1.本发明属于多糖制备领域，具体涉及一种铁皮石斛多糖的化学降解方法。


背景技术：

2.铁皮石斛(学名:dendrobium officinale)为兰科石斛属植物，其叶为两列长圆状披针形，茎不分支，具多节。铁皮石斛常以新鲜或干燥茎入药，具有滋阴清热、生津益胃、润肺止咳、明目强身等功效，是传统名贵中药材。
3.铁皮石斛多糖是铁皮石斛中的主要活性成分，含量范围多在10-49％内，为一种水溶性杂多糖，多以α、β-(1
→
4)糖苷键连接葡萄糖和半乳糖构成。铁皮石斛多糖具有增强免疫、抗肿瘤、降血糖、抗氧化等生理活性，具有重要的食用及药用价值。
4.但是，多糖的生物吸收率很低，经口摄取后肠胃吸收率低于5％。当前的研究很多是基于细胞实验，忽略了吸收率低这一问题，而注射方式有诸多的安全性问题。所以，降低多糖的分子量、提高消化系统吸收率、提高或保持其生理活性，是多糖研究的热点。
5.目前针对铁皮石斛多糖的降解主要有物理降解法、化学降解法和生物降解法。物理降解法主要包括超声降解法和微波降解法，无需引入其他反应物，操作简单，但反应时间长、降解效率较低，若要提高降解效率可通过与酸降解等其他降解方法相结合(专利号：cn200510008708.2)。生物降解法主要为酶降解法，其反应条件温和，专一性强，例如氧化水解酶可有效降解纤维素及壳聚糖(专利号：cn201710735196.2)。化学降解法主要包括酸降解法和过氧化氢降解法，反应体系简单，时间短；但是其应用限制因素在于某些制剂有毒有害，限制了其在食品中的应用。酸降解法一般采用盐酸或硫酸水解多糖分子糖苷键，致使多糖分子量降低，其反应简便易行，如用三氟乙酸水解猴头菌多糖可使其分子量降低一个数量级(专利号：cn201711088514.7)。过氧化氢降解法利用氧化还原反应氧化降解多糖，成本较低。曲爱琴等人(专利号：cn1459455a)发明的多糖的自由基降解方法是将多糖置于有机酸、过氧化氢与维生素c的复合体系中，适用于绝大多数来源的多糖，但反应时间为2-72小时，溶液浓度均在1-100mmol/l范围内，反应时间长所需浓度高。


技术实现要素：

6.针对上述技术问题，本发明的目的在于提供一种铁皮石斛多糖的化学降解方法，采用二乙烯三胺五乙酸(dtpa)螯合亚铁离子与过氧化氢反应形成fenton体系，产生的羟基自由基氧化降解铁皮石斛多糖，本发明提供的降解方法工艺简单，且采用该方法处理铁皮石斛多糖后能够降低其分子量，提高其抗氧化能力，利于后续铁皮石斛多糖的利用。
7.本发明是通过以下技术方案实现的：
8.一种铁皮石斛多糖的化学降解方法，以二乙烯三胺五乙酸螯合的亚铁离子和过氧化氢反应形成fenton体系，利用所述fenton体系产生的羟基自由基氧化降解铁皮石斛多糖，得到降解粗产物溶液，对所述降解粗产物溶液调整ph，以沉淀去除铁离子，醇沉烘干后获得铁皮石斛降解多糖。
9.进一步地，所述方法具体以下步骤：
10.(1)将铁皮石斛多糖溶于水，得到铁皮石斛多糖溶液；
11.(2)向所述铁皮石斛多糖溶液中加入二乙烯三胺五乙酸螯合的亚铁离子(即dtpa-亚铁离子)，然后再加入过氧化氢溶液，形成fenton体系，室温下进行氧化反应降解铁皮石斛多糖，得到降解粗产物溶液；
12.(3)调节所述降解粗产物溶液的ph，弃沉淀，得到铁皮石斛多糖降解液；
13.(4)所述铁皮石斛多糖降解液进行醇沉，弃液相，烘干沉淀，得到铁皮石斛降解多糖。
14.进一步地，所述铁皮石斛多糖的分子量在2
×
10
7-1.5
×
105da范围内；所述铁皮石斛降解多糖分子量在5
×
10
4-1.5
×
104da之间。
15.进一步地，步骤(1)中，所述铁皮石斛多糖溶液的浓度为1-10mg/ml。
16.进一步地，步骤(2)具体为：
17.向铁皮石斛多糖溶液中加入二乙烯三胺五乙酸螯合的亚铁离子，直至铁皮石斛多糖溶液中dtpa-亚铁离子浓度为5-20μm/l；再加入过氧化氢溶液至铁皮石斛粗多糖水溶液中过氧化氢的体积比浓度为0.05-0.5％；室温下进行氧化反应降解铁皮石斛多糖，反应一定时间后得到降解粗产物溶液。
18.在该步骤中，需要严格控制dtpa-亚铁离子浓度为5-20μm/l、过氧化氢的体积比浓度为0.05-0.5％，正是通过控制fenton体系中dtpa-亚铁离子浓度和过氧化氢的体积比浓度，才能够获得分子量在5
×
10
4-1.5
×
104da之间的铁皮石斛降解多糖，同时能够确保铁皮石斛多糖不被过度降解为单糖。
19.优选地，选用的铁皮石斛多糖浓度为2mg/ml，铁皮石斛多糖溶液中dtpa-亚铁离子浓度为5μm/l，过氧化氢溶液的体积比浓度为0.1％。
20.本发明所述方法采用二乙烯三胺五乙酸(dtpa)为一种重要的氨羧螯合剂，对金属离子尤其是高价态显色金属离子的配位能力极强，广泛应用于医用药剂中，螯合必需微量元素后可促进体内重金属毒物的排出。dtpa对过渡金属形成的螯合物的稳定性及抗氧化作用均优于乙二胺四乙酸(edta)，可有效络合fenton反应中使用的亚铁离子，以降低反应过程中亚铁离子被氧化为三价铁离子的可能性。
21.进一步地，步骤(2)中，步骤(2)中，调节铁皮石斛多糖溶液ph至3.0-4.0后再加入二乙烯三胺五乙酸螯合的亚铁离子。
22.进一步地，步骤(2)中，降解时间为降解时间为10-20min。
23.进一步地，步骤(3)中，调节所述降解粗产物溶液的ph为9.0-10.0。
24.进一步地，步骤(4)中，步骤(4)中，所述醇沉的温度为3-5℃、醇沉的时间为6-18h。
25.本发明的有益技术效果：
26.1)本发明所提供的降解方法采用fenton体系降解铁皮石斛多糖，具有降解时间短、成本低等优势，且可以显著降低铁皮石斛多糖分子量。本发明中采用的fenton体系包括二乙烯三胺五乙酸螯合的亚铁离子和过氧化氢，其中，过氧化氢分解作为反应底物，产生的羟基自由基攻击铁皮石斛多糖分子以达到降低多糖分子量的效果；亚铁离子作为催化剂参与过氧化氢分解，以达到快速降解的效果；dtpa作为金属离子螯合剂螯合亚铁离子以增强其稳定性，降低被氧化的可能，同时螯合氧化产生的三价铁离子，避免干扰反应。
27.2)本发明所提供降解方法制备获得的铁皮石斛降解多糖的抗氧化活性相较于传统水提醇沉法多糖明显提高。
附图说明
28.图1为本发明实施例中铁皮石斛多糖dp的及铁皮石斛降解多糖dp-1、dp-2、dp-3的高效液相色谱图。
29.图2a为本发明实施例中铁皮石斛多糖dp及铁皮石斛降解多糖dp-1对三价铁离子的还原能力图；图2b为本发明实施例中铁皮石斛多糖dp及铁皮石斛降解多糖dp-1的dpph自由基清除能力图；图2c为本发明实施例中铁皮石斛多糖dp及铁皮石斛降解多糖dp-1的羟基自由基清除能力图；图2d为为本发明实施例中铁皮石斛多糖dp及铁皮石斛降解多糖dp-1的总抗氧化能力图。
具体实施方式
30.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细描述。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。
31.相反，本发明涵盖任何由权利要求定义的在本发明的精髓和范围上做的替代、修改、等效方法以及方案。进一步，为了使公众对本发明有更好的了解，在下文对本发明的细节描述中，详尽描述了一些特定的细节部分。对本领域技术人员来说没有这些细节部分的描述也可以完全理解本发明。
32.本发明提供一种铁皮石斛多糖的化学降解方法，以二乙烯三胺五乙酸螯合的亚铁离子和过氧化氢反应形成fenton体系，利用所述fenton体系产生的羟基自由基氧化降解铁皮石斛多糖，得到降解粗产物溶液，对所述降解粗产物溶液调整ph，以沉淀去除铁离子，醇沉烘干后获得铁皮石斛降解多糖。所述方法具体包括以下步骤：
33.(1)将铁皮石斛多糖溶于水，得到铁皮石斛多糖溶液；所述铁皮石斛多糖溶液的浓度为1-10mg/ml，优选浓度为2mg/ml。
34.(2)向铁皮石斛多糖溶液中加入二乙烯三胺五乙酸螯合的亚铁离子，直至铁皮石斛多糖溶液中dtpa-亚铁离子浓度为5-20μm/l；再加入过氧化氢溶液至铁皮石斛粗多糖水溶液中过氧化氢的体积浓度比为0.05-0.5％；室温下进行氧化反应降解铁皮石斛多糖，反应一定时间后得到降解粗产物溶液；降解时间为10-20min；
35.优选地，选用的铁皮石斛多糖浓度为2mg/ml，dtpa-亚铁离子浓度为5μm/l，过氧化氢溶液的体积比浓度为0.1％。
36.(3)调节所述降解粗产物溶液的ph为9-10，弃沉淀，得到铁皮石斛多糖降解液；
37.(4)所述铁皮石斛多糖降解液进行醇沉，弃液相，烘干沉淀，得到铁皮石斛降解多糖。在本实施例中，所述醇沉的温度为3-5℃、醇沉的时间为6-18h。
38.下面以具体实施例进行说明：
39.对照实施例
40.本对照实施例提供一种热水浸提法提取铁皮石斛多糖的方法：
41.称取烘干、粉碎、过60目筛的铁皮石斛粉末0.500g，加入25ml80％乙醇，涡旋震荡
混匀，150w超声提取30min，6000r/min离心，取沉淀，用10ml80％乙醇洗涤离心2-3次，至上清无色；将沉淀以料液比1:100条件沸水提取2h，抽滤，减压浓缩，加入4倍体积乙醇过夜醇沉，离心，烘干，即得铁皮石斛多糖dp。
42.实施例1
43.本实施例提供一种铁皮石斛多糖的化学降解方法，所述方法包括：
44.a)按照对照实施例的方法制备铁皮石斛多糖dp；
45.b)采用二乙烯三胺五乙酸(dtpa)溶液螯合亚铁离子，获得二乙烯三胺五乙酸螯合的亚铁离子，即dtpa-亚铁离子；
46.c)将步骤a)制备的铁皮石斛粗多糖dp配制为浓度为2mg/ml的铁皮石斛多糖水溶液，调节ph至3.0；再加入dtpa-亚铁离子，至铁皮石斛多糖水溶液中dtpa-亚铁离子浓度为5μm/l；再加入1％过氧化氢溶液至铁皮石斛多糖水溶液中过氧化氢浓度为0.1％；室温下进行氧化反应；
47.d)反应20分钟后，调反应液ph值至9.0，离心除去沉淀；
48.e)将上清液调ph至中性，减压浓缩，烘干，得铁皮石斛多糖自由基降解产物dp-1。
49.采用超纯水复溶，经0.22μm nylon膜过滤进行高效液相色谱分析。
50.本实施例中，所采用色谱柱为c18柱(4.6
×
250mm，5μm)，流动相为100％超纯水，流速1ml/min，柱温30℃，进样量20μl，运行时间15min。运行结束后依据保留时间与标准品进行比较。
51.实施例2
52.本实施例提供一种铁皮石斛多糖的化学降解方法，与实施例1基本相同，唯不同之处在于：步骤d)中，所述反应时间为10min；得铁皮石斛多糖降解产物dp-2。
53.实施例3
54.本实施例提供一种铁皮石斛多糖的化学降解方法，与实施例1基本相同，唯一不同之处在于：步骤c)中，所述dtpa-亚铁离子替换为亚铁离子：加入亚铁离子，至铁皮石斛多糖水溶液中亚铁离子浓度为5μm/l。最终得到铁皮石斛多糖降解产物dp-3。
55.图1为铁皮石斛多糖dp及铁皮石斛降解多糖dp-1、dp-2和dp-3的高效液相色谱图，由图1可知：采用高效液相色谱分析dp、dp-1、dp-2、dp-3的分子量，确定dp主要由四种分子量的多糖组成，分别为2.4
×
107da、1.9
×
106da、1.3
×
106da、1.5
×
105da；dp-1主要由两种分子量多糖组成，分别为4.7
×
104da和1.6
×
104da，降解后多糖分子量显著低于降解前多糖分子量，且分子量分布更为集中。dp-2与dp-1分子量基本一致，但相较于dp-1，其低分子量多糖比例较低。dp-3主要由两种分子量的多糖组成，分别为8.5
×
105da、2.0
×
104da。降解后铁皮石斛多糖分子量显著低于降解前多糖分子量，但相比于螯合亚铁离子和过氧化氢氧化降解铁皮石斛多糖，降解后分子量较高，低分子量多糖占比较少。
56.图2为铁皮石斛多糖dp及铁皮石斛降解多糖dp-1的抗氧化活性图，图2a为对三价铁离子的还原能力图，图2b为dpph自由基清除能力图，图2c为羟基自由基清除能力图，图2d为总抗氧化能力图。由图2a-d可知，降解后的铁皮石斛多糖dp-1的抗氧化能力均高于未降解的铁皮石斛多糖dp，在3.0mg/ml浓度下，dp-1的总抗氧化能力约为dp的2.6倍；其中抗氧化能力提高最明显的为dpph自由基清除能力，在0.5mg/ml浓度下，dp-1的总抗氧化能力约为dp的5.7倍。