环状rnacirc_0000231的用途
技术领域
1.本发明涉及医药技术领域，尤其涉及环状rna circ_0000231的用途。


背景技术：

2.结直肠癌(colorectalcancer,crc)是世界三大常见恶性肿瘤之一，有着较高的死亡率。结直肠癌的总体5年生存率为65％，而一旦出现远处转移，5年生存率则会下降至仅有12％。因此探索新的早期诊断和治疗靶点一直以来都是结直肠癌领域的研究热点。
3.近年来随着测序技术的发进步，越来越多的circrnas被发现在肿瘤的发生、发展过程中发挥着重要作用。circrnas是一种无5'-3'和polya尾的共价闭合环状rna，广泛存在于真核细胞并参与基因的转录和转录后水平调控。目前研究表明，circrnas与结直肠癌的发生、发展、侵袭、转移等密切相关，但其具体的分子机制仍有较多不明确之处。因此针对结直肠癌的环状rna进行深入研究，筛选出能够作为诊断及治疗靶点的circrna在结直肠癌的诊治过程中有着重大临床意义。
4.目前关于环状rnahsa_circ_0000231在结直肠癌中的表达水平，作用机制及生物学作用无明确报道。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供环状rnahsa_circ_0000231的作为结直肠癌诊断标志物的用途。
6.circ_0000231是一种环状rna，其核酸序列如seq id no:4所示。其环化的核苷酸序列有794个碱基，目前关于circ_0000231在结直肠癌发生发展中的作用尚不明确。发明人通过实验研究发现，在北京大学人民医院结直肠癌患者的肿瘤组织中验证结果表明，circ_0000231在癌组织中的表达明显高于癌旁组织，提示其在结直肠癌的发生发展中可能发挥重要作用。通过体外实验发现，敲低后的circ_0000231能够抑制结直肠癌细胞增殖、迁移与侵袭。体内实验发现，敲低circdlc1后可以抑制肿瘤的生长。发明人通过机理研究发现，circ_0000231能够与mir-140-3p竞争性结合，发挥rna海绵作用，从而减少mir-140-3p作用与癌基因bcl-2的mrna的3’utr区，进而上调bcl-2的表达。结合以上实验结果及机理研究，证实了circ_0000231在结直肠癌细胞的增殖与转移中发挥至关重要的作用，因此可作为治疗结直肠癌的潜在的诊断及药物作用靶点。本发明通过rt-qpcr检测结直肠癌组织和癌旁组织中hsa_circ_0000231的表达差异情况，发现hsa_circ_0000231在结直肠癌组织中的表达明显高于癌旁组织，表明hsa_circ_0000231能够用于结直肠癌诊断。
7.因此，本发明提供了环状rnacirc_0000231作为标志物，在制备结直肠癌诊断和/或药物筛选的试剂中的应用。本发明所述环状rna circ_0000231为hsa_circ_0000231。
8.本发明还提供了一种结直肠癌的诊断和/或药物筛选试剂，其包括检测环状rna circ_0000231的引物对。
9.一些实施例中，对设计获得的引物对进行了筛选，最终确定灵敏度、特异性皆最高
的引物对进行检测。所述引物对包括：seq id no:1所示核酸序列的上游引物和seq id no:2所示核酸序列的下游引物。
10.本发明所述的试剂中，还包括rna提取试剂、逆转录试剂、rt-pcr扩增试剂中至少一种。
11.本发明提供了一种结直肠癌的诊断方法，其包括以本发明所述的试剂，检测患者的肿瘤组织中circ_0000231的表达水平。该方法还包括对患者癌旁组织中circ_0000231的表达水平的检测。所述肿瘤组织中circ_0000231的表达水平显著高于癌旁组织，则患结直肠癌的风险较高。
12.本发明还提供了一种防治结直肠癌的药物筛选的方法，其包括以本发明所述的试剂检测细胞模型或动物模型肿瘤组织中的circ_0000231的表达水平，给药后circ_0000231的表达水平显著降低的药物，存在潜在的防治结直肠癌的作用。
13.本发明还提供了环状rnacirc_0000231的抑制剂，在制备预防和/或治疗结直肠癌的药物中的应用。
14.本发明所述药物的功能包括抑制结直肠癌细胞的增殖、抑制结直肠癌细胞的迁移与侵袭能力。
15.本发明通过将hsa_circ_0000231干扰序列构建到慢病毒载体上，以建立敲低该基因的稳转细胞株，通过cck8、平板克隆增殖实验发现在hsa_circ_0000231敲低后，结直肠癌细胞增殖能力受到明显抑制，通过transwell、细胞划痕迁移与侵袭实验可证实，hsa_circ_0000231敲低后，结直肠癌细胞迁移与侵袭能力受到明显抑制；因此，hsa_circ_0000231能够作为治疗靶点应用于结直肠癌的治疗；本发明通过构建裸鼠皮下肿瘤模型检验了hsa_circ_0000231敲低后对裸鼠体内结直肠癌细胞增殖能力的影响，证明敲低hsa_circ_0000231能够在动物体内起到抑制结直肠癌细胞增殖的作用。
16.因此，本发明还提供了一种治疗结直肠癌的药物，其包括环状rna circ_0000231的抑制剂。
17.所述环状rnahsa_circ_0000231的抑制剂为hsa_circ_0000231的干扰序列。经过反复筛选，效果最优的所述hsa_circ_0000231的干扰序列如seq id no:3所示。
18.一些实施例中，所述药物的剂型为注射剂，包括脂质体包裹的hsa_circ_0000231的干扰序列。
19.本发明还提供了一种治疗结直肠癌的方法，其为给予本发明所述的药物。
20.本发明研究表明circ_0000231在人结直肠癌组织中的表达水平与癌旁组织存在显著性差异。提供了以circ_0000231作为标志物的人结直肠癌诊断试剂和药物筛选方法。本发明通过功能试验、动物实验验证circ_0000231对于结直肠癌细胞增殖、迁移存在抑制作用。提供了circ_0000231的抑制剂作为结直肠癌治疗药物的应用。
附图说明
21.图1为本发明一个实施例中rt-qpcr检测结直肠癌组织和癌旁组织中circ_0000231的表达结果对比图；
22.图2为本发明一个实施例中敲低circ_0000231的结直肠癌细胞株与对照细胞系的细胞增殖曲线示意图，其中横坐标为天数，纵坐标为酶标仪检测的450nm的吸光值；
23.图3为本发明一个实施例中细胞侵袭和迁徙实验结果图；
24.图4为本发明一个实施例中敲低circ_0000231对裸鼠体内结直肠癌肿瘤增殖的影响。
具体实施方式
25.本发明提供了环状rnahsa_circ_0000231的用途，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
26.本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
27.本发明所涉及的技术为分子克隆常规技术手段，其中涉及的酶、引物、试剂以及反应条件在未作说明的情况下均可根据本领域技术人员的经验进行合理选择，其中涉及试剂耗材属于市售的普通产品，其中涉及的检测手段以及仪器均为本领域技术人员所熟知并熟练掌握。
28.本发明所有统计分析均使用spss 20.0软件进行。适当地进行了student t检验，wilcoxon符号秩检验。p值小于0.05表示具有统计学意义。
29.下面结合实施例，进一步阐述本发明：
30.实施例1：
31.筛选扩增hsa_circ_0000231的特异性引物对：
32.1.细胞总rna提取及浓度测定
33.(1)待6孔板细胞超过90％时，弃掉旧的培养液，用pbs清洗一次后，每孔加入0.5mltrizol，然后转移至1.5mlep管；
34.(2)将ep管在室温条件下放置5分钟，以便核酸蛋白复合物充分分离；
35.(3)在ep管内添加0.1ml氯仿，震荡大约10s，然后在室温条件下放置5min；氯仿是非极性分子，能有效抑制rna酶活性，当加入trizol的细胞溶液和氯仿混合时，蛋白质的水分子被氯仿去掉，使蛋白失去水和状态而变性，加速水相和有机相的分离；
36.(4)12000g，4℃离心15min，此时ep管溶液分为3层，底层为红色有机物，上层为无色水相，rna存在于水相中；
37.(5)将上层液(约200ul)转移至新的ep管内，然后加入相同体积的异丙醇，室温条件下放置10min；异丙醇可吸收rna周围水分，使其沉淀；
38.(6)12000g，4℃离心10min，离心后可在管底和管侧看到白色rna沉淀物，弃掉上清液；
39.(7)将rna沉淀用75％depc-乙醇溶液洗涤，7500g，4℃离心5min，弃掉上清液；
40.(8)将rna沉淀置于生物安全柜中5min，晾干后加入20微升depc水溶解rna，该步骤在冰上操作；
41.(9)用scandrop100超微量核酸测定仪检测细胞总rna纯度和浓度。
42.2.cdna逆转录
43.在冰上进行逆转录反应体系配制(以10μl体系为例)，配制完成后加入已准备好的
细胞总rna进行逆转录，所述逆转录反应体系为：
[0044]5×
primescript rt master mix
ꢀꢀꢀ
2ul
[0045]
total rna
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
500ng
[0046]
rnase free dh2o
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
up to 10ul
[0047]
逆转录反应条件如下：
[0048]
在37℃下反应15分钟，之后在85℃下反应5秒。降温至4℃后，将反应得到的cdna稀释10倍，之后置于-20℃冰箱保存。
[0049]
3.引物设计
[0050]
利用网页primer 3.0设计引物，再用ncbi blast验证。
[0051]
引物的设计原则如下：(1)引物gc含量在50-60％；(2)引物长度为17-25bp；(3)引物tm在57-63℃；(4)引物的位置避开目的序列的三级结构；(5)避免g或c碱基重复次；(6)避免引物末端碱基为a；(7)引物及产物避免形成二级结构；(8)产物长度在100-150bp之间；(9)产物避免有4个单碱基重复。
[0052]
通过上述设计原则，共设计出引物10对，引物对由上海生工生物工程有限公司合成，根据实际检测效果，最终采用特异性、准确性、灵敏度皆最优的引物对序列如下：
[0053]
f：5'-gattccgcaggagaaggctc-3'(seq id no:1)
[0054]
r：5'-ggctttatggcttgttggatga-3'(seq id no:2)
[0055]
实施例2
[0056]
本实施例中，通过荧光定量rt-qpcr检测hsa_circ_0000231在结直肠癌组织和对应的癌旁组织中的表达差异，发现hsa_circ_0000231在结直肠癌组织中的表达明显高于癌旁组织，表明hsa_circ_0000231能够用于结直肠癌诊断。
[0057]
具体实验方案如下：
[0058]
1.组织总rna提取及浓度测定
[0059]
经北京大学人民医院伦理审查委员会批准，根据委员会的政策向每位患者提供书面知情同意书，在患者完全知情并签署知情同意书后，收集在北京大学人民医院进行根治性手术切除后的110例结直肠癌组织和配对的正常癌旁组织。样本在临床收集时放置于液氮罐中保存，后转移至北京大学人民医院生物样本库实验-80℃冰箱中保存。
[0060]
组织总rna提取及浓度测定实验包括以下步骤：
[0061]
(1)取1.5mlep管加入1mltrizol，先用研钵装上液氮预冷，从-80℃冰箱中取出黄豆大小组织放入研钵中研磨成粉，将组织粉末转移到ep管中；
[0062]
(2)将ep管在室温条件下放置约10分钟，以便核酸蛋白复合物能够充分分离；
[0063]
(3)在ep管内添加0.2ml的氯仿，震荡大约10s，然后在室温条件下放置5min；
[0064]
(4)12000g，4℃离心15min，此时ep管溶液分为3层，底层为红色有机物，上层为无色水相，rna存在于水相中；
[0065]
(5)将上层液(约450ml)转移至新的ep管内，然后加入相同体积的异丙醇，室温条件下放置10min；
[0066]
(6)12000g，4℃离心10min，离心后可在管底和管侧看到白色rna沉淀物，弃掉上清液；
[0067]
(7)将rna沉淀用75％depc-乙醇溶液洗涤，7500g，4℃离心5min，弃掉上清液；
[0068]
(8)将rna沉淀置于生物安全柜中5min，晾干后加入20μldepc水溶解rna，该步骤在冰上操作；
[0069]
(9)用scandrop100超微量核酸测定仪检测rna纯度和浓度。
[0070]
2.qpcr扩增实验
[0071]
采用实施例1中的cdna逆转录反应进行组织rna逆转录。
[0072]
在冰上进行pcr反应体系配制(以10μl体系为例)，配制完成后再加入已逆转录得到的cdna模板。其中，pcr反应体系为：
[0073][0074]
用于扩增hsa_circ_0000231的引物对采用实施例1中优选的引物对：
[0075]
f：5'-gattccgcaggagaaggctc-3'
[0076]
r：5'-ggctttatggcttgttggatga-3'
[0077]
反应条件包括：
[0078]
第一步：预变性
[0079]
95℃，30秒；
[0080]
第二步：pcr反应(40个循环)
[0081]
95℃，5秒；60℃，15秒；
[0082]
第三步：融解曲线分析
[0083]
65℃，5秒；95℃，5秒。
[0084]
pcr扩增后进行定量分析。目标基因的相对表达量计算公式为：2
‑△△
ct＝2-【(
△
ct)test-(
△
ct)control】。其中，
△
ct＝ct目的-ct管家，ct目的为目标基因ct值，ct管家为管家基因ct值，
△
ct表示各样本目的基因相对管家基因的相ct值，
△△
ct＝(
△
ct)test-(
△
ct)control，表示处理组相对对照组进行归一化，表示处理组相对对照组的相对表达量，表示目标基因相对表达倍数。
[0085]
上述qpcr实验结果如图1表明，110对结直肠癌临床组织样本中hsa_circ_0000231的表达结果显示，hsa_circ_0000231在结直肠癌组织(tumor tissue)中的表达明显高于其癌旁组织(normaltissue)，表明hsa_circ_0000231在结直肠癌发生发展中有重要意义，可以作为结直肠细胞癌患者的理想预后标志物，并能够在结直肠癌诊断中产生积极作用。
[0086]
实施例3：
[0087]
本实施例中，通过将hsa_circ_0000231干扰序列(si-circ_0000231 5
’‑
actgaacagataagggttt-3’,seq id no:3)构建到环状rna专用的慢病毒载体上，以建立敲低hsa_circ_0000231的稳转细胞株，通过cck8、平板克隆增殖实验发现在hsa_circ_0000231敲低后，结直肠癌细胞增殖能力受到明显抑制，通过transwell与细胞划痕迁移与侵袭实验可证实，hsa_circ_0000231敲低，结直肠癌细胞迁移与侵袭能力受到明显抑制；上述实验表
明，hsa_circ_0000231能够作为治疗靶点应用于结直肠癌的治疗。
[0088]
具体实验方案如下：
[0089]
1.慢病毒感染
[0090]
(1)将冻存在-80℃的慢病毒取出，放置在冰上待其融化；
[0091]
(2)取出提前一天铺好拟感染细胞的24孔板，弃掉旧培养液；
[0092]
(3)向每个孔中加入0.5mlpbs进行洗涤，待充分浸润后弃掉pbs，重复操作1次；
[0093]
(4)向每个孔中加入0.5ml新鲜dmem培养液；
[0094]
(5)加入适量病毒液，轻轻混合均匀，然后放置于37℃，5％co2的恒温培养箱中进行培养；
[0095]
(6)感染12-16小时后，去掉含有病毒的培养基，加入0.5mlpbs进行洗涤，待充分浸润后弃掉pbs，重复操作1次，再向每个孔中加入0.5ml新鲜dmem培养液，置于37℃，5％co2恒温培养箱进行培养；
[0096]
(7)感染48小时后在倒置荧光显微镜下观察绿色荧光判断感染效率。
[0097]
利用嘌呤霉素筛选稳定感染细胞株：
[0098]
(1)24小时后再次弃掉24孔板中的旧培养基，每孔加入0.5mlpbs进行洗涤，待充分浸润后弃掉pbs，重复操作1次；
[0099]
(2)每孔加入0.5ml0.25％的胰酶溶液，轻轻晃动后置于37℃孵箱，显微镜下观察细胞皱缩变圆时，弃去胰酶，加入1ml新鲜dmem培养液反复冲洗瓶壁上的细胞使之完全脱落，混匀细胞悬液；
[0100]
(3)取250μl细胞悬液转移到到新的24孔板，依次加4个孔；
[0101]
(4)每个孔补加500μl新鲜dmem培养液后置于37℃，5％co2恒温培养箱进行培养；
[0102]
(5)24小时后再次弃掉24孔板中的旧培养基，每孔加入0.5mlpbs进行洗涤，待充分浸润后弃掉pbs，重复操作1次，再加入0.5ml新鲜dmem培养液；
[0103]
(6)按照0.5μg/ml，1.0μg/ml，2.0μg/ml，5.0μg/ml的浓度的向4个孔中依次加入嘌呤霉素原液后混匀，置于37℃，5％co2恒温培养箱进行培养；
[0104]
(7)观察每个孔中细胞的生长和死亡情况，选择死亡细胞较少的孔进行扩大培养，同时在倒置荧光显微镜下确认感染效率为100％；
[0105]
(8)将扩大培养后的稳转细胞株进行传代及保种。
[0106]
2.cck-8细胞增殖实验
[0107]
活细胞线粒体中的脱氢酶可以与cck-8化合物相互反应，最终将其还原成亲水溶性甲瓒染料，溶解后呈黄色，生成的黄色甲瓒数量与活细胞的数量呈正相关，也即活细胞数量越多，溶液的黄色程度越高。因此利用这一特征进行细胞增殖检测。
[0108]
(1)在96孔板中每孔接种3000的过表达hsa_circ_0000231的细胞株和空载体细胞株；
[0109]
(2)分别于1、2、3、4天在对应区域孔中加入10μl的cck-8试剂；
[0110]
(3)放置到37℃，5％co2的恒温培养箱进行培养，时间约为2小时；
[0111]
(4)最后用酶标仪在450nm处测定吸光值。
[0112]
实验结果见如图2，其中，sh-nc为感染空载体的对照细胞株，sh-circ_0000231为敲低circ_0000231的细胞株。由图2可知，在circ_0000231敲低后，结直肠癌细胞增殖能力
受到明显抑制，结直肠癌细胞增殖速度明显减慢。
[0113]
3.细胞侵袭实验
[0114]
(1)选择孔径为8μm的小室，将泡在75％乙醇中的小室在生物安全柜中用pbs清洗后紫外照射2h，将所有枪尖放在冰箱中预冷；
[0115]
(2)稀释基质胶，按基质胶:dmem无血清培养基＝1:5进行稀释，该步骤在冰上进行；
[0116]
(3)将基质胶均匀的铺在小室的膜上，标记后用于侵袭实验；
[0117]
(4)将小室放在24孔板中，放入37℃培养箱中让基质胶凝固；
[0118]
(5)采用细胞传代的方法制备细胞悬液，用不含有血清的培养基重悬细胞，然后用细胞计数板进行计数，并计算出细胞浓度；
[0119]
(6)在含有基质胶的小室接种5
×
104个细胞(迁移实验接种3
×
104细胞)，小室中加入500μl无血清dmem高糖培养基；
[0120]
(7)在24孔板加入600μl有血清培养基，将小室转移至24孔板中，置于37℃，5％co2孵箱中培养，24h后做检测；
[0121]
(8)将24孔板取出，吸走小室中的液体，用棉签将小室内的细胞和基质胶擦掉；
[0122]
(9)在小室和24孔板加入500μlpbs，清洗小室2次；
[0123]
(10)在24孔板中加入500μl4％多聚甲醛，将小室放入装有多聚甲醛的孔中，室温恒定20min；
[0124]
(11)固定后，在干净的24孔板中加入500μlpbs清洗2次，晾干小室后进行染色；
[0125]
(12)在24孔板中加入500μl结晶紫进行染色10min；
[0126]
(13)染完色后，用镊子将小室提起在pbs中轻轻涮一下，晾干后采图。
[0127]
实验结果见图3，证明敲低circ_0000231的细胞株相较于空载体的对照组细胞株，结直肠癌细胞的迁移与侵袭能力受到明显抑制。
[0128]
实施例4：
[0129]
本实施例中，通过构建裸鼠皮下肿瘤模型，检验了敲低circ_0000231对裸鼠体内结直肠癌细胞增殖能力的影响。
[0130]
本实施例采用4到6周的雌性裸鼠进行实验，裸鼠均购自北京维通利华实验动物有限公司。
[0131]
1.敲低circ_0000231抑制结直肠癌细胞在裸鼠体内的增殖
[0132]
将实施例3中稳定敲低circ_0000231的结直肠癌细胞株和对照细胞株接种到裸鼠血供丰富区域的腋窝中后部。接种后，每周测量一次肿瘤体积(v＝1/2
×a×
b2，a为长轴，b为短轴)，游标卡尺测量肿瘤最长和最短部位，绘制肿瘤体积增长曲线发现，敲低circ_0000231的sh-circ_0000231组肿瘤体积增长速度明显慢于对照组sh-nc。18天后处死裸鼠，取出肿瘤前、后拍照。如图4所示，敲低circ_0000231的sh-circ_0000231组的肿瘤体积明显小于对照组sh-nc的肿瘤体积，sh-circ_0000231组的肿瘤的增长速度也明显低于对照组。以上实验说明circ_0000231过表达后，结直肠癌细胞在裸鼠皮下的成瘤能力明显下降。
[0133]
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。