1.本发明涉及一种糖脂类生物表面活性剂的分离纯化新方法，尤其涉及一种亲水型甘露糖赤藓糖醇脂(mannosylerythritol lipid，mels)的纯化方法。


背景技术：

2.表面活性剂是一种含有双亲性结构的化合物，能在低浓度时显著降低液体的表面张力，已被广泛应用于石油工业、环境工程、食品工业等许多领域，被誉为“工业味精”。然而，目前大多数的表面活性剂是以石油为原料通过化学方法合成的，在其生产及使用过程中，会带来一系列的环境问题。生物表面活性剂是一类主要由微生物发酵生产的具有表面活性的两亲性化合物，与化学表面活性剂相比，具有更高的结构多样性、发泡性、环境友好性及独特的生物活性。甘露糖赤藓糖醇脂(mannosylerythritol lipids,mels)是目前研究较为广泛的糖脂类生物表面活性剂之一，具有良好的表/界面活性、乳化性以及其他特殊生物活性，在化妆品、制药、日用化学品等许多方面具有良好的应用前景。常见mels的结构根据乙酰基的数量与位置的不同分为mel-a、b、c、d。发酵生产的天然mels大多数为mel-a，但mel-a的水溶性较差，限制了其广泛的应用。随着mels应用市场的不断扩大，更加亲水的mels制备显得尤为重要。
3.mels的纯化方法主要为柱层析技术，但柱层析分离纯化技术往往成本高，造成产物与有机溶剂的大量浪费，无法满足mels工业化生产的需求。


技术实现要素：

4.本发明针对现有技术的不足，提供一种亲水型甘露糖赤藓糖醇脂mels的高效纯化方法。
5.本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
6.一种亲水型甘露糖赤藓糖醇脂的纯化方法，包括以下步骤：
7.(1)将从pseudozyma aphidis的发酵液中获得的甘露糖赤藓糖醇脂溶解在甲醇中，所述溶质甘露糖赤藓糖醇脂的含量在甲醇的溶解度范围内即可，加入浓硫酸至硫酸的体积分数为0.167-1.33％，于40-60℃下反应30-120min，获得亲水型甘露糖赤藓糖醇脂的酸性甲醇溶液。
8.(2)调节步骤(1)获得的酸性甲醇溶液的ph值至6-8，离心，弃去上层液体，获得亲水型甘露糖赤藓糖醇脂的浓缩液。
9.(3)在步骤(2)所得的亲水型甘露糖赤藓糖醇脂的浓缩液中加入甲醇，调节甘露糖赤藓糖醇脂浓度至40-200g/l，然后加入正己烷，所述甘露糖赤藓糖醇脂的甲醇溶液与正己烷的体积比为1:1-3，充分混合均匀后离心，收集甲醇相(下相)，利用正己烷对甲醇相进行重复洗涤，最终获得纯化后的甘露糖赤藓糖醇脂甲醇溶液。
10.(4)将步骤(3)中所得的纯化后的甘露糖赤藓糖醇脂甲醇溶液经40-50℃减压干燥后，获得亲水型甘露糖赤藓糖醇脂纯品。
11.进一步地，所述步骤(1)中的甘露糖赤藓糖醇脂为发酵液在发酵过程中产生的沉淀，或者为发酵液经过简单分离后的得到的粗品。
12.进一步地，所述步骤(2)中调节ph的方式可以通过去离子水洗涤，酸性甲醇溶液与去离子水的体积比优选为1：1-3；也可以加入caco3等固体进行调节。
13.进一步地，所述步骤(3)中，甲醇相中亲水型甘露糖赤藓糖醇脂的浓度优选为160g/l。
14.进一步地，所述步骤(3)中，所述甘露糖赤藓糖醇脂的甲醇溶液与正己烷的体积比优选为1:3。
15.本发明的有益效果是：
16.1、本发明基于酸性条件下mels中的乙酰基(-ac)易丢失，从而生成更加亲水的mels，此外，在浓硫酸催化下，mels中的主要杂质游离脂肪酸易与甲醇生成脂肪酸甲酯；然后基于该产物和杂质间的极性差异，开发了系列的新萃取体系，去除脂肪酸和油脂等杂质，实现亲水型mels的制备和高效纯化。
17.2、本发明从发酵过程获得的mels粗品出发，借助化学反应实现亲水型mels的制备，并修饰粗产品中最主要的杂质(游离脂肪酸)，然后通过简单的萃取操作，实现mels的纯化，避免使用传统的柱层析分离，并解决现有分离工艺中所获得产物浓度低等问题，适合亲水型mels的大量制备。实现产物的高效快速分离纯化，也为mels常规结构的纯化提供了新方案，有助于推进mels的工业化生产与应用。
附图说明
18.图1为亲水型mels的制备及纯化方法的流程示意图。
具体实施方式
19.甘露糖赤藓糖醇脂(mannosylerythritol lipids,mels)是一类主要由酵母菌(如pseudozyma aphidis)以亲水性(葡萄糖)和疏水性碳源(大豆油、橄榄油)为原料生产的糖脂类生物表面活性剂。微生物发酵过程中获得的产物大多为以mel-a为主，其他结构为辅的混合物，杂质主要包括未消耗完的植物油和中间产物游离脂肪酸，发酵获得的mels主要结构式如下图所示：
[0020][0021]
(mel-a:r1＝r2＝ac；mel-b:r1＝ac,r2＝h；mel-c:r1＝h；mel-d:r1＝r2＝h,r2＝ac)
[0022]
本发明中的mels粗品可以是发酵液；也可以是发酵过程中析出的半固态膏体，也可以是经过简单萃取分离后的萃取液或其浓缩物。本发明通过酸促化学反应，实现了亲水型mels的制备，同时在甲醇溶液中使游离脂肪酸反应为更加疏水的脂肪酸甲酯，显著地增
加了亲水型mels与杂质间的极性差异，并开发了相应的新型萃取体系，有效地实现了杂质的去除，并获得了高浓度的产物，有利于亲水型mels的大量制备。
[0023]
下面结合附图和实施例对本发明予以进一步详细说明。
[0024]
实施例1
[0025]
取2.5g膏状mels粗产物，溶解于30ml甲醇中，加入50-400μl浓硫酸至硫酸的体积分数为0.167-1.33％，将上述混合液在40-60℃下进行反应30-120min，通过tlc观察产物及杂质的结构变化。所述浓硫酸的作用为在甲酯化中作为催化剂，在mels结构变化中作为h
+
提供者，酸的加入量主要会影响反应时间。
[0026]
该反应的速度取决于温度和酸的加入量。由下表1所示，游离脂肪酸甲酯化反应较快，在浓硫酸作为催化剂的条件下可以在10-30min内完成反应，转化率接近100％。但通过该反应获得亲水型mels所需的时间较长。随着酸加入量的增加，所需的时间在逐渐减少，为120-500min。但同时，但随着反应时间的延长，mels会发生降解，导致产物损失(》20％)。
[0027]
表1：浓硫酸浓度与甲酯化和亲水型mels制备时间的关系表
[0028][0029]
实施例2
[0030]
取2.5g膏状mels粗产物，溶解于30ml甲醇中，加入50μl(0.167％)浓硫酸至硫酸的体积分数为0.167％，上述混合液在50℃下反应30min。反应后在甲醇中加入2g的caco3，调节ph至6-7，过滤除去固体。往所得中性溶液中加入甲醇，或者通过蒸发进行浓缩，调节mels的浓度达到40-300g/l。
[0031]
将甘露糖赤藓糖醇脂的甲醇溶液分为三份分别加入不同比例的正己烷，所述浓度调节后mels甲醇溶液与正己烷的体积比分别为1:1、1:2、1:3。
[0032]
在旋混仪上充分震荡混合，然后在12000rpm下离心5min，然后将上层正己烷相弃去。然后用正己烷重复上述萃取过程3次，收集下层(甲醇相)，重复洗涤，获得高浓度的mels甲醇溶液。将纯化后mels甲醇相收集起来，在40-50℃下进行减压蒸馏和干燥，即可获得mels纯品。
[0033]
结果表明：当正己烷与甘露糖赤藓糖醇脂的甲醇溶液的体积比大于2:1，两种有机溶剂就能够较好地分层，可实现mels的回收。此外，甲醇中的mels浓度应《200g/l，否则会影响分层效果从而导致mels的纯度与回收率下降。因此，综合分离纯化效果与有机溶剂的使用量，分离过程中，mels在甲醇中的较优浓度为160g/l，正己烷与甲醇相的体积比为3:1。该条件下，获得的mels其纯度接近100％，mels的回收率为76.8％。
[0034]
实施例3
[0035]
取2.5g膏状mels粗产物，溶解于30ml甲醇，加入400μl浓硫酸至硫酸的体积分数为1.33％，混合液在50℃下反应120min。反应结束后在甲醇相中加入三倍体积的纯水，摇混均匀后，在8000rpm离心5min，将上层液相去除，收集下层的亲水型mels中性沉淀。本发明方法中ph调节方法为调整mels溶质，使mels在其中溶解度下降并能够使h
+
转移至液体中一同除去。
[0036]
往所得沉淀中加入甲醇稀释至不同浓度(40-300g/l)。在浓度调节后mels甲醇溶液中加入正己烷进行萃取，所述甘露糖赤藓糖醇脂的甲醇溶液与正己烷的体积比为1:1-3，，在旋混仪上充分震荡混合，然后在12000rpm下离心5min，将上层正己烷相弃去。上述正己烷洗涤过程重复三次，将杂质几乎完全去除。将纯化后高浓度mels甲醇相收集起来，在40-50℃下进行减压蒸馏和干燥，即可获得mels纯品。
[0037]
结果表明：通过水洗调节ph，对后续的分离纯化没有影响。较优的条件也为：甲醇中mels的浓度为160g/l，正己烷与甲醇相的体积比为3:1。此时，获得是mels的纯度接近100％，回收率为46.63％。
[0038]
实施例4
[0039]
取2.5g膏状mels粗产品，溶解于30ml甲醇，加入50μl浓硫酸至硫酸的体积分数为0.167％，混合液在50℃下反应30min。反应结束后往甲醇相中加入三倍体积的纯水，在8000rpm下离心5min。将上层液相弃去，收集下层的mels沉淀。往沉淀中加入甲醇溶解mels，使mels的浓度为160g/l。然后往甲醇相中加入3倍体积的正己烷，在旋混仪上充分震荡混合，然后在12000rpm下离心5min，然后将上层正己烷相弃去。上述正己烷洗涤操作共进行三次，将杂质几乎完全除去。将纯化后高浓度mels甲醇相收集起来，在40-50℃下进行减压蒸馏和干燥，即可获得mels纯品。结果表明：整个分离过程中，mels的总回收率为66.37％，mels产品的纯度可达100％，远优于传统的分离工艺。
[0040]
以上所述，仅为本发明专利的较佳示例而已，并非用于限定本发明专利的保护范围。除上述实施例外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变化形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。