1.本发明属于基础研究技术领域，尤其涉及一种病毒诱导的基因沉默介导的藜麦基因功能验证的方法。


背景技术：

2.目前，藜麦(chenopodium quinoa willd.)属于苋科藜属一年生植物，籽粒具有极高的营养价值，其蛋白质含量远超其他粮食，富含多种人体必需氨基酸、且含量均衡，藜麦中还含有丰富的矿物质、不饱和脂肪酸、黄酮、多酚、皂苷等活性物质，具有抗氧化、降血脂、增强免疫等生理功效，进而能够降低患一些疾病的风险等生理功能。此外，籽粒不含麸质，特别适合对麸质过敏的人群，具有增强其免疫力的作用。
3.近年来，随着人们对健康需求的提高，对藜麦产量的需求也大量增加。由于藜麦花序呈圆锥型，具有多级分枝，花序(穗)大而紧密，藜麦的花小，藜麦的花由不同大小的雌花及两性花组成，比例受到遗传和环境的影响。两性花有4～8个花药与萼片对生，1个上位子房，子房上柱头有2或3个分枝，主要分布于主花枝和次级花枝的顶端；雌花有三种类型，按花被的存在与缺失分为具花被的大雌花、具花被的小雌花和无花被的小雌花。
4.由于藜麦花的结构和着生部位的差异，且花结构的复杂性，导致人工去雄难，致使藜麦杂交技术研究进展缓慢。在自然界中，藜麦常存在花粉败育的现象，严重时出现整朵花的花药完全败育，常常导致藜麦籽粒出现空瘪粒的现象，产量受到较大影响。因此，亟需一种新的藜麦基因功能的验证方法。
5.通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：由于藜麦花的结构和着生部位的差异，且花结构的复杂性，导致人工去雄难，致使藜麦杂交技术研究进展缓慢。在自然界中，藜麦常存在花粉败育的现象，严重时出现整朵花的花药完全败育，常常导致藜麦籽粒出现空瘪粒的现象，产量受到较大影响。


技术实现要素：

6.针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种病毒诱导的基因沉默介导的藜麦基因功能验证的方法，尤其涉及一种通过病毒介导的基因沉默(virus-induced gene silencing，vigs)进行藜麦基因功能验证的方法。
7.本发明是这样实现的，一种病毒诱导的基因沉默介导的藜麦基因功能验证的方法，所述病毒诱导的基因沉默介导的藜麦基因功能验证的方法包括以下步骤：
8.步骤一，准备相关病毒的载体；
9.步骤二，进行目的基因和指示基因的克隆；
10.步骤三，进行vigs的重组载体的构建；
11.步骤四，进行病毒诱导的基因沉默的实验。
12.进一步，步骤三中，所述vigs的重组载体的构建，包括：
13.指示基因，即pds基因和目的基因扩增片段与病毒载体的连接，采用限制性内切酶
bamhi和ecori双酶切，双酶切后将酶切产物进行dna纯化，用t4dna连接酶在16℃下连接过夜，转化大肠杆菌感受态细胞；经pcr鉴定后筛选阳性克隆进行扩大培养，提取质粒进行酶切验证，切出目的片段的载体质粒及为指示基因-病毒连接的重组载体和病毒-目的基因连接的重组载体。
14.进一步，所述pds基因和ams基因的克隆，包括：
15.提取藜麦叶和花序的rna，反转合成cdna第一链；根据ncbi中公布的玉米pds基因序列xm_021864666.1和预测的藜麦ams基因序列，选择pds和ams的vigs干扰靶标片段长度分别为461bp和498bp；以藜麦叶片的cdna第一链为板，pcr扩增cqpds基因片段，分别在上下游引入bamhi和ecori酶切位点和保护碱基；用1％琼脂糖凝胶电泳对pcr扩增产物进行分析，根据pcr产物纯化试剂盒说明回收目的片段，将其与pgem-t easy载体连接，测序验证后再分别插入载体ptrv2中，获得重组vigs载体ptrv2-cqpds和ptrv2-cqams，测序验证正确后备用。
16.进一步，所述扩增pds引物cq_pds的核苷酸序列如seq id no：1所示，所述扩增ams引物cq_ams的核苷酸序列如seq id no：2所示，所述检测pds引物rt_pds的核苷酸序列如seq id no：3所示，所述检测ams引物rt_ams的核苷酸序列如seq id no：4所示，所述内参基因引物cq_act1的核苷酸序列如seq id no：5所示。
17.进一步，所述vigs的载体构建，包括：
18.pds基因和ams基因扩增片段于ptrv2载体同时采用限制性内切酶bamhi和ecori双酶切，双酶切后将酶切产物进行dna纯化，用t4 dna连接酶在16℃下连接过夜，转化大肠杆菌dh5α感受态细胞；经pcr鉴定后筛选阳性克隆进行扩大培养，提取质粒进行酶切验证，切出目的片段的载体质粒及为重组载体ptrv2-cqpds和ptrv2-cqams。
19.进一步，步骤四中，所述病毒诱导的基因沉默的实验，包括：
20.(1)病毒及其重组载体的农杆菌侵染液的制备；
21.(2)藜麦材料的准备及注射侵染；
22.(3)qrt-pcr检测目的基因是否沉默。
23.进一步，步骤(1)中，所述病毒及其重组载体的农杆菌侵染液制备，包括：
24.将病毒质粒、空载体、指示基因-病毒连接的重组载体及病毒-目的基因连接的重组载体分别转化农杆菌感受态细胞；分别挑取阳性农杆菌单菌落，接种至2ml含有50mg/ml卡那霉素kan和50mg/ml利福平rif的yeb液体培养基中，28℃、200r/min振荡培养16h，菌液pcr检测正确后，再将菌液以1：100的体积比转接至50mg/ml kan和50mg/ml rif的yeb液体培养基中，28℃振荡培养至od600＝0.6，将各菌液的od600值调整至一致；5000r/min离心收集，用侵染缓冲液重悬农杆菌；将od600调至1.0，再按照1：1的比例混合含有病毒的农杆菌菌液和空载体、指示基因-病毒连接的重组载体及病毒-目的基因连接的重组载体的农杆菌菌液摇晃混匀后得到vigs转化的侵染液。
25.进一步，所述侵染缓冲液包括50mmol/l as贮存液、1mol/l mes贮存液和1mol/l mgcl2，ph 5.6。
26.进一步，步骤(2)中，所述藜麦材料的准备及注射侵染，包括：
27.藜麦长出第一对真叶后的第十天进行注射，将含有病毒载体的农杆菌侵染液、含有指示基因-病毒的重组载体农杆菌侵染液、含有目的基因-病毒的重组载体农杆菌侵染液
注射到藜麦叶片内，以注射含有病毒的空载体德农杆菌侵染液为对照；将侵染后的藜麦植株先放置在暗环境下培养24h，再转换到16h/8h光暗条件下培养生长21d，观察植株表型并对目的基因、指示基因pds的转录水平进行检测，同时观察检测所有植株指示基因、目的基因被沉默后的表型差异。
28.进一步，步骤(3)中，所述qrt-pcr检测目的基因是否沉默，包括：
29.提取藜麦叶片rna，利用premix ex taqtmⅱkit反转录合成cdna作为qrt-pcr分析的模板；以藜麦的actin基因作为内参基因设计引物；对不同处理样品中的指示基因和目的基因转录水平进行相对定量qrt-pcr分析，反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火15s，72℃延伸30s，共30个循环；72℃终延伸10min，16℃保存备用。
30.结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：
31.本发明提供的病毒诱导的基因沉默介导的藜麦基因功能验证的方法，利用烟草脆裂病毒(trv，tobravirus)介导进行藜麦基因功能验证，涉及利用trv(tobravirus，烟草脆裂病毒)病毒载体，以藜麦pds(phytoene desaturase，八氢番茄红素脱氢酶)基因为标记基因，在藜麦中，通过trv病毒介导的vigs体系，进行基因的功能分析方法。
32.目前技术问题解决的难度在于构建vigs时沉默片段的选择，所用的病毒载体为trv，该病毒的载运能力在200～500bp,选择基因时还应该考虑家族基因和该基因的保守性，藜麦属于异源多倍体植物，很多基因存在家族基因和多拷贝的现象；同时，vigs系统用到病毒载体，在注射植株时，应考虑到环境对沉默效率的影响，比如温度、湿度等；再而vigs原理主要利用的是rnai，沉默基因主要只是表达量的下降，并非不表达，所以该技术需要做对照，我们技术选用的对照基因是cqpds基因；最后病毒载体自身会在接种植株上面存在病状，该病状不能干扰到沉默基因的表型，我们先用trv病毒载体，考虑到该病毒在藜麦中病状轻微，侵染能力较强。
33.本发明由于藜麦的花型小，结构复杂，育种工作困难，导致藜麦缺少系统选择和纯化培育。自然界中藜麦常常存在有败育花粉，导致藜麦产量的下降。要利用trv介导的vigs系体验证所预测的藜麦基因，为接下来的育种提供材料。
附图说明
34.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。
35.图1是本发明实施例提供的病毒诱导的基因沉默介导的藜麦基因功能验证的方法流程图。
36.图2是本发明实施例提供的藜麦pds基因干扰片段pcr扩增电泳结果示意图；
37.图中：1、8为空白对照；2～7为藜麦pds基因干扰片段。
38.图3是本发明实施例提供的trv2-pds酶切验证电泳结果示意图；
39.图中：1、2、3.trv2-pdsecori/bam hi限制性酶切。
40.图4是本发明实施例提供的trv2-pds酶切验证电泳结果示意图；
41.图中：对照：trv2-cqams载体；1、2、3为trv2-pdsecori/bam hi限制性酶切。
42.图5是本发明实施例提供的质粒trv2-cqpds和质粒trv2-cqams示意图。
43.图6是本发明实施例提供的藜麦叶片侵染25d的叶色及其cqpds基因在不同处理材料中的相对表达量示意图。
44.图6a和图6b是本发明实施例提供的实验组叶片表型示意图。
45.图6c是本发明实施例提供的空白对照组叶片表型示意图。
46.图6d是本发明实施例提供的阴性对照组叶片表型示意图。
47.图6e是本发明实施例提供的cqpds基因在正常植株、接种trv2空载体植株和接种trv2-cqpds示意图。
具体实施方式
48.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
49.针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种病毒诱导的基因沉默介导的藜麦基因功能验证的方法，下面结合附图对本发明作详细的描述。
50.如图1所示，本发明实施例提供的病毒诱导的基因沉默介导的藜麦基因功能验证的方法包括以下步骤：
51.s101，准备相关病毒的载体；
52.s102，进行目的基因和指示基因的克隆；
53.s103，进行vigs的重组载体的构建；
54.s104，进行病毒诱导的基因沉默的实验。
55.本发明实施例涉及的基因cqpds,cqams基因，载体trv2。cqpds基因(ncbi，xm_021864666.1)，cqams基因是自己通过本地blast对比其他物种ams(aur62010033)
56.基因所得到的序列：
57.atgaattactcaccagaagttcaaaatgcacaagggacaaggtatgggccagattttgatcacggaaagcctagaaacgggtttcacatgggaggagcatctgaaagcttcaatagaagcagccatgattttgaaagtgctagtgacaaagcacaacaaatggaggttcaagtggaagttgcgcagctagaggggaatgatttctttgtgaaggtgtttggtgagcaaaagagaggtgggtttgtgagactaatggaggctttacattgtcttgggttggagataatcaatgtgaatatgaccagttgcatcagtcttgtctcttatgtattcattgttaagaagagggaccgtgaaagtgtacaagcagagtacctgagggattcgttgctggaggcaacgcgtaaccaagctggattttggtctgagatggcgaaggcatcatcagagaatggaagtggcatcgatcatcgacatcagaatcagatttacgcgctgcagcaccacattcacaaccgccatataggacctttccacaaccactttcaccacctcagtaactaa
58.载体trv1(ncbi af406990)，载体trv(ncbi af406991.1)。
59.下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步描述。
60.本发明涉及一种通过病毒介导的基因沉默(virus-induced gene silencing，vigs)进行藜麦基因功能验证的方法，属于基础研究领域，所述方法利用烟草脆裂病毒(trv，tobravirus)介导的进行藜麦基因功能验证的方法。
61.本发明涉及利用trv(tobravirus，烟草脆裂病毒)病毒载体，以藜麦pds(phytoene desaturase，八氢番茄红素脱氢酶)基因为标记基因，在藜麦中，通过trv病毒介导的vigs体
系，进行基因的功能分析方法。
62.实施例1
63.1.准备相关病毒的载体：可以与试剂公司联系，一般的试剂公司都有。
64.2.目的基因和指示基因的克隆，按照试剂公司的基因克隆的一般操作程序进行。
65.3.vigs的重组载体的构建：指示基因(pds基因)和目的基因扩增片段与病毒载体的连接，采用限制性内切酶bamhi和ecori双酶切，双酶切后将酶切产物进行dna纯化，用t4 dna连接酶在16℃下连接过夜，转化大肠杆菌感受态细胞。经pcr鉴定后筛选阳性克隆进行扩大培养，提取质粒进行酶切验证，切出目的片段的载体质粒及为指示基因-病毒连接的重组载体和病毒-目的基因连接的重组载体。
66.4.病毒诱导的基因沉默的实验方法：
67.(1)病毒及其重组载体的农杆菌侵染液的制备：将病毒质粒、空载体、指示基因-病毒连接的重组载体及病毒-目的基因连接的重组载体分别转化农杆菌感受态细胞。分别挑取阳性农杆菌单菌落，接种至2ml含有50mg/ml卡那霉素(kan)和50mg/ml利福平(rif)的yeb液体培养基中，28℃、200r/min振荡培养16h，菌液pcr检测正确后，再将菌液以1：100的体积比转接至50mg/ml kan和50mg/ml rif的yeb液体培养基中，28℃振荡培养至od600＝0.6左右，将各菌液的od600值调整至一致。5000r/min离心收集，用侵染缓冲液(50mmol/las贮存液、1mol/l mes贮存液、1mol/l mgcl2、ph 5.6)重悬农杆菌。将od600调至1.0，再按照1：1的比例混合含有病毒的农杆菌菌液和空载体、指示基因-病毒连接的重组载体及病毒-目的基因连接的重组载体的农杆菌菌液摇晃混匀后得到vigs转化的侵染液。
68.(2)藜麦材料的准备及注射侵染：藜麦长出第一对真叶后的第十天进行注射，将含有病毒载体的农杆菌侵染液、含有指示基因-病毒的重组载体农杆菌侵染液、含有目的基因-病毒的重组载体农杆菌侵染液注射到藜麦叶片内，以注射含有病毒的空载体德农杆菌侵染液为对照。将侵染后的藜麦植株先放置在暗环境下培养24h，再转换到16h/8h光暗条件下培养生长21d，观察植株表型并对目的基因、指示基因pds的转录水平进行检测，同时，观察检测所有植株指示基因、目的基因被沉默后的表型差异。以此证明该基因的功能。
69.(3)qrt-pcr检测目的基因是否沉默：提取藜麦叶片rna，利用premix ex taqtmⅱkit反转录合成cdna作为qrt-pcr分析的模板。以藜麦的actin基因作为内参基因设计引物。对不同处理样品中的指示基因和目的基因转录水平进行相对定量qrt-pcr分析，反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火15s，72℃延伸30s，共30个循环；72℃终延伸10min，16℃保存备用。
70.实施例2
71.白藜麦种子由本实验室提供，材料生长于云南农业大学大后山试验基地，从中扩增pds、ams目的片段。vgis的受体材料为白藜麦，生长条件22℃，光照时间12h/12h(光照/黑暗)。
72.ptrv1、ptrv2载体、大肠杆菌dh5α及农杆菌gv3101菌系均为云南农业大学特色小宗作物研究所提供。
73.1、重组载体的构建：目的基因pds序列或ams基因的vigs载体的连接
74.藜麦cqpds基因的克隆：白藜麦叶片提取rna反转成cdna，作为模板进行pcr扩增，纯化扩增产物后与pgem-t easy连接，送试剂公司，测序后结果显示，获得的藜麦pds基因，
与上述网址查询的基因片段长度一致，该扩增产物可用于构建重组病毒载体。
75.将目的片段与载体进行双酶切，反向插入病毒trv2载体中。经过pcr鉴定和酶切验证，表明载体构建成功。
76.藜麦pds基因干扰片段pcr扩增电泳结果见图2。
77.1.1pds基因和ams基因的克隆：
78.按照rnaiso plus试剂盒说明书提取藜麦叶和花序的rna，反转合成cdna第一链。根据ncbi中公布的玉米pds基因序列(xm_021864666.1)和预测的藜麦ams基因序列。选择pds和ams的vigs干扰靶标片段长度分别为461bp和498bp。以藜麦叶片的cdna第一链为板，pcr扩增cqpds基因片段，分别在上下游引入bamhi和ecori酶切位点和保护碱基(扩增引物见表1)。用1％琼脂糖凝胶电泳对pcr扩增产物进行分析，根据pcr产物纯化试剂盒说明回收目的片段，将其与pgem-t easy载体连接，测序验证后再分别插入载体ptrv2中，获得重组vigs载体ptrv2-cqpds和ptrv2-cqams，测序验证正确后备用。
79.1.2vigs的载体构建：
80.pds基因和ams基因扩增片段于ptrv2载体同时采用限制性内切酶bamhi和ecori双酶切，双酶切后将酶切产物进行dna纯化，用t4 dna连接酶在16℃下连接过夜，转化大肠杆菌dh5α感受态细胞。经pcr鉴定后筛选阳性克隆进行扩大培养，提取质粒进行酶切验证，切出目的片段的载体质粒及为重组载体ptrv2-cqpds和ptrv2-cqams。
81.表1引物序列
[0082][0083]
1.3农杆菌侵染液的制备及注射侵染和共培养：
[0084]
将病毒质粒ptrv、ptrv2-cqpds、ptrv2-cqams以及ptrv2分别转化农杆菌感受态细胞。分别挑取阳性农杆菌单菌落，接种至2ml含50mg/ml卡那霉素(kan)和50mg/ml利福平
(rif)的yeb液体培养基，28℃、200r/min振荡培养16h，菌液pcr检测正确后，再将菌液以1：100的体积比转接至50mg/ml kan和50mg/ml rif的yeb液体培养基中，28℃振荡培养至od600＝0.6，将各菌液的od600值调整至一致。5000r/min离心收集后，用侵染缓冲液(50mmol/las贮存液、1mol/lmes贮存液、1mol/lmgcl2、ph 5.6)重悬农杆菌。将od600调至1.0，再按照1：1的比例混合含有病毒的ptrv1农杆菌菌液和ptrv2-cqpds、ptrv2-cqams和ptrv2的农杆菌菌液，摇晃混匀后得到vigs转化的侵染液。
[0085]
藜麦长出第一对真叶后的第十天进行注射，将含有ptrv1和ptrv2-cqpds农杆菌侵染液注射到藜麦真叶叶片内，同时将含有病毒的空载体ptrv1和ptrv2农杆菌侵染液注射的设置为对照组。将侵染后的藜麦植株先放置在暗环境下培养24h，再转换到16h/8h光暗交替条件下，培养生长21d，观察植株表型，对目的基因pds的转录水平进行检测。
[0086]
1.4qrt-pcr检测目的基因是否沉默：
[0087]
提取藜麦叶片rna，利用premix ex taqtmⅱkit反转录合成cdna作为qrt-pcr分析的模板。以藜麦的actin基因作为内参基因设置引物。对不同处理样品中的cqpds和cqams基因转录水平进行相对定量qrt-pcr分析，反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火15s，72℃延伸30s，共30个循环；72℃终延伸10min，16℃保存备用。
[0088]
trv2-pds酶切验证电泳结果见图3，trv2-pds酶切验证电泳结果见图4，质粒trv2-cqpds和质粒trv2-cqams见图5。
[0089]
2、病毒-指示基因trv-pds基因的沉默效果
[0090]
采用叶片注射法，藜麦长出第一对真叶后的第十天进行农杆菌侵染注射。观察被侵染的藜麦植株的叶片，注射ptrv2-pds农杆菌侵染液14d后，藜麦先从叶脉开始随后至叶片开始出现白化现象，在25d天时有明显漂白现象(见图6a和6b)，而注射不含菌液的重悬液的空白对照(见图6c)和注射空载体的农杆菌菌液的阴性对照(见图6d)则叶片颜色表现正常，三组处理中植株营养生长除叶面颜色差异，其它无明显差异。
[0091]
藜麦注射后的第25d统计藜麦叶片表型，在实验组中，共有44株出现了白化现象，有6株为白花表明不明显，侵染效率达到88％(n＝50)，而空白对照组藜麦因为缺乏沉默藜麦内源基因的条件未出现白化表型，接种trv2作为对照的藜麦出现叶片发轻微发黄现象，trv作为病毒载体在接种藜麦后产生感病症状，随时间延长该症状逐渐减轻至消失。
[0092]
取接种25d的藜麦叶片提取rna，转为cdna为qrt-pcr模板，检测cqpds基因在正常植株、接种trv2空载体植株和接种trv2-cqpds植株中的相对表达量。发现接种ptrv2-cqpds的藜麦植株中cqpds基因的相对表达量明显下降，而接种tvr2空载体藜麦中cqpds基因表达量下降不明显。
[0093]
在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上；术语“上”、“下”、“左”、“右”、“内”、“外”、“前端”、“后端”、“头部”、“尾部”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。此外，术语“第一”、“第二”、“第三”等仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。
[0094]
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所
作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
[0095]
[0096]