(1)根据所述ntypi1基因的基因组序列设计靶位点为：
[0016]
sgrna:cgaagaagaagagcgtttca；
[0017]
(2)根据步骤(1)中的靶位点设计引物，得到靶位点引物，所述靶位点引物的序列为：
[0018]
p1：attgcgaagaagaagagcgtttca；
[0019]
p2：aaactgaaacgctcttcttcttcg；
[0020]
(3)根据步骤(1)中的所述靶位点，在靶位点两侧设计编辑材料的检测引物，得到检测引物，所述检测引物序列为：
[0021]
ntypi1-sdf：atgtgaatgcgtgtgggttctt；
[0022]
ntypi1-sdr：gcgatcctccgatttacagcaa；
[0023]
(4)制备dsdna：根据步骤(2)中的所述的靶位点引物通过退火形成互补dna oligo，得到dsdna；
[0024]
(5)酶切phse401载体得到酶切产物，将所述酶切产物与步骤(4)中得到的dsdna进行连接，得到连接产物；
[0025]
(6)测序验证：将步骤(5)中得到的连接产物转化为大肠杆菌，筛选阳性克隆并进行菌落pcr检测；经pcr检测验证正确的阳性克隆菌株培养扩增后进一步进行测序分析，得到所述crispr/cas9载体。
[0026]
(7)获得编辑材料：利用叶盘法将所述crispr/cas9载体转化野生型烟草，利用步骤(3)中的检测引物扩增编辑材料，通过测序获得发生突变材料，突变材料自交后获得纯合突变株系；
[0027]
(8)测定钾含量：将步骤(7)中的纯合突变体种植于温室，在烟草株开花期，取叶位叶片来检测烟叶钾含量。
[0028]
优选的，在第(4)步制备dsdna时，具体反应体系为：包括p1 20μl，p2 20μl，10
×
annealing buffer 5μl，灭菌双蒸水5μl；退火程序为：95℃，5min；90℃，1min；80℃，1min；70℃，1min；60℃，1min；50℃，1min；40℃，1min；30℃，1min；20℃，1min；10℃，1min。
[0029]
优选的，所述酶切产物制备过程包括：利用bsai酶对phse401载体进行酶切，酶切体系包括：质粒5μl，10
×
buffer 5μl，bsa i 2μl，灭菌双蒸水38μl；在37℃，酶切1h；酶切后对酶切产物进行电泳检测分析，11520bp条带即为所述酶切产物。
[0030]
优选的，所述连接产物制备过程包括：利用t4dna连接酶将所述酶切产物与步骤(4)所制备dsdna进行连接；连接体系包括：所述酶切产物3μl，所述dsdna产物10μl，t4 dna buffer 2μl，t4 dna连接酶1μl，灭菌双蒸水4μl；在16℃，过夜连接反应，最终得到所述连接产物。
[0031]
优选的，在所述第(6)测序验证步骤中，所述菌落pcr检测时，所用引物设计序列为:
[0032]
u6-26p-f：tgtcccaggattagaatgattaggc；
[0033]
u6-26p-r：aaaccgattcatcgcaaccaattc。
[0034]
优选的，在所述步骤(7)获得编辑材料中，所述叶盘法包括：将得到的所述crispr/cas9载体先通过农杆菌转化，得到含有目标载体的农杆菌克隆；再进行烟草转化，将得到的所述含有目标载体的农杆菌克隆培育得到含目标载体的农杆菌lb液体培养基悬浮菌液，加入切片后的无菌野生型烟草叶进行培养后，将培养后的所述无菌野生烟草叶片转入分化培养基中进行培养；待芽长至3～5cm时，切取芽，将切取的芽诱导生根，生根后移植于灭菌的营养土中，得到多株t0代转基因烟草幼苗，即所述crispr/cas9载体转化后的野生型烟草。
[0035]
优选的，在所述第(8)测定钾含量中，是指利用yc/t 173-2003的方法检测烟叶钾含量。
[0036]
本发明通过系统研究，首次证明了烟草ntypi1基因在调控烟叶钾含量中的功能。利用crispr/cas9编辑材料后的烟草相比含有seq id no.1序列的烟草叶片钾含量显著降低，降低17％左右。通过本发明研究，表明ntypi1是烟草钾离子含量的正调控因子，为通过分子手段提高烟叶钾含量提供了新的基因资源。
附图说明
[0037]
图1为u6-26p-f/u6-26p-r检测phse401-ypi1载体电泳图。图中，泳道从左到右分别是：(1)dl2000 dna marker(takara)，(2)以ddh2o为模板的pcr产物，(3-4)以质粒dna为模板的pcr产物。dl2000 dna marker(takara)条带从上到下分别是2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp；扩增产物大小400bp左右。
[0038]
图2为ntypi1-sdf/sdr检测编辑材料电泳图。图中，泳道从左到右分别是：(1)是dl2000dna marker(takara)、(2-3)是以提取dna为模板的pcr产物。dl2000 dna marker(takara)条带从上到下分别是2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp；扩增大小为631bp。
[0039]
图3为crispr/cas9编辑材料突变信息。
[0040]
图4为crispr/cas9编辑材料测序峰图。
[0041]
图5为crispr/cas9编辑材料与对照烟叶钾离子含量，ntypi1-cp为编辑材料，ck为对照。
具体实施方式
[0042]
下面结合实施例进一步描述本发明，需要理解的是，下述实施例仅作为对本发明的解释和说明，不以任何方式限制本发明的范围。
[0043]
若未特别说明，以下实施例中使用的试剂均为本领域常规试剂，可商购获得或按照本领域常规方法配制而得，规格为实验室纯级即可；使用的实验方法和实验条件均为本领域常规的实验方法和实验条件，可参考相关实验手册(例如《分子克隆实验指南》)、公知文献或厂商说明书。除非另有定义，本文使用的所有科学技术用语的含义与本发明所属领域普通技术人员通常理解的含义相同。
[0044]
本发明根据烟草基因组测序数据库信息，分离到ntypi1基因，其核苷酸序列如seq id no.1所示，序列长度为378bp，编码的氨基酸序列如序列seq id no.2所示，长度为126氨基酸。
[0045]
本发明利用crispr/cas9技术敲除ntypi1基因后，可显著降低烟叶钾离子含量。
[0046]
本发明的烟草ntypi1基因是烟草钾离子含量正调控因子，通过基因工程技术过表达该基因可达到提高烟叶钾离子含量的效果，从而在提高烟叶钾离子含量中发挥重要作用。
[0047]
因此，本发明的第一个目的是提供烟草ntypi1基因，其核苷酸序列如seq id no.1所示。
[0048]
本发明的第二个目的是提供所述的烟草ntypi1基因编码的蛋白，其氨基酸序列如seq id no.2所示。
[0049]
本发明的第三个目的是提供了所述的烟草ntypi1基因在调控烟叶钾含量方面的功能，即敲除ntypi1基因可以降低烟叶钾含量。
[0050]
本发明的第四个目的是提供了通过分子调控手段，利用所述的烟草ntypi1基因提高或降低烟草钾含量方面的应用。
[0051]
实施例1 ntypi1基因的克隆
[0052]
1.1实验材料
[0053]
1.1.1供试菌株
[0054]
大肠杆菌(escherichia coli)dh5α，本实验室亦有保存，申请人声明可自申请日起二十年内向公众发放用于验证实验。
[0055]
1.1.2供试烟草品种
[0056]
烟草：云烟87，本实验室保存，申请人声明可自申请日起二十年内向公众发放用于验证实验。
[0057]
1.1.3供试试剂
[0058]
phusion高保真扩增酶反应体系，5
×
phusion hf反应缓冲液、dntp、tris-hcl(ph 8)、edta、20％sds、β巯基乙醇、无水乙醇、异丙醇、dna提取液、10
×
tae，以上试剂均采购自生工生物科技(上海)有限公司(http://www.sangon.com)。high-fidelity dna polymerase采自广州胜创生物科技有限公司。-blunt
ⅱ‑
topo购自invitrogen公司。
[0059]
lb液体培养基：含有卡那霉素100mg/l和利福平25mg/l。以上培养基都在121℃，20min条件下湿热灭菌。
[0060]
1.1.5实验仪器
[0061]
致微(厦门)仪器有限公司gi-54ds自动压力蒸汽灭菌器。上海精宏实验设备有限公司dhg-9240a电热恒温鼓风干燥箱，dnp-90-52电热恒温培养箱。台苏州安泰空气技术有限公司sw-cj-2fd超净工作台。北京赛多利斯科学仪器有限公司sqp电子分析天平。backman optima l-xp制备型超速离心机。北京鼎昊源科技有限公司hr220 minismart迷你离心机。eppendorf centrifuge-54188冷冻离心机。mx-s可调式和固定式混匀仪。卡尤迪生物科技h203-100c加热制冷型金属浴。bio-rad thermal cycler pcr仪。milli-q超纯水系统millipore。上海医用分析仪器厂tgl-16g制冰机。北京大龙兴创实验仪器有限公司，bandelin sonopuls hd 2070超声破碎仪。北京六一仪器厂dyy-12电泳仪。alliance 4.7chroma uvitec凝胶成像仪。上海知信zx-s22双孔不锈钢恒温水浴锅。pro扩增仪。
[0062]
1.2实验方法
[0063]
(1)根据烟草行业基因组测序数据库(内部数据)、茄科数据库(https://solgenomics.net/)及拟南芥同源基因，获得烟草ntypi1基因序列cds序列信息，设计克隆基因引物，如下所示：
[0064]
seq id no.名称序列(5
’→3’
)3ypi1-fatggcgagaagcggaagacaat4ypi1-rtcaattatcttcgcaattgctggta
[0065]
(2)提取烟草叶片组织rna，反转录得到第一链cdna；
[0066]
(3)以反转录得到的第一链cdna作为模板，进行pcr扩增，选用phusion高保真扩增酶反应体系，体系总体积50μl，包括：200ng cdna，5
×
phusion hf反应缓冲液10μl，10mm dntp 1μl，2u的high-fidelity dna polymerase，10μm的正反向引物各1μl，补水至50μl。pcr反应在pro扩增仪上进行，反应程序为：98℃，30秒；98℃，7秒，60℃，30秒，72℃，30秒，35个循环；72℃延伸7分钟；回收和纯化pcr产物；该步骤中所用正反向引物为ypi1-f/ypi1-r。
4.7chroma uvitec凝胶成像仪。上海知信zx-s22双孔不锈钢恒温水浴锅。
[0080]
2.2实验方法
[0081]
2.2.1构建crispr/cas9载体
[0082]
(1)根据ntypi1基因组序列设计靶位点，为：
[0083]
sgrna:cgaagaagaagagcgtttca；
[0084]
具体的，根据ntypi1基因序列，利用在线工具zifittargeter version4.2纠选择合适的靶位点，筛选要求为：
①
靶位点主要包括20个碱基，并且这20个碱基后面是ngg(n为任意碱基)3个碱基的pam区(protospacer adjacent motif，pam)；
②
靶位点尽量选择在基因编码区的前端。
[0085]
(2)根据步骤(1)中的靶位点设计引物，得到靶位点引物，所述靶位点引物为：
[0086]
seq id no.名称序列(5
’→3’
)5p1attgcgaagaagaagagcgtttca6p2aaactgaaacgctcttcttcttcg
[0087]
(3)根据步骤(1)中的靶位点，在靶位点两侧设计编辑材料的检测引物，得到检测引物，所述检测引物为：
[0088]
seq id no.名称序列(5
’→3’
)7ntypi1-sdfatgtgaatgcgtgtgggttctt8ntypi1-sdrgcgatcctccgatttacagcaa
[0089]
扩增长度为631bp。
[0090]
(4)制备dsdna：根据步骤(2)中的得到的靶位点引物通过退火形成互补dna oligo，得到dsdna；具体反应体系为：反应体系50μl，包括p1 20μl，p2 20μl，10
×
annealing buffer5μl，灭菌双蒸水5μl。退火程序为：95℃，5min；90℃，1min；80℃，1min；70℃，1min；60℃，1min；50℃，1min；40℃，1min；30℃，1min；20℃，1min；10℃，1min。
[0091]
(5)酶切phse401载体得到酶切产物，将所述酶切产物与步骤(4)中得到的dsdna进行连接，得到连接产物；
[0092]
具体步骤为：利用bsai酶对phse401载体进行酶切，酶切体系50μl，包括：质粒5μl，10
×
buffer 5μl，bsa i 2μl，灭菌双蒸水38μl，37℃酶切1h；
[0093]
酶切后对酶切产物进行电泳检测分析，可见1200bp和11520bp两个条带，回收11520bp的酶切产物备用；
[0094]
利用t4dna连接酶将所回收的大片段酶切产物与步骤(4)所制备dsdna进行连接，连接体系20μl：所回收载体酶切产物3μl，退火所形成dsdna产物10μl，t4 dna buffer 2μl，t4 dna 连接酶1μl，灭菌双蒸水4μl，16℃过夜连接，得到连接产物；
[0095]
(6)测序验证：将步骤(5)中得到的连接产物转化为大肠杆菌，筛选阳性克隆(phse401载体抗性为卡那霉素)并进行菌落pcr检测；所述菌落pcr检测时，所用引物设计为:
[0096]
seq id no.名称序列(5
’→3’
)9u6-26p-ftgtcccaggattagaatgattaggc10u6-26p-raaaccgattcatcgcaaccaattc
[0097]
pcr体系如下：
[0098][0099]
pcr程序如下：
[0100][0101]
其中，退火温度根据引物自身温度调整。然后将pcr产物取出，用2％琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。
[0102]
经pcr检测验证正确的阳性克隆菌株培养扩增后进一步进行测序分析，如图1所示，u6-26p-f/u6-26p-r检测phse401-ypi1载体电泳图，得到phse401-ypi1载体，扩增产物大小400bp左右；测序时所用引物为上述u6-26p-f。
[0103]
利用叶盘法将所述crispr/cas9载体转化野生型烟草，利用步骤(3)中的检测引物扩增编辑材料，通过测序获得发生突变材料，突变材料自交后获得纯合突变株系。
[0104]
为了便于理解本发明，这里对叶盘法进行说明。叶盘法是一种简单易行的植物细胞转化、选择与再生的方法。植物细胞利用ti转化常用的方法。具体做法是:先将实验材料(如烟草)的叶子表面进行消毒，再用消毒过的不锈钢打孔器从叶子上取下圆形小片，即叶盘。为了对叶盘进行接种处理，需将它放在土壤农癌杆菌培养液中浸泡4～5min,然后用滤纸吸干，放在看护培养基上进行培养，注意需将叶子背面接触培养基。所谓看护培养基，是特定的固体培养基上均匀分布一层胡萝卜细胞或其他细胞的悬浮液，然后覆盖一层滤纸即成。叶盘在看护培养基上培养两天后，转移到含有适当抗生素的选择培养基上进行培养。经过数周后，叶盘周围会长出愈伤组织并分化出幼苗。对这些幼苗的进一步检测可以确定它们是否含外源基因以及外源基因的表达情况。叶盘法实际上是对共培养法加以改进后而创立的一种转化方法。用农杆菌感染叶片外植体并短期共培养。在培养过程中，农杆菌的vir基因被诱导，它的活化可以启动t-dna向植物细胞的转移。共培养后，也要进行转化的外植体的筛选、愈伤组织的培养、诱导分化等步骤，以得到再生植株。叶盘法由于不需进行原生质体操作等，方法简单，获得转化植株也更快，是用植物外植体为材料进行转基因的一个良好途径。
[0105]
2.2.2农杆菌转化
[0106]
将农杆菌感受态细胞c58c1溶解后加入2.2.1构建crispr/cas9载体步骤(6)中得到的载体phse401-ypi1进行农杆菌转化，得到含有目标载体的农杆菌克隆。具体为：从-80℃冰箱中取出农杆菌感受态细胞(c58c1)，放置冰上溶解后加入载体phse401-ypi1 4μl；液氮速冻1分钟，转入37℃水浴5分钟，再冰浴2分钟，向混合物中加入1ml lb液体培养基，28℃、220rpm培养3～4小时；培养物涂布于含有卡那霉素100mg/l和利福平25mg/l的lb固体培养基上，28℃倒置培养2～3天，可见含有目标载体的农杆菌克隆。
[0107]
2.2.3烟草转化
[0108]
将得到的含有目标载体的农杆菌克隆经划线接种后，在含有卡那霉素和利福平的lb培养基中进行扩繁，得到含目标载体的农杆菌lb液体培养基悬浮菌液；具体为：挑取含有目标载体的农杆菌克隆，在含有卡那霉素和利福平的lb平板上划线，28℃培养2-3天；刮取划线菌斑接菌于含有卡那霉素和利福平的lb培养基中，28℃，220rpm震荡培养，菌液浓度达到od＝0.5～0.8时进行侵染。
[0109]
取野生型烟草叶片利用乙醇和hgcl2处理后用无菌水进行冲洗，并吸去烟草叶片表面液体，得到无菌野生型烟草叶片；具体为：将野生型烟草叶片置于500ml广口瓶中，加入适量75％乙醇，漂洗1min；弃乙醇，加入0.1％的hgcl2溶液，置摇床上室温振荡15～30分钟；弃溶液，用无菌水冲洗6遍。
[0110]
将得到的无菌野生型烟草叶片切成小片后，放入得到的含目标载体的农杆菌lb液体培养基悬浮菌液中进行培养后，将烟草叶片转入分化培养基中进行培养，直至烟草叶片切口处逐渐形成愈伤组织并分化出芽；具体为：将得到的无菌野生型烟草叶片取出，用无菌吸水纸洗去表面液体，取无菌叶片用剪刀切成1cm
×
1cm的小片，将切成小片的烟草叶片放入含目标载体的农杆菌lb液体培养基悬浮菌液中，静置15～20min；取出烟草叶片，用无菌滤纸吸去多余菌液，于含有6-ba (0.02mg/l)、naa (2mg/l)的ms培养基中25℃暗培养两天；将烟草叶片转入分化培养基中，切口接触培养基，分化培养基为含有6-ba (0.5mg/l)、naa(0.1mg/l)、潮霉素(20mg/l)、头孢霉素(500mg/l)的ms培养基，每2～3周继代一次，切口处逐渐形成愈伤组织，最后分化出芽。待芽长至3～5cm时，切取芽，将切取的芽诱导生根，生根后移植于灭菌的营养土中，得到多株t0代转基因烟草幼苗；具体为：将长至3～5cm的芽切下，转入ms培养基诱导生根，生根后的转基因植株由生根培养基中取出，用自来水洗净培养基，移植于灭菌的营养土中。
[0111]
2.2.4测序筛选编辑材料
[0112]
待转基因植株在营养土中的t0代转基因烟草幼苗生长1周后，选取叶片提取dna，如图2所示，ntypi1-sdf/sdr检测编辑材料电泳图，利用步骤(3)中的检测引物ntypi1-sdf/sdr扩增后得扩增产物，扩增大小为631bp，扩增产物纯化后利用正向引物测序，经对测序结果进行分析，获得一株ntypi1基因在编辑位点缺失1个碱基t的编辑材料；种植该编辑材料得t1代植株，通过测序筛选纯合突变单株并收种，获得具有ntypi1纯合突变的t2代烟草种子。
[0113]
具体为：待t0代转基因苗生长1周左右，选取20株烟苗取叶片并利用dneasy plant mini kit(qiagen)提取dna，利用2.2.1构建crispr/cas9载体中的步骤(3)中设计的引物ntypi1-sdf/sdr进行扩增，扩增产物纯化后利用正向引物测序。如图3所示，为crispr/cas9
编辑材料突变信息，对测序结果分析，获得一株ntypi1基因缺失1个碱基t的编辑材料。种植该编辑材料t1代植株，通过测序筛选纯合突变单株(如图4所示，为crispr/cas9编辑材料测序峰图)并收种获得t2代种子。
[0114]
对得到的具有ntypi1纯合突变的t2代烟草种子在温室进行种植，得到t2代烟草株系，利用yc/t 173-2003的方法检测植株烟叶钾含量；具体为：在温室种植得到的突变体株系与野生型烟草植株对照，在烟株开花期，取9-11叶位叶片(从下部计算)，杀青烘干，利用yc/t173-2003的方法检测烟叶钾含量。yc/t 173-2003是指烟草及烟草制品中钾的测定，也称火焰光度法。
[0115]
对得到的具有ntypi1纯合突变的t2代烟草种子在温室进行种植，得到t2代烟草株系，利用yc/t 173-2003的方法检测植株烟叶钾含量；具体为：在温室种植得到的突变体株系与野生型烟草植株对照，在烟株开花期，取9-11叶位叶片(从下部计算)，杀青烘干，利用yc/t173-2003的方法检测烟叶钾含量。编辑后的材料的t2代烟草相比含有seq id no.1序列的烟草叶片钾含量显著降低。
[0116]
如图5所示，ntypi1-cp为编辑材料，ck为对照组；编辑后的材料的t2代烟草ntypi1-cp与含有seq id no.1序列的ck组相比，烟草叶片中的钾含量显著降低，降低17％左右。
[0117]
除上述具体实施过程外，这里需要注意的是，本发明应当还包括一种利用crispr/cas9技术敲除所述ntypi1基因编辑后的烟草，其烟叶钾含量显著降低；当然还可以获得通过过表达所述ntypi1基因编辑后的烟草。
[0118]
以上描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。