专利名称：茚并吲哚类化合物的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及具有茚并吲哚结构的疏水抗氧化剂在体外和体内器官保存医学治疗中的应用。已知这些化合物在还原作用方面是高度有效的，即处理脂类或脂两相的自由基，因此终止脂过氧化过程并防止由该过程或有关过程引起的症状和疾病。尤其是，本发明基于下述应用，即应用两个具体化合物的至少一个化合物或其盐，优选其治疗上可接受的盐，作为器官保存溶液特别是心麻痹溶液的添加剂。所述的保存溶液可以用于供体丙就地器官处理以及摘取器官后的器官储存。另外，本发明还涉及改良的器官保存溶液。
背景技术：
某些生物过程产生较稳定或较不稳定的含有未配对电子的中间体，该电子可以贡献出或者也可以与来自环境的另一电子配对。这样的中间体称作自由基，且它们可以是各种酶或非酶反应的产物。其中许多对于机体功能是必不可少的，例如在DNA合成中的二磷酸核苷的还原和在前列腺素合成酶反应中的前列腺素的产生。后者对于细胞损伤后的炎症反应和许多其它功能都是重要的。其它的自由基反应包括嗜中性细胞和巨噬细胞中的骨髓过氧化酶反应及线粒体呼吸链中的电子转移，所述细胞毁灭细菌和其它入侵体。多数器官含有化学抗氧化剂如α-生育酚(维生素E)、维生素C及各种基团和过氧化钝化酶，例如超氧化歧化酶、触酶和谷胱甘肽过氧化酶。
各种类型的自由基越来越与许多症状和疾病有关，例如局部缺血和再灌注损伤、动脉硬化、血栓形成和栓塞、变应反应/炎症如支气管哮喘、类风湿性关节炎，与Alzheimer’s病有关的症状、Parkinson’s病和老年化、白内障、糖尿病、肿瘤，并与抗肿瘤或免疫抑制剂和化学品的毒性有关。对于这些症状和疾病的一个可能的解释是就未知原因而言，抗自由基损伤的内源性保护剂并没有足够的活性保护组织免受自由基损伤。由自由基过量产生引起的脂过氧化在上述症状中可以是一种显著的损伤途经。于是对脂过氧化的抑制将提供一种预防或治疗上述症状和疾病的方法。
应用抗氧化剂减轻局部缺血/再灌注损伤的一般思想在几种文献中已描述过，例如Drugs 42(4)569-605，1991；和J.Lab.Clin.Med.，Vol.119(6)598-620，June 1992。茚并吲哚在减轻局部缺血和再灌注损伤及上述的其它症状和疾病方面的可能的应用已由M.Sainsbury和H.G.Shertzer在专利说明书EP-A 409410和GB 9022453.6-A中建议。然而，在实践中要表示抗氧化剂效力与器官保护能力之间的任何相关性是非常困难的。本发明已发现对器官保存有用的两个具体化合物及其制备方法已在EP-A409410和GB 9022453.6-A中公开。
本发明描述茚并吲哚型的两个已知的具体抗氧化剂的新用途。该两个化合物既满足具有足够亲脂性的要求，因此可在细胞膜中累积，同时又是脂过氧化的抑制剂。这两个抗氧化剂可用于医学中体外和体内器官保存。与其它的抗氧化剂如α-生育酚比较，按本发明的应用，这两个具体化合物的是十分有利的。
本发明的描述现已发现上述专利说明书中公开的两个茚并吲哚化合物作为器官保存溶液的添加剂是十分有用的。这两个化合物对各种局部缺血和再灌注(rperfusion)损伤提供长期的和预想不到的有效保护。本发明的茚并吲哚分别具有式I和II结构 8-甲氧基-6-甲基-THII9-甲氧基-7-甲基-异THII化合物I和II可以以其外消旋混合物形式或以其对映体纯的形式应用，本发明还包括这两个化合物以其可药用盐的形式应用。
式I或II可以直接添加入器官保存溶液中，也可以以药物制剂形式添加入器官保存溶液中。所述药物制剂包含游离碱形式或可药用的无毒酸盐形式的活性成分，盐的实例是盐酸盐、氢溴酸盐、乳酸盐、乙酸盐、磷酸盐、硫酸盐、氨基磺酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、草酸盐及食品和药品管理局(FDA)批准的其它盐。活性物质优选以可药用的剂型添加入保存溶液中。
用标准方法可将化合物转变成适宜的盐。于是，在加热或不加热条件下将游离碱和适宜的酸溶解于适宜溶剂中，自然形成结晶，或者冷却后收集结晶并用少量冷溶剂洗涤。干燥并于适宜溶剂中重结晶，得纯的盐。
剂型可以是准备应用的溶液或欲用保存溶液稀释的溶液。型型也可以是冻干物或粉末，用前用保存溶液再配制。如果适合，冻干物可含有常规的赋形剂。
活性物质在保存溶液中的最终浓度为1×10-7至10％(重量)活性物质。
保存溶液可以是适合于保存各种器官如心、肾、肝及各种组织的保存溶液。可商购到的所述保存溶液是Plegisol及根据其来源命名的其它保存溶液如UW溶液(Wisconsin大学)、Stanford溶液和改良的Collins溶液，参见J.Heart Transplant Vol.7(6)456-467，1988。本发明改进的保存溶液适合于就地对供体内的器官处理及摘取后对器官的储存。
本发明改进的保存溶液也可含有常规的共溶剂、赋形剂、稳定剂和/或缓冲剂。本发明的保存溶液可方便地以各种剂量单元形式提供。
用于本发明的化合物是已知的化合物。化合物I描述于EP-A409410实施例17中，而化合物II描述于GB 9022453.6-A实施例55中。它们可按上述的专利说明书中给出的方法或通过其它常规方法制备。
化合物的药理性质和试验按本发明用于器官保存的茚并吲哚是亲脂的和稳定的结构，该结构形成阳离子基团或氧化时的基团。通过对体外Fe2+抗坏血酸盐诱导的脂过氧化作用的抑制进行测定时，它们是有效的抗氧化剂，IC50值低达10nM(见EP-A409410)。在兔平滑肌细胞或小鼠腹腔巨噬细胞存在下，式I和II化合物能有效防止人血浆中脂蛋白的氧化。当这些化合物作为添加剂用于器官保存溶液中时，它们增强器官的功能并且也防止局部缺血和再灌注对离体大鼠心细胞、离体灌注的大鼠心脏、大鼠骨髓、大鼠肾脏和肝脏的损伤。这些性质表明式I和II化合物在对器官如肾、肝、心和其组织的保存溶液中作为添加剂是有用的。
茚并吲哚化合物是有效的自由基清除剂或抗氧化剂。采用一检测系统测定抑制脂过氧化50％时所需的式I和II化合物的浓度(IC50)。所述检测系统，即抗坏血酸盐/Fe2+-依赖的脂过氧化，与EP-A 409410中所用的系统是相同的，此系统的详细描述见该专利说明书。
1.抗坏血酸盐/Fe2+-依赖的脂过氧化表1表明茚并吲哚和α-生育酚对抗坏血酸盐/Fe2+依赖的脂过氧化的影响。
表1化合物pIC50本发明化合物I8-甲氧基-6-甲基-THII 8.0本发明化合物II9-甲氧基-7-甲式-异THII8.2对比化合物α-生育酚(维生素E)5.0化合物III4b，6，8，9b-四甲基-THII 7.4(EP-A 409410，实施例1.5)2.肾组织的体外缺氧和再氧化也在肾组织中试验脂过氧化作用。样品取自麻醉的大鼠。切成2mm片并放入37℃的50ml Erlemeyer烧瓶，其中含有40mmol-1Hepes缓冲液(pH7.40)(10-100mg组织/4ml缓冲液)。向缓冲液中通入小气流氩气使组织缺氧20分钟，之后抗氧化剂或相应载体加入缓冲液中，组织在氩气环境再保持20分钟。然后通过向缓冲液中通入95.5％O2CO2剧烈鼓泡使样品再氧化。再氧化30分钟后加入离子螯合剂去铁胺甲磺酸盐(Ciba Geigy AG，瑞典)(最终浓度为45μmol-1)。样品在冰上均化，在干冰和乙醇中快速冷冻，并于-70℃储存。解冻后测定生成的2-硫巴比土酸反产物(TBARS)(Svensson et al Scand J ClinInvest 199353)。抗氧化剂的效力(pIC50，即相应于载体值降低TBARS形成50％时所需的抗氧化剂浓度的负对数)，化合物I为6.8，化合物II为6.8。
讨论遭受缺氧和再氧化的肾组织的体外保护在抗坏血酸盐/Fe2+模型中，化合物III(一种具有茚并吲哚结构的抗氧化剂)的pIC50为7.4，与之相比较，化合物I和II分别为8.0和8.2。当将化合物I和II以50mg/kg的口服剂量给予大鼠时，它们能消除遭受体外缺氧和再氧化的肾组织的脂过氧化，长达给药后6小时。相反，具有茚并吲哚结构的其它化合物，如化合物III仅表现出对脂过氧化微弱的抑制作用，该作用在约药30分钟后就检测不到。这些结果表明化合物I和II具有独一无二的性质，即对脂过氧化的体内治疗是有效的。
3.对离体心细胞和离体心脏的再氧化损伤的抑制3.1离体心细胞从2天和6天龄大鼠中获取心脏，将心室任意切成碎块，放于不含有Ca2+和Mg2+、但含有0.35g/l碳酸钠的Hanks平衡盐溶液中，并切成小碎片。将细胞分散于同种溶液中，加入胶原酶(1型，0.8mg/ml)，在37℃保持10分钟，在160×g离心5分钟。然后进行5个连续20分钟的消化。最初消化的细胞弃去，然后每20分钟离心一次且将胶原酶溶液换成Ham’s F10培养基，并补充10％小牛血清(FBS)、谷氨酰胺2mM、青霉素50IU/ml和链霉素50μg/ml、应用浓集分离肌细胞的方法，包括浓集细胞两次，每次分别为30和90分钟。将肌细胞涂于35mm塑料培养盘上，密度为约9×105个细胞/ml(1.8×106个细胞/盘)。在Forma Scientific二氧化碳培养箱5％CO2中，在需氧条件37℃5％CO2下培养细胞6天。在此期间，细胞开始聚集，并同时以20-40次/分的频率振动。每一培养盘含0.9±0.2mg蛋白。每天换补充的F10培养基。将抗氧剂化合物II乙醇液加入培养基中，达到0.1％乙醇的最终浓度。培养基中化合物II的最终浓度为0.01、0.1、1.0或5.0μmol/l。实验开始前除去肌细胞上面的培养基，并换成加有谷氨酰胺的新鲜F10培养基，该培养基在加入细胞之前通过向其中通入氩气使其缺氧。培养盘移入专门设计的空气密闭的恒温室中。实验持续300分钟，其中60分钟缺氧，慢慢向细胞上面通入氮气(95％N2，5％CO2)，然后240分钟再氧化(95％O2，5％CO2)。通过泄漏LD到培养基中测定细胞生命力，并在1、30、60、90、120、180、240和300分钟后进行分析。结果表明浓度为1μmol/l(化合物II)能降低损伤(LD泄漏)90％，计算的pIC50(-logIC50)值为7.5。
3.2改善的心脏局部缺血后的恢复设计实验以研究当抗氧剂化合物II加入透明的心麻痹溶液如Plegisol(A bbott)中时，冷冻局部缺血6小时后对心肌恢复的影响。采用用心室内气球逆行灌注(Langendorff)的离体大鼠心脏。用Plegisol或加有1μmol/l化合物II的Plegisol单独灌注心脏(10ml，4℃)。然后该心脏在4℃于各自的溶液中储存6小时。在第3组中，心脏只用Plegisol灌注但不储存。在用加有化合物II的Plegisol处理的心脏组中，左心室工作压力(LVDP＝收缩压和舒张压之间的差值)明显改善，LVDP为90±9％(局部缺血前的％值，平均数±SEM)，相比较单用Plegisol保存的心脏为57±11％。只灌注不储存的心脏的LVDP为89±1％。
这一研究表明，化合物II加入心脏保存溶液如Plegisol中，能大幅度地改善大鼠心脏功能的恢复，对临床心脏的移植和其它器官的移植会是有益的。
权利要求
1.选自式I和II茚并吲哚化合物的抗氧化剂在器官保存溶液中的应用。 式I式II
2.权利要求1的抗氧化剂的应用，其中用于体外器官储存的保存溶液中。
3.权利要求1的抗氧化剂的应用，其中所述茚并吲哚化合物是式I化合物。
4.权利要求1的抗氧化剂的应用，其中所述茚并吲哚化合物是式II化合物。
5.权利要求1的抗氧化剂的应用，其中所述保存溶液是心麻痹溶液。
6.一种器官保存溶液，其特征在于该溶液包括式I或II的茚并吲哚化合物与常规的器官保存溶液的组合。
7.权利要求6的保存溶液，其特征在于该溶液包含1×10-7至10％(重量)的所述茚并吲哚化合物。
8.权利要求6的保存溶液，其特征在于该器官保存溶液是心麻痹溶液。
9.选自式I和II茚并吲哚化合物的化合物在制备用于器官供体内就地处理器官的器官保存溶液中的应用。
全文摘要
本发明公开了式I和II的茚并吲哚抗氧化剂作为添加剂在器官保存溶液中的应用。所述保存溶液既可用于器官供体内就地的器官处理，也可用于摘取后的器官储存。还公开了一种改良的器官保存溶液。
文档编号C07D209/00GK1131898SQ9419356
公开日1996年9月25日 申请日期1994年7月14日 优先权日1993年7月16日
发明者M·圣斯布里, H·G·舍泽, P·-O·施约奎斯特 申请人:阿斯特拉公司, 辛辛那提大学, 巴斯大学