一种葡萄糖醛酸水解酶及其突变体在制备齐墩果酸-β-d-吡喃葡萄糖基酯中的应用
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种葡萄糖醛酸水解酶及其突变体在生产齐墩果酸、齐墩果酸-β-d-吡喃葡萄糖基酯、甘草次酸、甘草次酸甲酯、单葡萄糖醛酸甘草次酸和单葡萄糖醛酸甘草次酸甲酯中的应用。
背景技术：
2.三萜皂苷类成分是许多中药的主要药效活性物质，主要可分为四环三萜和五环三萜。齐墩果酸β-d-吡喃葡萄糖基酯属于一种五环三萜类化合物，为齐墩果酸c-28位羧基与葡萄糖c-1位羟基脱水缩合成的糖基酯类化合物。其在药用植物中含量十分稀少，直接从植物中提取分离困难，尚无合适的制备方法，限制了其药理研究和应用开发。此外，齐墩果酸具有较强的抗菌、抗糖尿病、抗氧化、抗肿瘤和抗动脉粥样硬化等药理活性。近年来，由于齐墩果酸的渗透性和溶解性较低，又无法从天然植物中高效提取，导致纯化成本较高，针对其剂型开发较为困难。因此，设计合适的齐墩果酸制备方式对其药用剂型开发和工业应用都有重要的指导意义。随着酶工程和生物转化等现代生物技术的不断发展，为高效制备特定产物提供了强有力的工具。通过调研，竹节参皂苷iva是结构母核为齐墩果酸，在齐墩果酸的c-3位和c-28位分别通过糖苷键结合一份子葡萄糖醛酸和一份子葡萄糖，可作为转化生成齐墩果酸β-d-吡喃葡萄糖基酯的候选底物。金盏花苷e是由齐墩果酸c-3位羟基与一分子葡萄糖醛酸通过糖苷键连接而成，可作为转化生成齐墩果酸的前体底物。因此，可以利用这些前体物质或含有前体物质的植物提取物，通过生物转化的方式，高效获得齐墩果酸和齐墩果酸β-d-吡喃葡萄糖基酯等目标产物。
3.本发明公开了一种葡萄糖醛酸水解酶的应用。通过对葡萄糖醛酸水解酶进行分子克隆、重组蛋白表达及酶活性检测。通过底物筛选，发现该水解酶具有高效转化金盏花苷e生成齐墩果酸、转化竹节参皂苷iva生成齐墩果酸β-d-吡喃葡萄糖基酯作用；同时还具有转化甘草酸生成单葡萄糖醛酸甘草次酸或甘草次酸、水解甘草酸甲酯生成单葡萄糖醛酸甘草次酸甲酯或甘草次酸甲酯等作用。本发明扩大了葡萄糖醛酸水解酶的应用，提出了制备上述特性产物的高效生物转化方法。
技术实现要素：
4.本发明目的在于提供葡萄糖醛酸水解酶及其突变体在催化水解含有末端葡萄糖醛酸糖苷结构的糖苷类化合物得到对应的苷元化合物或对应的脱糖基化合物中的应用。
5.本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
6.具有如seq no：2所示氨基酸序列的葡萄糖醛酸水解酶或所述葡萄糖醛酸水解酶的突变体在催化水解含有末端葡萄糖醛酸糖苷结构的糖苷类化合物得到对应的苷元化合物或对应的脱糖基化合物中的应用。
7.作为一种优选技术方案：所述的含有末端葡萄糖醛酸糖苷结构的糖苷类化合物金
盏花苷e、竹节参皂苷iva、甘草酸、甘草酸甲酯中的任意一种，或者含有所述化合物的药材提取物；所述的转化得到的对应的苷元化合物或对应的脱糖基化合物为齐墩果酸、齐墩果酸-β-d-吡喃葡萄糖基酯、甘草次酸、甘草次酸甲酯、单葡萄糖醛酸甘草次酸或单葡萄糖醛酸甘草次酸甲酯。
8.进一步优选的：所述催化水解含有末端葡萄糖醛酸糖苷结构的糖苷类化合物得到对应的苷元化合物或对应的脱糖基化合物的反应为(1)～(4)中的任意一种：
9.(1)所述的葡萄糖醛酸水解酶或所述葡萄糖醛酸水解酶的突变体在ph缓冲液中催化水解金盏花苷e或含有金盏花苷e的提取物得到齐墩果酸；
10.(2)所述的葡萄糖醛酸水解酶或所述葡萄糖醛酸水解酶的突变体在ph缓冲液中催化水解竹节参皂苷iva或含有竹节参皂苷iva的提取物得到齐墩果酸-β-d-吡喃葡萄糖基酯；
11.(3)所述的葡萄糖醛酸水解酶或所述葡萄糖醛酸水解酶的突变体在ph缓冲液中催化水解甘草酸、甘草酸单铵盐或者含有甘草酸的甘草提取物得到单葡萄糖醛酸甘草次酸或甘草次酸；
12.(4)所述的葡萄糖醛酸水解酶或所述葡萄糖醛酸水解酶的突变体在ph缓冲液中催化水解甘草酸甲酯或者含有甘草酸甲酯的甘草提取物得到单葡萄糖醛酸甘草次酸甲酯或甘草次酸甲酯。
13.进一步优选的：所述的含有金盏花苷e的提取物为竹节参总皂苷提取物、楤木总皂苷提取物、龙牙楤木提取物或太白楤木总皂苷提取物；
14.所述的含有竹节参皂苷iva的提取物为竹节参总皂苷提取物、楤木总皂苷提取物、龙牙楤木提取物或太白楤木总皂苷提取物。
15.进一步优选的：所述的ph缓冲液为磷酸盐缓冲液、柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液、tris-hcl缓冲液中的至少一种，其ph值在4.0-10.0之间；所述催化水解的反应温度为4-65℃。
16.一种催化水解含有末端葡萄糖醛酸糖苷结构的糖苷类化合物得到对应的苷元化合物或对应的脱糖基化合物的方法，其采用具有如seq no：2所示氨基酸序列的葡萄糖醛酸水解酶或所述葡萄糖醛酸水解酶的突变体催化水解含有末端葡萄糖醛酸糖苷结构的糖苷类化合物得到对应的苷元化合物或对应的脱糖基化合物。优选的：所述的含有末端葡萄糖醛酸糖苷结构的糖苷类化合物金盏花苷e、竹节参皂苷iva、甘草酸、甘草酸甲酯中的任意一种，或者含有所述化合物的药材提取物；所述的转化得到的对应的苷元化合物或对应的脱糖基化合物为齐墩果酸、齐墩果酸-β-d-吡喃葡萄糖基酯、甘草次酸、甘草次酸甲酯、单葡萄糖醛酸甘草次酸或单葡萄糖醛酸甘草次酸甲酯。
17.本发明的葡萄糖醛酸水解酶为一种大肠杆菌来源的葡萄糖醛酸水解酶，编码该蛋白的碱基序列可以通过ncbi等数据库获得，登录号为cp084529.1。氨基酸序列如seq no：2所示。对所述葡萄糖醛酸水解酶的氨基酸序列进行分子手段的改造，得到所述葡萄糖醛酸水解酶突变体，该葡萄糖醛酸水解酶突变体为(1)～(11)中的至少一种：
18.(1)将seq no：2所示氨基酸序列的第81位甘氨酸和第126位的赖氨酸突变为精氨酸；
19.(2)将seq no：2所示氨基酸序列的第126位赖氨酸和第137位谷氨酸突变为精氨
酸；
20.(3)将seq no：2所示氨基酸序列的第137位谷氨酸和第203位天冬氨酸突变为精氨酸；
21.(4)将seq no：2所示氨基酸序列的第81位甘氨酸、第126位赖氨酸和第137位谷氨酸突变为精氨酸；
22.(5)将seq no：2所示氨基酸序列的第81位甘氨酸、第126位赖氨酸和第151位天冬氨酸突变为精氨酸；
23.(6)将seq no：2所示氨基酸序列的第126位赖氨酸、第151位天冬氨酸和第203位天冬氨酸突变为精氨酸；
24.(7)将seq no：2所示氨基酸序列的第137位谷氨酸、第151位天冬氨酸和第203位天冬氨酸突变为精氨酸；
25.(8)将seq no：2所示氨基酸序列的第81位甘氨酸、第126位赖氨酸、第137位谷氨酸和第151位天冬氨酸突变为精氨酸；
26.(9)将seq no：2所示氨基酸序列的第81位甘氨酸、第126位赖氨酸、第137位谷氨酸和第203位天冬氨酸突变为精氨酸；
27.(10)将seq no：2所示氨基酸序列的第81位甘氨酸、第126位赖氨酸、第151位天冬氨酸和第203位天冬氨酸突变为精氨酸；
28.(11)将seq no：2所示氨基酸序列的第81位甘氨酸、第126位赖氨酸、第137位谷氨酸、第151位天冬氨酸和第203位天冬氨酸突变为精氨酸。
29.本发明将上述蛋白或其突变株的编码基因插入原核表达质粒中，并将重组质粒转入大肠杆菌表达菌株，获得表达重组蛋白的重组大肠杆菌菌株。由于该水解酶来源于大肠杆菌本身，与大肠杆菌表达系统完全适配，通过质粒构建重组表达体系，可以快速获得大量较纯的蛋白酶液，免去对重组蛋白的纯化步骤。粗酶液可直接用于转化反应。
30.本发明所述的葡萄糖醛酸水解酶通过分子生物学相关操作实现基因克隆、重组后构建重组菌。对重组菌株依次进行培养、蛋白诱导表达、收集发酵液、离心收集菌体、破碎菌体后离心收集上清液或冷冻干燥上清液等操作。
31.本发明将上述获得的蛋白粗酶液直接应用于催化水解含有末端葡萄糖醛酸糖苷结构的糖苷类化合物如金盏花苷e、竹节参皂苷iva、甘草酸等，或者含有这些化合物的药材提取物，转化得到对应的苷元化合物或对应的脱糖基化合物。转化体系仅由粗酶液-底物-ph缓冲溶液或粗酶液-底物构成。
32.研究表明，该大肠杆菌来源的葡萄糖醛酸重组酶及其突变体能够转化制备齐墩果酸、齐墩果酸-β-d-吡喃葡萄糖基酯、甘草次酸、单葡萄糖醛酸甘草次酸、甘草次酸甲酯等化合物。具体如下：
33.(1)转化齐墩果酸的底物可以为金盏花苷e或含有金盏花苷e的药材提取物，如竹节参总皂苷、竹节参粗提物、楤木总皂苷、龙牙楤木总皂苷、太白楤木总皂苷、楤木粗提取物等。
34.(2)转化齐墩果酸-β-d-吡喃葡萄糖基酯的底物可以是竹节参皂苷iva或含有竹节参皂苷iva的药材提取物如如竹节参总皂苷、竹节参粗提物、楤木总皂苷、龙牙楤木总皂苷、太白楤木总皂苷、楤木粗提取物等。
35.(3)转化甘草次酸和单葡萄糖醛酸甘草次酸的底物可以是甘草酸、甘草酸单铵盐或含有甘草酸的甘草提取物。
36.(4)转化甘草次酸甲酯和单葡萄糖醛酸甘草次酸甲酯的底物可以是甘草酸甲酯或者含有甘草酸甲酯的甘草提取物。
37.本发明通过控制反应时间，可以有目的控制转化产物，例如甘草酸水解制备甘草次酸需要经过单葡萄糖醛酸甘草次酸这一中间体。在优化的投料比例和反应时间下，可以使得反应产物中单葡萄糖醛酸甘草次酸含量达到80％或以上的占比。在同样的反应投料比例条件下延长反应时间，或同样的反应时间下提高酶的投料占比，则可以将全部甘草酸和单葡萄糖醛酸甘草次酸转化为甘草次酸，甘草次酸占转化比可达到90％或以上。
38.本发明的有益效果：
39.本发明的实验证明，使用优选的本发明所述重组表达的葡萄糖醛酸水解酶粗提液可用于高效水解金盏花苷e、竹节参皂苷iva、甘草酸、甘草酸甲酯等，对应生成齐墩果酸、齐墩果酸-β-d-吡喃葡萄糖基酯、甘草次酸、甘草次酸甲酯、单葡萄糖醛酸甘草次酸、单葡萄糖醛酸甘草次酸甲酯。本发明扩大了葡萄糖醛酸水解酶的应用，提出了制备上述特性产物的高效生物转化方法。本发明涉及的转化条件主要是温度和反应时间，转化反应在室温或控温条件下反应。具有酶制备方式简单、反应体系简单、反应条件温和、反应程度可控等特点，适合工业化制备。
附图说明
40.图1为实施例2gus-gh2粗酶液的sds-page蛋白电泳图。
41.图2为实施例3竹节参提取物中的金盏花苷e被重组gus-gh2水解转化为齐墩果酸的检测结果。
42.图3为实施例7竹节参总皂苷中的竹节参皂苷iva被重组gus-gh2水解转化为齐墩果酸-β-d-吡喃葡萄糖基酯的检测结果。
43.图4为实施例8甘草皂苷提取物中的甘草酸被重组gus-gh2水解转化为甘草次酸的检测结果。
具体实施方式
44.以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和本质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
45.下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
46.实施例1大肠杆菌来源的葡萄糖醛酸水解酶及其编码基因的克隆
47.以大肠杆菌bl21的基因组为模板，设计并合成相应引物；对gus基因进行分子克隆、构建基因工程菌和表达。以前述菌体直接作为聚合酶链式反应(pcr)扩增模版，分别以5
′‑
attccatatgatgttacgtcctgtagaaaccccaa-3
′
和5
′‑
atatctcgagtcattgtttgcctccctgctg-3
′
为引物进行扩增。pcr体系为：2
×
taq mixture 25μl，上下游引物(10μm)各1μl，极少量菌体和ddh2o 22μl。pcr条件为：先95℃预变性10min，然后95℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 2min，共30个循环；最后72℃延伸10min。上述pcr产物进行琼
脂糖凝胶电泳分析，而后通过试剂盒回收目的dna片段。用限制性内切酶ndei和xhoi分别将回收产物与pet-28a(+)载体进行双酶切(37℃，2h)；通过凝胶电泳对产物进行纯化，通过试剂盒回收纯化的酶切dna产物，并用t4连接酶16℃连接6个小时，连接产物转化大肠杆菌e.coli bl21(de3)感受态细胞中，挑取单克隆，使用t7引物进行pcr验证，获得重组菌bl21(de3)/pet-28a(+)-gus。提取重组菌的质粒测序验证，该pcr产物的基因命名为gus，其核苷酸序列为序列表中的seq no：1，该序列与ncbi数据库中已报到的大肠杆菌葡萄糖醛酸水解酶序列一致，证明克隆正确，该基因编码的蛋白命名为gus-gh2，该蛋白的氨基酸序列为序列表中的seq no：2。将含有该pcr产物的质粒命名为pet-28a(+)-gus，该质粒为将序列表中的seq no：1插入pet-28a(+)载体的ndei和xhoi双酶切位点间得到的载体。
48.实施例2 gus-gh2粗酶液的制备
49.将实施例1获得的bl21(de3)/pet-28a(+)-gus的单菌落接种至含有卡那霉素(终浓度为50μg/ml)的lb液体培养基中，37℃培养12h，取1ml菌液(1％，体积百分含量)加入到100ml新鲜的lb液体培养基中，同时加入卡那霉素(终浓度为50μg/ml)，37℃培养至od600达到0.5时，取出置于冰水中冷却10min，随即加入iptg，iptg终浓度为0.2mm，并在16℃、110rpm摇床中诱导20h。诱导完毕的发酵液在4℃、5000rpm离心15min收集菌体。用50ml生理盐水洗涤2次，离心，收集菌体。以20mm的ph7.4磷酸钠盐缓冲液重悬菌体，高压匀质机在4℃的温度下破碎菌体。在4℃，12000rpm下离心20min，沉淀细胞碎片。上清粗酶液冷冻干燥后于4℃下储存。gus-gh2粗酶液的sds-page蛋白电泳图如图1所示。
50.实施例3 gus-gh2对竹节参总皂苷转化生成齐墩果酸
51.取适量含有金盏花苷e的竹节参总皂苷提取物(金盏花苷e含量不少于20％)，以ph7.0的50mm磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液溶解为终浓度10mg/ml的底物溶液，加入5倍体积的实施例2制备的粗酶液，于37℃，110rpm摇床中反应6小时，加入等体积的水饱和正丁醇溶液萃取3次，合并正丁醇部分，通过旋转挥发仪浓缩蒸干，以适量甲醇洗涤，蒸发溶剂获得白色粉末即含有齐墩果酸的粗品。取适量产物粉末，以甲醇溶解成0.5mg/ml的色谱供试品，通过高效液相色谱进行分析。高效液相色谱条件为：液相系统为安捷伦1260单泵四元系统，色谱柱使用安捷伦zorbax sb-c18(4.6mm*250mm 5μm)，流动相a相为乙腈，b相为0.05％磷酸，流速1ml/min。采用梯度为第0到20min，a相由23％递增到40％；第20到30min，a相由40％递增到75％；第30到第32min，a相由75％递增到90％；第32到40min，a相维持90％。采样时长为40min，柱温为30℃，检测器为dad检测，波长256nm，进样体积为10μl。金盏花苷e已转化为齐墩果酸，转化比按金盏花苷e摩尔质量计算为97.8％。如图2结果表明，在所示实验条件下，竹节参提取物中的金盏花苷e被重组gus-gh2水解转化为齐墩果酸。
52.实施例4 gus-gh2水解金盏花苷e转化生成齐墩果酸
53.取适量金盏花苷e样品(纯度为98％)以二甲基亚砜溶解为终浓度10mg/ml的底物溶液，加入10倍体积的实施例2制备的粗酶液，于37℃，110rpm摇床中反应3小时，加入等体积的水饱和正丁醇溶液萃取3次，合并正丁醇部分，通过旋转挥发仪浓缩蒸干，以适量甲醇洗涤，蒸发溶剂获得白色粉末即为齐墩果酸的粗品。取适量产物粉末，以甲醇溶解成0.5mg/ml的色谱供试品，通过薄层色谱或高效液相色谱进行分析(参照实施例3中所述的条件)，金盏花苷e转化为齐墩果酸，转化比按金盏花苷e摩尔质量计算为98.6％。
54.实施例5 gus-gh2水解竹节参皂苷iva转化生成齐墩果酸-β-d-吡喃葡萄糖基酯
55.取适量竹节参皂苷iva样品(纯度为98％)，以二甲基亚砜溶解为终浓度10mg/ml的底物溶液，加入10倍体积的实施例2制备的粗酶液，于37℃，110rpm摇床中反应5小时，加入等体积的水饱和正丁醇溶液萃取3次，合并正丁醇部分，通过旋转挥发仪浓缩蒸干，以适量甲醇洗涤，蒸发溶剂获得白色粉末即为齐墩果酸-β-d-吡喃葡萄糖基酯的粗品。取适量产物粉末，以甲醇溶解成0.5mg/ml的色谱供试品，通过高效液相色谱进行分析(参照实施例3中所述的条件)，竹节参皂苷iva转化为齐墩果酸-β-d-吡喃葡萄糖基酯，转化比按竹节参皂苷iva摩尔质量计算为99.6％。
56.实施例6 gus-gh2水解楤木总皂苷转化生成齐墩果酸-β-d-吡喃葡萄糖基酯
57.取适量楤木皂苷提取物(其中含有竹节参皂苷iva不少于32％)，以甲醇溶解为终浓度10mg/ml的底物溶液，加入10倍体积的实施例2制备的粗酶液，于37℃，110rpm摇床中反应6小时，加入等体积的水饱和正丁醇溶液萃取3次，合并正丁醇部分，通过旋转挥发仪浓缩蒸干，以适量甲醇洗涤，蒸发溶剂获得白色粉末即为含有齐墩果酸-β-d-吡喃葡萄糖基酯的粗品。取适量产物粉末，以甲醇溶解成0.5mg/ml的色谱供试品，通过高效液相色谱进行分析(参照实施例3中所述的条件)，组分中的竹节参皂苷iva转化为齐墩果酸-β-d-吡喃葡萄糖基酯，转化比按竹节参皂苷iva摩尔质量计算为97.9％。
58.实施例7 gus-gh2水解竹节参总皂苷转化生成齐墩果酸-β-d-吡喃葡萄糖基酯
59.取适量竹节参总皂苷提取物(其中含有竹节参皂苷iva不少于25％)以甲醇溶解为终浓度10mg/ml的底物溶液，加入10倍体积的实施例2制备的粗酶液，于37℃，110rpm摇床中反应6小时，加入等体积的水饱和正丁醇溶液萃取3次，合并正丁醇部分，通过旋转挥发仪浓缩蒸干，以适量甲醇洗涤，蒸发溶剂获得白色粉末即为含有齐墩果酸-β-d-吡喃葡萄糖基酯的粗品。取适量产物粉末，以甲醇溶解成0.5mg/ml的色谱供试品，通过薄层色谱或高效液相色谱进行分析(参照实施例3中所述的条件)，组分中的竹节参皂苷iva转化为齐墩果酸-β-d-吡喃葡萄糖基酯，转化比按竹节参皂苷iva摩尔质量计算为99.0％。如图3结果表明，在所示实验条件下，竹节参总皂苷中的竹节参皂苷iva被重组gus-gh2水解转化为齐墩果酸-β-d-吡喃葡萄糖基酯。
60.实施例8 gus-gh2水解甘草提取物转化单葡萄糖醛酸甘草次酸
61.取适量甘草提取物(含有甘草酸和单葡萄糖醛酸甘草次酸的含量不小于50％)，以ph7.0的50mm磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液溶解为终浓度10mg/ml的底物溶液，加入5倍体积的实施例2制备的粗酶液，于37℃，110rpm摇床中反应1小时，加入等体积的水饱和正丁醇溶液萃取3次，合并正丁醇部分，通过旋转挥发仪浓缩蒸干，以适量甲醇洗涤，蒸发溶剂获得白色粉末即为含有单葡萄糖醛酸甘草次酸的粗品(单葡萄糖醛酸甘草次酸含量不小于35％)。取适量产物粉末，以甲醇溶解成0.5mg/ml的色谱供试品，通过薄层色谱或高效液相色谱进行分析。甘草酸和产物甘草次酸的高效液相色谱条件为：液相系统为安捷伦1260单泵四元系统，使用安捷伦zorbax sb-c18(4.6mm*250mm 5μm)色谱柱，流动相a相为乙腈，b相为0.05％磷酸，流速1ml/min。采用梯度第0到20min，a相由23％递增到40％；第20到30min，a相由40％递增到75％；第30到第32min，a相由75％递增到90％；第32到40min，a相维持90％。采样时长为40min，柱温为30℃，检测器为dad检测，波长256nm，进样体积为5μl。组分中的甘草酸已转化为单葡萄糖醛酸甘草次酸和甘草次酸，转化比按甘草酸摩尔质量计算，单葡萄糖醛酸甘草次酸转化比为87.1％，甘草次酸转化比为6.7％。如图4结果表明，在所示实验条
件下，甘草皂苷提取物中的甘草酸被重组gus-gh2水解转化为甘草次酸。
62.实施例9 gus-gh2水解甘草酸单铵盐转化生成甘草次酸
63.取适量甘草酸单铵盐以二甲基亚砜溶解为终浓度10mg/ml的底物溶液，加入10倍体积的实施例2制备的粗酶液，于37℃，110rpm摇床中反应6小时，加入等体积的水饱和正丁醇溶液萃取3次，合并正丁醇部分，通过旋转挥发仪浓缩蒸干，以适量甲醇洗涤，蒸发溶剂获得白色粉末即为甘草次酸粗品。取适量产物粉末，以甲醇溶解成0.5mg/ml的色谱供试品，通过高效液相色谱进行分析(分析条件参考参照实施例8)，组分中的甘草酸全部转化甘草次酸，转化比按甘草酸摩尔质量计算，甘草次酸转化比为98.7％。
64.gus序列：
65.atgttacgtcctgtagaaaccccaacccgtgaaatcaaaaaactcgacggcctgtgggcattcagtctggatcgcgaaaactgtggaattgatcagcgttggtgggaaagcgcgttacaagaaagccgggcaattgctgtgccaggcagttttaacgatcagttcgccgatgcagatattcgtaattatgcgggcaacgtctggtatcagcgcgaagtctttataccgaaaggttgggcaggccagcgtatcgtgctgcgtttcgatgcggtcactcattacggcaaagtgtgggtcaataatcaggaagtgatggagcatcagggcggctatacgccatttgaagccgatgtcacgccgtatgttattgccgggaaaagtgtacgtatcaccgtttgtgtgaacaacgaactgaactggcagactatcccgccgggaatggtgattaccgacgaaaacggcaagaaaaagcagtcttacttccatgatttctttaactatgccgggatccatcgcagcgtaatgctctacaccacgccgaacacctgggtggacgatatcaccgtggtgacgcatgtcgcgcaagactgtaaccacgcgtctgttgactggcaggtggtggccaatggtgatgtcagcgttgaactgcgtgatgcggatcaacaggtggttgcaactggacaaggcactagcgggactttgcaagtggtgaatccgcacctctggcaaccgggtgaaggttatctctatgaactgtgcgtcacagccaaaagccagacagagtgtgatatctacccgcttcgcgtcggcatccggtcagtggcagtgaagggcgaacagttcctgattaaccacaaaccgttctactttactggctttggtcgtcatgaagatgcggacttgcgtggcaaaggattcgataacgtgctgatggtgcacgaccacgcattaatggactggattggggccaactcctaccgtacctcgcattacccttacgctgaagagatgctcgactgggcagatgaacatggcatcgtggtgattgatgaaactgctgctgtcggctttaacctctctttaggcattggtttcgaagcgggcaacaagccgaaagaactgtacagcgaagaggcagtcaacggggaaactcagcaagcgcacttacaggcgattaaagagctgatagcgcgtgacaaaaaccacccaagcgtggtgatgtggagtattgccaacgaaccggatacccgtccgcaaggtgcacgggaatatttcgcgccactggcggaagcaacgcgtaaactcgacccgacgcgtccgatcacctgcgtcaatgtaatgttctgcgacgctcacaccgataccatcagcgatctctttgatgtgctgtgcctgaaccgttattacggatggtatgtccaaagcggcgatttggaaacggcagagaaggtactggaaaaagaacttctggcctggcaggagaaactgcatcagccgattatcatcaccgaatacggcgtggatacgttagccgggctgcactcaatgtacaccgacatgtggagtgaagagtatcagtgtgcatggctggatatgtatcaccgcgtctttgatcgcgtcagcgccgtcgtcggtgaacaggtatggaatttcgccgattttgcgacctcgcaaggcatattgcgcgttggcggtaacaagaaagggatcttcactcgcgaccgcaaaccgaagtcggcggcttttctgctgcaaaaacgctggactggcatgaacttcggtgaaaaaccgcagcagggaggcaaacaatga
66.gud蛋白序列：
67.mlrpvetptreikkldglwafsldrencgidqrwwesalqesraiavpgsfndqfadadirnyagnvwyqrevfipkgwagqrivlrfdavthygkvwvnnqevmehqggytpfeadvtpyviagksvritvcvnnelnwqtippgmvitdengkkkqsyfhdffnyagihrsvmlyttpntwvdditvvthvaqdcnhasvdwqvvangdvsvelrdadqqvvatgqgtsgtlqvvnphlwqpgegylyelcvtaksqtecdiyplrvgirsvavkgeqflinhkpfyftgfgrhedadlrgkgfdnvlmvhdhalmdwigansyrtshypyaeemldwadehgivvidetaavgfnlslgigfeagnkpk
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