结合cd33的多肽及其用途
相关申请的交叉引用
1.本技术要求2019年5月4日提交的美国临时申请号62/843,408和2019年5月7日提交的美国临时申请号62/844,359的优先权权益，将所述临时申请中的每一个出于任何目的通过引用以其整体并入本文。
技术领域
2.本发明涉及结合cd33的多肽，以及使用结合cd33的多肽调节cd33的生物活性的方法。此类方法包括但不限于治疗癌症的方法。


背景技术：

3.cd33(也称为p67、siglec3或siglec-3)结合唾液酸，并且调节造血细胞的炎性和免疫反应。cd33还可以影响多种血液癌症的开始、增殖和进展。例如，超过85％的急性髓性白血病(aml)病例表达cd33抗原。因此，cd33是用于血液癌症(诸如白血病)的靶向疗法的合适肿瘤相关抗原。因此，存在对于更有效的cd33拮抗剂的治疗性需要。


技术实现要素：

4.本文提供了结合cd33的多肽和使用结合cd33的多肽治疗例如白血病的方法。在一些实施方案中，结合cd33的多肽包含至少一个vhh结构域。下文提供了一些实施方案。实施方案1.一种包含至少一个vhh结构域的多肽，所述至少一个vhh结构域结合cd33并且包含含有seq id no:47、3、7、11、15、19、23、27、31、35、50、53、56、59、62、65、68或71的氨基酸序列的cdr1；含有seq id no:48、4、8、12、16、20、24、28、32、36、51、54、57、60、63、66、69或72的氨基酸序列的cdr2；和含有seq id no:49、5、9、13、17、21、25、29、33、37、52、55、58、61、64、67、70或73的氨基酸序列的cdr3。实施方案2.根据实施方案1所述的多肽，其中至少一个vhh结构域包含含有seq id no:47或3的氨基酸序列的cdr1；含有seq id no:48或4的氨基酸序列的cdr2；和含有seq id no:49或5的氨基酸序列的cdr3。实施方案3.根据实施方案1或实施方案2所述的多肽，其中至少一个vhh结构域包含含有seq id no:7的氨基酸序列的cdr1；含有seq id no:8的氨基酸序列的cdr2；和含有seq id no:9的氨基酸序列的cdr3。实施方案4.根据实施方案1-3中任一项所述的多肽，其中至少一个vhh结构域包含含有seq id no:11或50的氨基酸序列的cdr1；含有seq id no:12或51的氨基酸序列的cdr2；和含有seq id no:13或52的氨基酸序列的cdr3。实施方案5.根据实施方案1-4中任一项所述的多肽，其中至少一个vhh结构域包含含有seq id no:15、53或56的氨基酸序列的cdr1；含有seq id no:16、54或57的氨基酸序列的cdr2；和含有seq id no:17、55或58的氨基酸序列的cdr3。实施方案6.根据实施方案1-5中任一项所述的多肽，其中至少一个vhh结构域包含
含有seq id no:19或59的氨基酸序列的cdr1；含有seq id no:20或60的氨基酸序列的cdr2；和含有seq id no:21或61的氨基酸序列的cdr3。实施方案7.根据实施方案1-6中任一项所述的多肽，其中至少一个vhh结构域包含含有seq id no:23或62的氨基酸序列的cdr1；含有seq id no:24或63的氨基酸序列的cdr2；和含有seq id no:25或64的氨基酸序列的cdr3。实施方案8.根据实施方案1-7中任一项所述的多肽，其中至少一个vhh结构域包含含有seq id no:27或65的氨基酸序列的cdr1；含有seq id no:28或66的氨基酸序列的cdr2；和含有seq id no:29或67的氨基酸序列的cdr3。实施方案9.根据实施方案1-8中任一项所述的多肽，其中至少一个vhh结构域包含含有seq id no:31或68的氨基酸序列的cdr1；含有seq id no:32或69的氨基酸序列的cdr2；和含有seq id no:33或70的氨基酸序列的cdr3。实施方案10.根据实施方案1-9中任一项所述的多肽，其中至少一个vhh结构域包含含有seq id no:35或71的氨基酸序列的cdr1；含有seq id no:36或72的氨基酸序列的cdr2；和含有seq id no:37或73的氨基酸序列的cdr3。实施方案11.根据实施方案1-10中任一项所述的多肽，其中至少一个vhh结构域包含分别含有以下的氨基酸序列的cdr1、cdr2和cdr3：seq id no:47、48和49；seq id no:3、4和5；seq id no:7、8和9；seq id no:11、12和13；seq id no:15、16和17；seq id no:19、20和21；seq id no:23、24和25；seq id no:27、28和29；seq id no:31、32和33；seq id no:35、36和37；seq id no:50、51和52；seq id no:53、54和55；seq id no:56、57和58；seq id no:59、60和61；seq id no:62、63和64；seq id no:65、66和67；seq id no:68、69和70；或seq id no:71、72和73。实施方案12.根据实施方案1-11中任一项所述的多肽，其中至少一个vhh结构域是人源化的。实施方案13.根据实施方案1-12中任一项所述的多肽，其中至少一个vhh结构域包含与seq id no:38、114、39、40、41、42、43、44、45、46、115、116、117、118、119、120、121或122的氨基酸序列至少85％、至少90％、至少95％或至少99％相同的氨基酸序列。实施方案14.根据实施方案1-12中任一项所述的多肽，其中至少一个vhh结构域包含seq id no:38、114、39、40、41、42、43、44、45、46、115、116、117、118、119、120、121或122的氨基酸序列。实施方案15.根据实施方案1-12中任一项所述的多肽，其中至少一个vhh结构域包含与seq id no:2、6、10、14、18、22、26、30、34、123、124、125、126、127、128、129、130或131的氨基酸序列至少85％、至少90％、至少95％或至少99％相同的氨基酸序列。实施方案16.根据实施方案1-12中任一项所述的多肽，其中至少一个vhh结构域包含seq id no:2、6、10、14、18、22、26、30、34、123、124、125、126、127、128、129、130或131的氨基酸序列。实施方案17.根据实施方案1-16中任一项所述的多肽，所述多肽包含两个vhh结构域。实施方案18.根据实施方案1-16中任一项所述的多肽，所述多肽包含三个vhh结构域。
实施方案19.根据实施方案1-18中任一项所述的多肽，其中所述多肽包含至少一个结合结构域，所述至少一个结合结构域结合除cd33以外的抗原。实施方案20.根据实施方案19所述的多肽，其中所述多肽包含至少一个结合结构域，所述至少一个结合结构域结合cd3、t细胞受体(tcr)α、tcrβ、cd28、cd16、cd32a、cd64、cd89、nkp46或nkg2d。实施方案21.根据实施方案17或18所述的多肽，其中每个vhh结构域结合cd33。实施方案22.根据实施方案21所述的多肽，其中每个vhh结构域包含相同的cdr1、cdr2和cdr3氨基酸序列。实施方案23.根据实施方案21所述的多肽，其中每个vhh结构域包含相同的vhh序列。实施方案24.根据实施方案1-16中任一项所述的多肽，所述多肽包含一个vhh结构域。实施方案25.根据实施方案1-24中任一项所述的多肽，其中所述多肽包含fc区。实施方案26.根据实施方案25所述的多肽，其中所述fc区包含选自seq id no:74-109的氨基酸序列。实施方案27.根据实施方案25或实施方案26所述的多肽，所述多肽在生理条件下形成二聚体。实施方案28.根据实施方案1-27中任一项所述的多肽，其中所述cd33是人cd33。实施方案29.根据实施方案28所述的多肽，其中所述人cd33包含seq id no:1的序列。实施方案30.一种免疫缀合物，所述免疫缀合物包含根据实施方案1-29中任一项所述的多肽和细胞毒性剂。实施方案31.根据实施方案30所述的免疫缀合物，其中所述细胞毒性剂选自卡奇霉素(calicheamicin)、澳瑞他汀(auristatin)、多拉司他汀(dolastatin)、度布立新(tubulicin)、美登木素生物碱(maytansinoid)、念珠藻素(cryptophycin)、倍癌霉素(duocarmycin)、埃斯波霉素(esperamicin)、吡咯并苯二氮卓(pyrrolobenzodiazepine)和烯二炔抗生素。实施方案32.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据实施方案1-29中任一项所述的多肽或根据实施方案30或实施方案31所述的免疫缀合物和药学上可接受的载体。实施方案33.一种分离的核酸，所述分离的核酸编码根据实施方案1-29中任一项所述的多肽。实施方案34.一种载体，所述载体包含根据实施方案33所述的核酸。实施方案35.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含根据实施方案33所述的核酸或根据实施方案34所述的载体。实施方案36.一种宿主细胞，所述宿主细胞表达根据实施方案1-29中任一项所述的多肽。实施方案37.一种产生根据实施方案1-29中任一项所述的多肽的方法，所述方法包括在适于表达所述多肽的条件下孵育根据实施方案35或实施方案36所述的宿主细胞。实施方案38.根据实施方案37所述的方法，所述方法进一步包括分离所述多肽。
实施方案39.一种治疗癌症的方法，所述方法包括向患有癌症的受试者施用药学有效量的根据实施方案1-29中任一项所述的多肽、根据实施方案30或实施方案31所述的免疫缀合物或根据实施方案32所述的药物组合物。实施方案40.根据实施方案39所述的方法，其中所述癌症选自淋巴瘤；霍奇金淋巴瘤；非霍奇金淋巴瘤；b细胞淋巴瘤；低分级/滤泡性非霍奇金淋巴瘤(nhl)；小淋巴细胞(sl)nhl；中分级/滤泡性nhl；中分级弥漫性nhl；高分级免疫母细胞nhl；高分级淋巴母细胞nhl；高分级小非裂细胞nhl；巨块病变(bulky disease)nhl；套细胞淋巴瘤；艾滋病相关淋巴瘤；华氏巨球蛋白血症；慢性淋巴细胞白血病(cll)；急性成淋巴细胞性白血病(all)；急性髓性白血病(aml)；毛细胞白血病；和慢性成髓细胞性白血病。实施方案41.根据实施方案39或40所述的方法，其中所述癌症是急性髓性白血病(aml)。实施方案42.根据实施方案39-41中任一项所述的方法，所述方法进一步包括施用另外的治疗剂。实施方案43.根据实施方案42所述的方法，其中所述另外的治疗剂是抗癌剂。实施方案44.根据实施方案43所述的方法，其中所述抗癌剂选自化学治疗剂、抗癌生物制剂、放射疗法、car-t疗法和溶瘤病毒。实施方案45.根据实施方案39-44中任一项所述的方法，其中所述癌症是表达cd33的癌症。
附图说明
5.图1示出了与本文所述的其他结合cd33的sdab相比，hz1e4v2的生物层干涉测量法数据。
6.图2a-图2m示出了某些单结构域抗体(sdab)与在molm-13或hek 293细胞上表达的cd33的结合。“molm-13”指示已经用编码cd33的质粒转染的mol-13细胞，如实施例2中所述。“cd33m”指示截短的cd33蛋白(seq id no:113)。“cd33m”指示全长cd33蛋白(seq id no:112)。“hek 293”或“亲本hek 293”指示未转染的hek 293细胞。图2a示出了1e4-igg1与cd33的结合。图2b示出了hz1e4v2-igg1与cd33的结合。图2c示出了1h9-igg1与cd33的结合。图2d示出了hz1h9v2-igg1与cd33的结合。图2e示出了hz1g3v3-igg1与cd33的结合。图2f示出了1c7-igg1与cd33的结合。图2g示出了hz1c7v1-igg1与cd33的结合。图2h示出了hz1c7v11-igg1与cd33的结合。图2i示出了hza07v4-igg1与cd33的结合。图2j示出了hzb07v7-igg1与cd33的结合。图2k示出了hzg11v2-igg1与cd33的结合。图2l示出了f02-igg1与cd33的结合。图2m示出了hzf02v18-igg1与cd33的结合。
具体实施方式
7.本文提供的实施方案涉及结合cd33的多肽以及它们在治疗癌症的各种方法中的用途。定义和各种实施方案
8.本文使用的章节标题仅用于组织目的，而不应解释为限制所描述的主题。
9.将本文引用的所有参考文献(包括专利申请、专利公开案和genbank登录号)均通
过引用并入本文，如同每个单独的参考文献被具体地且单独地指示通过引用以其整体并入。
10.本领域技术人员通常熟知并且一般地使用常规方法采用本文描述或引用的技术和程序，所述常规方法例如像描述在以下参考文献中的广泛利用的方法：sambrook等人,molecular cloning:a laboratory manual第3版(2001)cold spring harbor laboratory press,cold spring harbor,n.y.current protocols in molecular biology(f.m.ausubel等人编辑,(2003))；系列methods in enzymology(academic press,inc.):pcr 2:a practical approach(m.j.macpherson,b.d.hames和g.r.taylor编辑(1995))，harlow和lane编辑(1988)antibodies,a laboratory manual，和animal cell culture(r.i.freshney编辑(1987))；oligonucleotide synthesis(m.j.gait编辑,1984)；methods in molecular biology,humana press；cell biology:a laboratory notebook(j.e.cellis编辑,1998)academic press；animal cell culture(r.i.freshney)编辑,1987)；introduction to cell and tissue culture(j.p.mather和p.e.roberts,1998)plenum press；cell and tissue culture laboratory procedures(a.doyle,j.b.griffiths和d.g.newell编辑,1993-8)j.wiley and sons；handbook of experimental immunology(d.m.weir和c.c.blackwell编辑)；gene transfer vectors for mammalian cells(j.m.miller和m.p.calos编辑,1987)；pcr:the polymerase chain reaction,(mullis等人编辑,1994)；current protocols in immunology(j.e.coligan等人编辑,1991)；short protocols in molecular biology(wiley and sons,1999)；immunobiology(c.a.janeway和p.travers,1997)；antibodies(p.finch,1997)；antibodies:a practical approach(d.catty.编辑,irl press,1988-1989)；monoclonal antibodies:a practical approach(p.shepherd和c.dean编辑,oxford university press,2000)；using antibodies:a laboratory manual(e.harlow和d.lane(cold spring harbor laboratory press,1999)；the antibodies(m.zanetti和j.d.capra编辑,harwood academic publishers,1995)；以及cancer:principles and practice of oncology(v.t.devita等人编辑,j.b.lippincott company,1993)；以及它们的更新版本。
11.除非另外定义，否则结合本公开文本使用的科学和技术术语应当具有本领域普通技术人员通常理解的含义。此外，除非上下文另外要求或明确指示，否则单数术语应当包括复数，并且复数术语应当包括单数。对于各种来源或参考文献之间的任何定义冲突，以本文提供的定义为准。
12.通常，免疫球蛋白重链中残基的编号是如kabat等人,sequences of proteins of immunological interest,第5版public health service,national institutes of health,bethesda,md.(1991)中的eu索引的编号。“如kabat中的eu索引”是指人igg1 eu抗体的残基编号。
13.应理解，本文所述的本发明的实施方案包括“由实施方案组成”和/或“基本上由实施方案组成”。除非另外指示，否则如本文所用，单数形式“一个/一种(a)”、“一个/一种(an)”和“所述”包括复数指示物。在本文中术语“或”的使用并不意在暗示替代方案是相互排斥的。
14.在本技术中，除非本领域技术人员明确说明或理解，否则“或”的使用意指“和/
或”。在多项从属权利要求的上下文中，“或”的使用回指多于一项前述独立或从属权利要求。
15.短语“参考样品”、“参考细胞”或“参考组织”表示具有至少一种已知特征的样品，所述样品可以用作与具有至少一种未知特征的样品的比较物。在一些实施方案中，参考样品可以用作阳性或阴性指示物。参考样品可以用于确定与具有未知特征的样品中存在的蛋白质和/或mrna的水平相比，存在于例如健康组织中的蛋白质和/或mrna的水平。在一些实施方案中，参考样品来自同一受试者，但是来自受试者的与被测试的部分不同的部分。在一些实施方案中，参考样品来自癌症周围或邻近处的组织区域。在一些实施方案中，参考样品不是来自被测试的受试者，而是来自已知患有或未患有所讨论的障碍(例如，特定癌症或cd33相关障碍)的受试者的样品。在一些实施方案中，参考样品来自同一受试者，但是来自受试者患上癌症之前的时间点。在一些实施方案中，参考样品来自于来自相同或不同受试者的良性癌症样品。当将阴性参考样品用于比较时，阴性参考样品中所讨论的分子的表达水平或量将指示本领域技术人员在给定本公开文本的情况下认为不存在和/或存在低水平所述分子时的水平。当将阳性参考样品用于比较时，阳性参考样品中所讨论的分子的表达水平或量将指示本领域技术人员在给定本公开文本的情况下认为存在一定水平的所述分子时的水平。
16.如本文在受益于或响应于施用治疗剂的上下文中使用的术语“益处”、“临床益处”、“反应性”和“治疗反应性”可以通过评估各种终点来测量，所述终点例如在一定程度上对疾病进展的抑制，包括减慢和完全停滞；疾病发作和/或症状的次数的减少；病灶大小的减小；对疾病细胞浸润到邻近的外周器官和/或组织的抑制(即减少、减缓或完全停止)；对疾病传播的抑制(即减少、减缓或完全停止)；在一定程度上对与障碍相关的一种或多种症状的缓解；治疗后无病表现的时长(例如，无进展存活期)的增加；增加的总存活期；更高的反应率；和/或降低的在治疗后给定时间点的死亡率。“无反应”或“反应失败”的受试者或癌症是未能满足上述“有反应”资格的受试者或癌症。
17.术语“核酸分子”、“核酸”和“多核苷酸”可以可互换地使用，并且是指核苷酸的聚合物。核苷酸的此类聚合物可以含有天然和/或非天然核苷酸，并且包括但不限于dna、rna和pna。“核酸序列”是指核酸分子或多核苷酸中所包含的核苷酸的线性序列。
18.术语“多肽”和“蛋白质”可互换地用于指代氨基酸残基的聚合物，并且不限于最小长度。氨基酸残基的此类聚合物可以含有天然或非天然氨基酸残基，并且包括但不限于氨基酸残基的肽、寡肽、二聚体、三聚体和多聚体。所述定义涵盖全长蛋白质及其片段二者。所述术语还包括多肽的表达后修饰，例如糖基化、唾液酸化、乙酰化、磷酸化等。此外，出于本公开文本的目的，“多肽”是指包括对天然序列的修饰(诸如缺失、添加和取代，在本质上通常是保守的)的蛋白质，只要所述蛋白质保持所需活性即可。这些修饰可能是故意的(诸如通过定点诱变)，或者可能是偶然的(诸如通过产生蛋白质的宿主的突变或由于pcr扩增引起的错误)。
19.如本文所用的“cd33”是指由细胞中cd33前体的加工产生的任何天然的成熟cd33。除非另外指示，否则所述术语包括来自任何脊椎动物来源的cd33，所述脊椎动物来源包括哺乳动物，诸如灵长类动物(例如，人和食蟹猴或恒河猴)和啮齿动物(例如，小鼠和大鼠)。所述术语还包括天然存在的cd33变体，诸如剪接变体或等位基因变体。例如在uniprot登录
号p20138中示出了非限制性的示例性的人cd33氨基酸序列。cd33的成熟形式可以缺乏信号肽(例如，cd33的成熟形式可以缺乏uniprot登录号p20138的氨基酸1-17)。参见seq id no.1。
20.术语“特异性结合”至抗原或表位是本领域熟知的术语，并且确定这种特异性结合的方法也是本领域熟知的。如果与分子和替代细胞或物质反应或相关联的情况相比，所述分子与特定细胞或物质更频繁地、更快速地、以更长的持续时间和/或以更大的亲和力反应或相关联，则称所述分子展现出“特异性结合”或“优先结合”。如果与单结构域抗体(sdab)或含有vhh的多肽与其他物质结合的情况相比，所述抗体或多肽以更大的亲和力、亲合力、更容易地和/或以更长的持续时间与靶标结合，则所述抗体或多肽与所述靶标“特异性结合”或“优先结合”。例如，特异性或优先与cd33表位结合的sdab或含有vhh的多肽是这样的sdab或含有vhh的多肽，其与其他cd33表位或非cd33表位结合相比以更大的亲和力、亲合力、更容易地和/或以更长的持续时间结合此表位。通过阅读此定义还应理解例如，特异性或优先与第一靶标结合的sdab或含有vhh的多肽可以或可以不特异性或优先与第二靶标结合。因此，“特异性结合”或“优先结合”并不一定需要(尽管可以包括)专一结合。通常，但并非必须，对结合的提及意指优先结合。“特异性”是指结合蛋白选择性结合抗原的能力。
21.术语“抑制(inhibition)”或“抑制(inhibit)”是指任何表型特征的减少或停止，或者是指该特征的发生率、程度或可能性的减小或停止。“降低”或“抑制”是指与参考相比，活性、功能和/或量的减少、降低或阻滞。在一些实施方案中，“降低”或“抑制”意指导致总体减少10％或更多的能力。在一些实施方案中，“降低”或“抑制”意指导致总体减少50％或更多的能力。在一些实施方案中，“降低”或“抑制”意指导致总体减少75％、85％、90％、95％或更多的能力。在一些实施方案中，在相同的时间段内，相对于对照，上述量在一段时间内被抑制或减少。如本文所用，关于cd33的活性的术语“抑制”是指cd33的活性(诸如与唾液酸结合)的降低。在一些实施方案中，“抑制”是指与在不存在调节剂的情况下的cd33活性相比，cd33活性的降低。在一些实施方案中，本文所述的结合cd33的多肽抑制cd33与唾液酸的结合。
22.如本文所用，术语“表位”是指与抗原结合分子(例如，sdab或含有vhh的多肽)结合的在靶分子(例如，抗原，诸如蛋白质、核酸、碳水化合物或脂质)上的位点。表位通常包括分子(诸如氨基酸、多肽或糖侧链)的化学活性表面分组，并且具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。表位可以由靶分子的连续和/或并置的非连续残基(例如，氨基酸、核苷酸、糖、脂质部分)形成。由连续残基(例如，氨基酸、核苷酸、糖、脂质部分)形成的表位通常在暴露于变性溶剂时保留，而通过三级折叠形成的表位通常在用变性溶剂处理时丢失。表位可以包括但不限于至少3个、至少5个或8-10个残基(例如，氨基酸或核苷酸)。在一些实施方案中，表位的长度少于20个残基(例如，氨基酸或核苷酸)、少于15个残基或少于12个残基。如果两种抗体展现出对某种抗原的竞争性结合，则它们可以结合所述抗原内的相同表位。在一些实施方案中，表位可以通过与抗原结合分子上的cdr残基的一定最小距离来鉴定。在一些实施方案中，表位可以通过上述距离来鉴定，并且进一步限于参与抗原结合分子的残基与抗原残基之间的键(例如，氢键)的那些残基。表位也可以通过各种扫描来鉴定，例如丙氨酸或精氨酸扫描可以指示抗原结合分子可以与之相互作用的一个或多个残基。除非明确指出，否则作为表位的一组残基不排除其他残基为特定抗原结合分子的表位的一部
分。相反，这样一组的存在表示表位的最小系列(或种类组)。因此，在一些实施方案中，鉴定为表位的一组残基表示与抗原相关的最小表位，而不是抗原上表位的残基的排他列表。
[0023]“非线性表位”或“构象表位”包含抗原蛋白内的非连续多肽、氨基酸和/或糖，对所述表位具有特异性的抗原结合分子与之结合。在一些实施方案中，残基中的至少一个将与表位的其他指出的残基不邻接；然而，残基中的一个或多个也可以与其他残基邻接。
[0024]“线性表位”包含抗原蛋白内的连续多肽、氨基酸和/或糖，对所述表位具有特异性的抗原结合分子与之结合。应注意，在一些实施方案中，并非线性表位内的每一个残基都需要由抗原结合分子直接结合(或参与键合)。在一些实施方案中，线性表位可以来自用有效地由线性表位的序列组成的肽的免疫接种，或者来自与蛋白质的其余部分相对分离的蛋白质的结构部分(使得抗原结合分子可以至少主要仅与该序列部分相互作用)。
[0025]
术语“抗体”在最广泛的意义上使用，并且涵盖包含抗体样抗原结合结构域的各种多肽，包括但不限于常规抗体(通常包含至少一条重链和至少一条轻链)、单结构域抗体(sdab，包含至少一个vhh结构域和fc区)、含有vhh的多肽(包含至少一个vhh结构域的多肽)、以及前述任一种的片段，只要它们展现出所需抗原结合活性即可。在一些实施方案中，抗体包含二聚化结构域。此类二聚化结构域包括但不限于重链恒定结构域(包含ch1、铰链、ch2和ch3，其中ch1通常与轻链恒定结构域cl配对，而铰链介导二聚化)和fc区(包含铰链、ch2和ch3，其中铰链介导二聚化)。
[0026]
术语抗体还包括但不限于嵌合抗体、人源化抗体和各种物种(诸如骆驼科(包括美洲驼)、鲨鱼、小鼠、人、食蟹猴等)的抗体。
[0027]
如本文所用的术语“抗原结合结构域”是指抗体的足以结合抗原的部分。在一些实施方案中，常规抗体的抗原结合结构域包含三个重链cdr和三个轻链cdr。因此，在一些实施方案中，抗原结合结构域包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区含有cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3和维持与抗原的结合所需的fr1和/或fr4的任何部分，所述轻链可变区含有cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3和维持与抗原的结合所需的fr1和/或fr4的任何部分。在一些实施方案中，sdab或含有vhh的多肽的抗原结合结构域包含vhh结构域的三个cdr。因此，在一些实施方案中，sdab或含有vhh的多肽的抗原结合结构域包含vhh结构域，所述vhh结构域含有cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3和维持与抗原的结合所需的fr1和/或fr4的任何部分。
[0028]
如本文所用的术语“vhh”或“vhh结构域”或“vhh抗原结合结构域”是指单结构域抗体(诸如骆驼科抗体或鲨鱼抗体)的抗原结合部分。在一些实施方案中，vhh包含三个cdr和四个框架区，表示为fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3和fr4。在一些实施方案中，vhh可以在n末端或c末端被截短，使得其仅包含部分fr1和/或fr4，或者缺少那些框架区中的一个或两个，只要vhh基本上维持抗原结合和特异性即可。
[0029]
术语“单结构域抗体”和“sdab”在本文中可互换地用于指代包含至少一个单体结构域(诸如vhh结构域)而不包含轻链和fc区的抗体。在一些实施方案中，sdab是两种多肽的二聚体，其中每种多肽包含至少一个vhh结构域和fc区。如本文所用，术语“单结构域抗体”和“sdab”涵盖包含多个vhh结构域的多肽，诸如具有结构vhh
1-vhh
2-fc或vhh
1-vhh
2-vhh
3-fc的多肽，其中vhh1、vhh2和vhh3可以相同或不同。
[0030]
术语“含有vhh的多肽”是指包含至少一个vhh结构域的多肽。在一些实施方案中，vhh多肽包含两个、三个或四个或更多个vhh结构域，其中每个vhh结构域可以相同或不同。
在一些实施方案中，含有vhh的多肽包含fc区。在一些此类实施方案中，含有vhh的多肽可以被称为sdab。此外，在一些此类实施方案中，vhh多肽可以形成二聚体。含有vhh的多肽(其也是sdab)的非限制性结构包括vhh
1-fc、vhh
1-vhh
2-fc和vhh
1-vhh
2-vhh
3-fc，其中vhh1、vhh2和vhh3可以相同或不同。在此类结构的一些实施方案中，一个vhh可以通过接头连接至另一个vhh，或者一个vhh可以通过接头连接至fc。在一些此类实施方案中，接头包含1-20个氨基酸，优选1-20个主要由甘氨酸和任选的丝氨酸构成的氨基酸。在一些实施方案中，当含有vhh的多肽包含fc时，它形成二聚体。因此，如果结构vhh
1-vhh
2-fc形成二聚体，则认为它是四价的(即，二聚体具有四个vhh结构域)。类似地，如果结构vhh
1-vhh
2-vhh
3-fc形成二聚体，则认为它是六价的(即，二聚体具有六个vhh结构域)。
[0031]
术语“单克隆抗体”是指基本上同质的抗体群体中的一种抗体(包括sdab或含有vhh的多肽)，即除了可以少量存在的可能的天然存在的突变之外，构成所述群体的单独抗体是相同的。单克隆抗体是高度特异性的，针对单个抗原位点。此外，与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，每种单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。因此，单克隆抗体样品可以与抗原上的相同表位结合。修饰语“单克隆的”指示抗体的特征是从基本上同质的抗体群体获得，并且不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，单克隆抗体可以通过kohler和milstein,1975,nature 256:495首次描述的杂交瘤方法制备，或者可以通过重组dna方法(诸如美国专利号4,816,567中所述)制备。例如，还可以从使用mccafferty等人,1990,nature 348:552-554中描述的技术产生的噬菌体文库中分离单克隆抗体。
[0032]
术语“cdr”表示如通过本领域技术人员的至少一种鉴定方式定义的互补决定区。在一些实施方案中，cdr可以根据chothia编号方案、kabat编号方案、kabat和chothia的组合、abm定义和/或接触定义中的任一种来定义。vhh包含三个cdr，表示为cdr1、cdr2和cdr3。
[0033]
如本文所用的术语“重链恒定区”是指包含至少三个重链恒定结构域ch1、铰链、ch2和ch3的区域。当然，除非另外指明，否则结构域内的非功能改变性缺失和改变涵盖在术语“重链恒定区”的范围内。非限制性的示例性的重链恒定区包括γ、δ和α。非限制性的示例性的重链恒定区还包括ε和μ。每个重恒定区对应于一种抗体同种型。例如，包含γ恒定区的抗体是igg抗体，包含δ恒定区的抗体是igd抗体，并且包含α恒定区的抗体是iga抗体。此外，包含μ恒定区的抗体是igm抗体，并且包含ε恒定区的抗体是ige抗体。某些同种型可以进一步细分为子类。例如，igg抗体包括但不限于igg1(包含γ1恒定区)、igg2(包含γ2恒定区)、igg3(包含γ3恒定区)和igg4(包含γ4恒定区)抗体；iga抗体包括但不限于iga1(包含α1恒定区)和iga2(包含α2恒定区)抗体；并且igm抗体包括但不限于igm1和igm2。
[0034]
如本文所用的“fc区”是指重链恒定区的包含ch2和ch3的部分。在一些实施方案中，fc区包含铰链、ch2和ch3。在各种实施方案中，当fc区包含铰链时，所述铰链介导两个含有fc的多肽之间的二聚化。fc区可以属于本文讨论的任何抗体重链恒定区同种型。在一些实施方案中，fc区是igg1、igg2、igg3或igg4。
[0035]
如本文所用的“受体人框架”是包含源自人免疫球蛋白框架或人共有框架的重链可变结构域(vh)框架的氨基酸序列的框架，如本文所讨论的。源自人免疫球蛋白框架或人共有框架的受体人框架可以包含其相同的氨基酸序列，或者它可以含有氨基酸序列变化。在一些实施方案中，跨单个抗原结合结构域(诸如vhh)中的所有人框架，氨基酸变化的数量
为少于10、或少于9、或少于8、或少于7、或少于6、或少于5、或少于4、或少于3。
[0036]“亲和力”是指分子(例如，抗体，诸如sdab或含有vhh的多肽)的单个结合位点与其结合配偶体(例如，抗原)之间的非共价相互作用总和的强度。分子x对其配偶体y的亲和力或表观亲和力通常可以分别由解离常数(kd)或k
d-表观
表示。可以通过本领域已知的常用方法(例如像elisa kd、kinexa、流式细胞术和/或表面等离子体共振装置)(包括本文所述的那些)测量亲和力。此类方法包括但不限于涉及或流式细胞术的方法。
[0037]
如本文所用，术语“k
d”是指抗原结合分子/抗原相互作用的平衡解离常数。当在本文中使用术语“k
d”时，它包括kd和k
d-表观
。
[0038]
在一些实施方案中，抗原结合分子的kd是使用表达抗原的细胞系通过流式细胞术并将在每个抗体浓度下测量的平均荧光拟合到非线性单位点结合方程(prism software graphpad)来测量。在一些此类实施方案中，kd是k
d-表观
。
[0039]
术语“生物活性”是指分子的任何一种或多种生物学特性(无论是在体内发现的天然存在的，还是通过重组方式提供或实现的)。
[0040]“激动剂”或“激活性”抗体是增加和/或激活靶抗原的生物活性的抗体。在一些实施方案中，激动剂抗体与抗原结合，并且将所述抗原的生物活性提高至少约20％、40％、60％、80％、85％或更多。
[0041]“拮抗剂”、“阻断性”或“中和”抗体是抑制、降低和/或失活靶抗原的生物活性的抗体。在一些实施方案中，中和抗体与抗原结合，并且将所述抗原的生物活性降低至少约20％、40％、60％、80％、85％、90％、95％、99％或更多。
[0042]“亲和力成熟的”sdab或含有vhh的多肽是指与不具有此类改变的亲本sdab或含有vhh的多肽相比，在一个或多个cdr中具有一个或多个改变的sdab或含有vhh的多肽，此类改变导致sdab或含有vhh的多肽对抗原的亲和力提高。
[0043]
如本文所用的“人源化vhh”是指一个或多个框架区已经基本上被人框架区替代的vhh。在一些情况下，人免疫球蛋白的某些框架区(fr)残基被相应的非人残基替代。此外，人源化vhh可以包含这样的残基，其在原始vhh和人框架序列中均未发现，但是被包括在内以进一步改善和优化sdab、含有vhh的多肽性能。在一些实施方案中，人源化sdab或含有vhh的多肽包含人fc区。正如应理解的，人源化序列可以通过其一级序列来鉴定，并且不一定表示产生抗体的过程。
[0044]“效应子阳性fc区”具有天然序列fc区的“效应子功能”。示例性“效应子功能”包括fc受体结合；clq结合和补体依赖性细胞毒性(cdc)；fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)；吞噬作用；下调细胞表面受体(例如b细胞受体)；和b细胞激活等。此类效应子功能通常需要将fc区与结合结构域(例如，抗体可变结构域)组合，并且可以使用各种测定进行评估。
[0045]“天然序列fc区”包含与在自然界中发现的fc区的氨基酸序列相同的氨基酸序列。天然序列人fc区包括天然序列人igg1 fc区(非a同种异型和a同种异型)；天然序列人igg2 fc区；天然序列人igg3 fc区；和天然序列人igg4 fc区以及其天然存在的变体。
[0046]“变体fc区”包含由于至少一个氨基酸修饰而不同于天然序列fc区的氨基酸序列的氨基酸序列。在一些实施方案中，“变体fc区”包含由于至少一个氨基酸修饰而不同于天然序列fc区的氨基酸序列的氨基酸序列，但仍保留天然序列fc区的至少一种效应子功能。
在一些实施方案中，与天然序列fc区或与亲本多肽的fc区相比，变体fc区具有在天然序列fc区或在亲本多肽的fc区中的至少一个氨基酸取代，例如从约一至约十个氨基酸取代，优选从约一至约五个氨基酸取代。在一些实施方案中，本文的变体fc区将与天然序列fc区和/或与亲本多肽的fc区具有至少约80％的序列同一性，与其至少约90％的序列同一性，与其至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的序列同一性。
[0047]“fc受体”或“fcr”描述了与抗体的fc区结合的受体。在一些实施方案中，fcγr是天然人fcr。在一些实施方案中，fcr是结合igg抗体的受体(γ受体)，并且包括fcγri、fcγrii和fcγriii子类的受体，包括那些受体的等位基因变体和选择性剪接形式。fcγrii受体包括fcγriia(“激活性受体”)和fcγriib(“抑制性受体”)，所述受体具有主要在其胞质结构域方面不同的类似氨基酸序列。激活性受体fcγriia在其胞质结构域中含有免疫受体酪氨酸激活基序(itam)。抑制性受体fcγriib在其胞质结构域中含有免疫受体酪氨酸抑制基序(itim)。(参见例如，daeron,annu.rev.immunol.15:203-234(1997))。fcr综述于例如ravetch和kinet,annu.rev.immunol 9:457-92(1991)；capel等人,immunomethods 4:25-34(1994)；和de haas等人,j.lab.clin.med.126:330-41(1995)中。本文的术语“fcr”涵盖其他fcr，包括将来要鉴定的那些。例如，术语“fc受体”或“fcr”还包括新生儿受体fcrn，其负责将母体igg转移到胎儿(guyer等人,j.immunol.117:587(1976)和kim等人,j.immunol.24:249(1994))和调节免疫球蛋白的稳态。测量与fcrn的结合的方法是已知的(参见例如，ghetie和ward,immunol.today 18(12):592-598(1997)；ghetie等人,nature biotechnology,15(7):637-640(1997)；hinton等人,j.biol.chem.279(8):6213-6216(2004)；wo 2004/92219(hinton等人))。
[0048]
如本文所用的“嵌合抗原受体”是指包含细胞外抗原识别结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域的工程化多肽。在一些实施方案中，细胞外抗原识别结构域包含vhh结构域。
[0049]
如本文所用，术语“基本上相似”或“基本上相同”表示两个或更多个数值之间足够高的相似度，使得本领域技术人员认为这两个或更多个值之间的差异在由所述值测量的生物学特征的背景下具有很小或者没有生物学和/或统计学显著性。在一些实施方案中，两个或更多个基本上相似的值的差异不超过约5％、10％、15％、20％、25％或50％中的任一个。
[0050]
多肽“变体”意指在比对序列和引入空位(如果需要)以实现最大序列同一性百分比并且不将任何保守取代视为序列同一性的一部分之后，与天然序列多肽具有至少约80％的氨基酸序列同一性的生物活性多肽。此类变体包括例如在多肽的n末端或c末端添加或缺失一个或多个氨基酸残基的多肽。在一些实施方案中，变体将具有至少约80％的氨基酸序列同一性。在一些实施方案中，变体将具有至少约90％的氨基酸序列同一性。在一些实施方案中，变体将与天然序列多肽具有至少约95％的氨基酸序列同一性。
[0051]
如本文所用，关于肽、多肽或抗体序列的“氨基酸序列同一性百分比(％)”和“同源性”定义为在比对序列和引入空位(如果需要)以实现最大序列同一性百分比并且不将任何保守取代视为序列同一性的一部分之后，候选序列中与特定肽或多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。用于确定氨基酸序列同一性百分比的目的的比对可以按本领域技术内的各种方式来实现，例如使用公众可获得的计算机软件，诸如blast、blast-2、align或megaligntm(dnastar)软件。本领域技术人员可以确定用于测量比对的适当参数，
包括为了在被比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。
[0052]
氨基酸取代可以包括但不限于用另一种氨基酸替代多肽中的一种氨基酸。示例性取代在表1中示出。可以将氨基酸取代引入目的抗体中，并且筛选产物的所需活性，例如保留/改善的抗原结合、降低的免疫原性或改善的adcc或cdc。表1表1
[0053]
可以根据常见的侧链特性将氨基酸分组：(1)疏水性：正亮氨酸、met、ala、val、leu、ile；(2)中性亲水性：cys、ser、thr、asn、gln；(3)酸性：asp、glu；(4)碱性：his、lys、arg；(5)影响链取向的残基：gly、pro；(6)芳香族：trp、tyr、phe。
[0054]
非保守取代将需要将这些类别之一的成员交换为另一种类别。
[0055]
术语“载体”用于描述可以被工程化为含有可以在宿主细胞中繁殖的一种或多种克隆的多核苷酸的多核苷酸。载体可以包括一种或多种以下元件：复制起点、调节目的多肽表达的一种或多种调节序列(例如像启动子和/或增强子)和/或一种或多种选择性标记基因(例如像抗生素抗性基因和可以用于比色测定的基因(例如，β-半乳糖苷酶))。术语“表达载体”是指用于在宿主细胞中表达目的多肽的载体。
[0056]“宿主细胞”是指可以是或已经是载体或分离的多核苷酸的受体的细胞。宿主细胞
可以是原核细胞或真核细胞。示例性的真核细胞包括哺乳动物细胞，诸如灵长类动物或非灵长类动物细胞；真菌细胞，诸如酵母；植物细胞；和昆虫细胞。非限制性的示例性的哺乳动物细胞包括但不限于nso细胞、per.细胞(crucell)以及293和cho细胞及其衍生物(诸如293-6e、cho-dg44、cho-k1、cho-s和cho-ds细胞)。宿主细胞包括单个宿主细胞的后代，并且由于天然的、偶然的或故意的突变，所述后代可能不一定与原始亲本细胞完全相同(在形态学或基因组dna互补序列方面)。宿主细胞包括用本文提供的一种或多种多核苷酸在体内转染的细胞。
[0057]
如本文所用的术语“分离的”是指已经与通常在自然界中发现或产生的至少一些组分分离的分子。例如，当多肽与产生它的细胞的至少一些组分分离时，所述多肽被称为“分离的”。在多肽在表达后由细胞分泌的情况下，将含有所述多肽的上清液与产生它的细胞物理分离，这被认为是“分离”所述多肽。类似地，当多核苷酸不是通常在自然界中发现的较大的多核苷酸(例如像在dna多核苷酸的情况下的基因组dna或线粒体dna)的一部分时，或者例如在rna多核苷酸的情况下，与产生它的细胞的至少一些组分分离时，所述多核苷酸被称为“分离的”。因此，在宿主细胞内的载体中所含有的dna多核苷酸可以被称为“分离的”。
[0058]
术语“个体”和“受试者”在本文中可互换地用于指代动物；例如哺乳动物。在一些实施方案中，提供了治疗哺乳动物的方法，所述哺乳动物包括但不限于人、啮齿动物、猿猴、猫科动物、犬科动物、马科动物、牛科动物、猪科动物、绵羊、山羊、哺乳动物实验室动物、哺乳动物家畜、哺乳动物运动动物和哺乳动物宠物。在一些例子中，“个体”或“受试者”是指需要治疗疾病或障碍的个体或受试者。在一些实施方案中，接受治疗的受试者可以是指明如下事实的患者：受试者已经被鉴定为患有与治疗相关的障碍，或者有患上所述障碍的足够风险。
[0059]
如本文所用的“疾病”或“障碍”是指需要和/或期望治疗的病症。
[0060]
除非另外指明，否则术语“肿瘤细胞”、“癌细胞”、“癌症”、“肿瘤”和/或“瘤”在本文中可互换地使用，并且是指展现出会干扰身体器官和系统的正常功能发挥的不受控制的生长和/或异常增加的细胞存活和/或细胞凋亡的抑制的一种细胞(或多种细胞)。此定义包括良性和恶性癌症、血液癌症(诸如白血病、淋巴瘤和多发性骨髓瘤)、息肉、增生以及休眠的肿瘤或微转移。
[0061]
术语“癌症”和“肿瘤”涵盖实体癌和血液/淋巴癌，并且还涵盖恶性、恶变前和良性生长，诸如发育不良。示例性癌症包括但不限于：基底细胞癌；胆道癌；膀胱癌；骨癌；脑和中枢神经系统癌症；乳腺癌；腹膜癌；宫颈癌；绒毛膜癌；结直肠癌；结缔组织癌；消化系统癌症；子宫内膜癌；食道癌；眼癌；头颈癌；胃癌(包括胃肠癌)；胶质母细胞瘤；肝癌；肝肿瘤；上皮内瘤；肾脏癌症或肾癌；喉癌；白血病；肝脏癌症；肺癌(例如，小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞癌)；黑色素瘤；骨髓瘤；神经母细胞瘤；口腔癌(唇、舌、口和咽)；卵巢癌；胰腺癌；前列腺癌；视网膜母细胞瘤；横纹肌肉瘤；直肠癌；呼吸系统癌症；唾液腺癌；肉瘤；皮肤癌；鳞状细胞癌；胃部癌症；睾丸癌；甲状腺癌；子宫癌或子宫内膜癌；泌尿系统癌症；外阴癌；淋巴瘤，包括霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤、以及b细胞淋巴瘤(包括低分级/滤泡性非霍奇金淋巴瘤(nhl)；小淋巴细胞(sl)nhl；中分级/滤泡性nhl；中分级弥漫性nhl；高分级免疫母细胞nhl；高分级淋巴母细胞nhl；高分级小非裂细胞nhl；巨块病变nhl；套细胞淋巴
瘤；艾滋病相关淋巴瘤；和华氏巨球蛋白血症)；急性髓性白血病(aml)；慢性淋巴细胞白血病(cll)；急性成淋巴细胞性白血病(all)；毛细胞白血病；慢性成髓细胞性白血病；以及其他癌和肉瘤；以及移植后淋巴增殖性疾病(ptld)，以及与斑痣性错构瘤病相关的异常血管增生，水肿(诸如与脑肿瘤相关的水肿)，以及梅格斯综合征。
[0062]
如本文所用的术语“非肿瘤细胞”或“非癌细胞”是指正常细胞或组织。示例性的非肿瘤细胞包括但不限于：t细胞，b细胞，自然杀伤(nk)细胞，自然杀伤t(nkt)细胞，树突细胞，单核细胞，巨噬细胞，上皮细胞，成纤维细胞，肝细胞，肾间质细胞，成纤维细胞样滑膜细胞，成骨细胞，以及位于乳房、骨骼肌、胰腺、胃、卵巢、小肠、胎盘、子宫、睾丸、肾、肺、心脏、脑、肝、前列腺、结肠、淋巴器官、骨骼中的细胞，以及骨源性间充质干细胞。如本文所用的术语“位于外周中的细胞或组织”是指不位于肿瘤细胞附近和/或在肿瘤微环境内的非肿瘤细胞。
[0063]
如本文所用的术语“肿瘤微环境内的细胞或组织”是指围绕和/或滋养肿瘤细胞的细胞、分子、细胞外基质和/或血管。肿瘤微环境内的示例性细胞或组织包括但不限于：肿瘤血管；肿瘤浸润性淋巴细胞；成纤维细胞网状细胞；内皮祖细胞(epc)；癌症相关成纤维细胞；周细胞；其他基质细胞；细胞外基质(ecm)的组分；树突细胞；抗原呈递细胞；t细胞；调节性t细胞(treg细胞)；巨噬细胞；嗜中性粒细胞；髓源性抑制细胞(mdsc)和位于肿瘤附近的其他免疫细胞。用于鉴定肿瘤细胞和/或位于肿瘤微环境内的细胞/组织的方法是本领域熟知的，如下文所述。
[0064]
在一些实施方案中，“增加”或“减少”分别是指统计学上显著的增加或减少。正如技术人员应清楚的，“调节”还可以涉及与相同条件但不存在测试剂的情况相比，实现靶标或抗原对其配体、结合配偶体、用于缔合为同多聚体或异多聚体形式的配偶体或底物中的一种或多种的亲和力、亲合力、特异性和/或选择性的变化(其可以是增加或减少)；实现靶标或抗原对存在靶标或抗原的介质或环境中的一种或多种条件(诸如ph、离子强度、存在辅因子等)的敏感性的变化(其可以是增加或减少)；和/或细胞增殖或细胞因子产生。这可以按任何合适的方式和/或使用本身已知的或本文所述的任何合适的测定来确定，这取决于所涉及的靶标。
[0065]
如本文所用，“免疫反应”意在涵盖足以抑制或预防疾病(例如，癌症或癌症转移)的发作或改善所述疾病的症状的细胞免疫反应和/或体液免疫反应。“免疫反应”可以涵盖先天免疫系统和适应性免疫系统二者的方面。
[0066]
如本文所用，“治疗”是用于获得有益或所需的临床结果的途径。如本文所用，“治疗”包括针对哺乳动物(包括人)的疾病，对治疗剂的任何施用或施加。出于本公开文本的目的，有益或所需的临床结果包括但不限于以下中的任何一种或多种：减轻一种或多种症状、降低疾病程度、预防或延迟疾病的传播(例如，转移，例如转移到肺或淋巴结)、预防或延迟疾病的复发、延迟或减缓疾病的进展、改善疾病状态、抑制疾病或疾病的进展、抑制或减缓疾病或疾病的进展、停滞疾病的发展和缓解(无论是部分还是全部)。“治疗”还涵盖降低增殖性疾病的病理后果。本文提供的方法考虑了这些治疗方面中的任何一个或多个。与上述一致，术语治疗不需要百分之百地去除障碍的所有方面。
[0067]“改善”意指与不施用治疗剂相比，一种或多种症状的减轻或改进。“改善”还包括缩短或减少症状的持续时间。
[0068]
术语“抗癌剂”在本文中以其最广泛的意义用于指代用于治疗一种或多种癌症的药剂。此类药剂的示例性类别包括但不限于化学治疗剂、抗癌生物制剂(诸如细胞因子、受体细胞外结构域-fc融合物和抗体)、放射疗法、car-t疗法、治疗寡核苷酸(诸如反义寡核苷酸和sirna)和溶瘤病毒。
[0069]
术语“生物样品”意指来自活物或曾经的活物的一定量的物质。此类物质包括但不限于血液(例如，全血)、血浆、血清、尿液、羊水、滑液、内皮细胞、白细胞、单核细胞、其他细胞、器官、组织、骨髓、淋巴结和脾。
[0070]
在实验或比较的上下文中，术语“对照”或“参考”是指已知不含分析物(“阴性对照”)或含有分析物(“阳性对照”)的组合物。阳性对照可以包含已知浓度的分析物。对照或参考还可以指代已知缺乏被测试的药剂(诸如抗体)的活性的对照药剂。
[0071]
如本文所用，“延迟疾病的发展”意指推迟、阻碍、减缓、延缓、稳定、抑制和/或延期疾病(诸如癌症)的发展。此延迟可以具有不同的时间长度，这取决于病史和/或被治疗的个体。正如本领域技术人员应清楚的，足够或显著的延迟实际上可以涵盖预防，因为个体不会患上疾病。例如，可能延迟晚期癌症，诸如转移的发展。
[0072]
如本文所用，“预防”包括提供关于受试者的疾病的发生或复发的预防，所述受试者可能易患所述疾病但是尚未被诊断患有所述疾病。除非另外说明，否则术语“降低”、“抑制”或“预防”不表示或要求在所有时间内完全预防，而只是在被测量的时间段内如此。
[0073]
物质/分子、激动剂或拮抗剂的“治疗有效量”可以根据诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重，以及物质/分子、激动剂或拮抗剂在个体中引发所需反应的能力等因素而变化。治疗有效量也是治疗有益效果超过物质/分子、激动剂或拮抗剂的任何毒性或有害作用的量。治疗有效量可以按一次或多次施用来递送。治疗有效量是指在必要的剂量和持续必要的时间段的情况下有效实现所需治疗和/或预防结果的量。
[0074]
术语“药物配制品”和“药物组合物”可互换地使用，并且是指这样的制剂，其呈允许一种或多种活性成分的生物活性有效的形式，并且不含对所述配制品所施用的受试者具有不可接受的毒性的另外的组分。此类配制品可以是无菌的。
[0075]“药学上可接受的载体”是指用于与治疗剂一起使用的无毒固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、包囊材料、配制助剂或本领域常规的载体，它们共同构成用于向受试者施用的“药物组合物”。药学上可接受的载体在所采用的剂量和浓度下对接受者无毒，并且与所述配制品的其他成分相容。药学上可接受的载体适用于所采用的配制品。
[0076]
与一种或多种其他治疗剂“组合”施用包括同时(并行)施用和以任何顺序依次施用。
[0077]
术语“并行”在本文中用于指代两种或更多种治疗剂的施用，其中至少部分施用在时间上重叠，或者其中一种治疗剂的施用相对于另一种治疗剂的施用在很短的时间段内发生，或者其中两种药剂的治疗作用重叠持续至少一段时间。
[0078]
术语“依次”在本文中用于指代两种或更多种治疗剂的施用，其在时间上不重叠，或者其中药剂的治疗作用不重叠。
[0079]
如本文所用，“与
……
结合”是指除了另一种治疗模式之外还施用一种治疗模式。因此，“与
……
结合”是指在向个体施用另一种治疗模式之前、期间或之后施用一种治疗模式。
[0080]
术语“包装插页”用于指代通常在治疗产品的商业包装中所包括的说明书，所述说明书含有关于使用此类治疗产品的适应症、用法、剂量、施用、组合疗法、禁忌症和/或警告的信息。
[0081]“制品”是包含至少一种试剂(例如，用于治疗疾病或障碍(例如，癌症)的药物)或用于特异性检测本文所述的生物标记物的探针的任何制造物(例如，包装或容器)或试剂盒。在一些实施方案中，所述制造物或试剂盒作为用于实施本文所述的方法的单元进行促销、分发或销售。
[0082]
术语“标记”和“可检测标记”意指例如与抗体或抗原附接的部分，以使特异性结合对的成员之间的反应(例如，结合)可检测。所述特异性结合对的经标记的成员被称为“被可检测地标记”。因此，术语“经标记的结合蛋白”是指掺入了用于鉴定结合蛋白而提供的标记的蛋白质。在一些实施方案中，所述标记是可以产生能够通过视觉或仪器手段检测的信号的可检测标记物，例如掺入经放射性标记的氨基酸或附接至生物素基部分的多肽，所述生物素基部分的多肽可以通过标记的抗生物素蛋白检测(例如，含有可以通过光学方法或比色法检测的荧光标记物或酶活性的链霉抗生物素蛋白)。多肽的标记的例子包括但不限于以下：放射性同位素或放射性核素(例如，3h、
14
c、
35
s、
90
y、
99
tc、
111
in、
125
i、
131
i、
177
lu、
166
ho或
153
sm)；色原；荧光标记(例如，fitc、罗丹明、镧系荧光粉)；酶标记(例如，辣根过氧化物酶、萤光素酶、碱性磷酸酶)；化学发光标记物；生物素基基团；由第二报告物识别的预定多肽表位(例如，亮氨酸拉链对序列、二抗的结合位点、金属结合结构域、表位标签)；和磁性剂(诸如钆螯合物)。通常用于免疫测定的标记的代表性例子包括产生光的部分，例如吖啶化合物；和产生荧光的部分，例如荧光素。在这方面，所述部分本身可能没有被可检测地标记，但是在与又另一种部分反应时可能变得可检测。示例性的结合cd33的多肽
[0083]
本文提供了结合cd33的多肽。在各种实施方案中，所述结合cd33的多肽包含结合cd33的至少一个vhh结构域。在一些实施方案中，所述cd33是人cd33。在一些实施方案中，结合cd33的多肽阻断cd33与唾液酸的结合。在一些实施方案中，本文提供的结合cd33的多肽包含一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或八个结合cd33的vhh结构域。在一些实施方案中，本文提供的结合cd33的多肽包含一个、两个、三个或四个结合cd33的vhh结构域。结合cd33的多肽可以包含一个或多个结合除cd33以外的一种或多种靶蛋白的vhh结构域。此类多肽可以被称为“多特异性”多肽。
[0084]
在一些实施方案中，结合cd33的多肽包含结合cd33的至少一个vhh结构域和fc区。在一些实施方案中，本文提供的结合cd33的多肽包含一个、两个、三个或四个vhh结构域和fc区。在一些实施方案中，fc区在生理条件下介导所述结合cd33的多肽的二聚化，使得形成使cd33结合位点数量加倍的二聚体。例如，包含三个结合cd33的vhh结构域和fc区的结合cd33的多肽作为单体是三价的，但是在生理条件下，fc区可以介导二聚化，使得所述结合cd33的多肽在此类条件下作为六价二聚体存在。
[0085]
在一些实施方案中，结合cd33的多肽包含至少两个vhh结构域，其中第一vhh结构域结合cd33的第一表位，并且第二vhh结构域结合cd33的第二表位。当所述结合cd33的多肽包含结合cd33的第一表位的vhh结构域和结合cd33的第二表位的vhh结构域时，所述结合cd33的多肽可以被称为“双表位的”或“双特异性的”。在一些实施方案中，结合cd33的多肽
包含至少两个vhh结构域，其中第一vhh结构域结合cd33，并且第二vhh结构域结合除cd33以外的抗原。此类多肽可以被称为“双特异性的”或“多特异性的”。
[0086]
非限制性的示例性的结合cd33的多肽在表2中示出。所指示的单结构域抗体的序列在本文的某些序列的列表中示出。以“hz”开始的多肽名称指示它是相应的亲本多肽的人源化版本。表2：包含结合cd33的至少一个vhh的多肽名称cdrvhh(或kp版本或ss版本)a07seq id no:3、4和5seq id no:2(或123)401-a9seq id no:7、8和9seq id no:6(或131)b07seq id no:11、12和13seq id no:10(或124)1c7seq id no:15、16和17seq id no:14(或125)1e4seq id no:19、20和21seq id no:18(或126)f02seq id no:23、24和25seq id no:22(或127)1g3seq id no:27、28和29seq id no:26(或128)g11seq id no:31、32和33seq id no:30(或129)1h9seq id no:35、36和37seq id no:34(或130)hza07v4seq id no:47、48和49seq id no:38(或114)hzb07v7seq id no:50、51和52seq id no:39(或115)hz1c7v1seq id no:53、54和55seq id no:40(或116)hz1c7v11seq id no:56、57和58seq id no:41(或117)hz1e4v2seq id no:59、60和61seq id no:42(或118)hzf02v18seq id no:62、63和64seq id no:43(或119)hz1g3v3seq id no:65、66和67seq id no:44(或120)hzg11v2seq id no:68、69和70seq id no:45(或121)hz1h9v2seq id no:71、72和73seq id no:46(或122)结合cd33的多肽
[0087]
在各种实施方案中，结合cd33的vhh结构域包含选自seq id no:3、7、11、15、19、23、27、31、35、47、50、53、56、59、62、65、68和71的cdr1序列；选自seq id no:4、8、12、16、20、24、28、32、36、48、51、54、57、60、63、66、69和72的cdr2序列；和选自seq id no:5、9、13、17、21、25、29、33、37、49、52、55、58、61、64、67、70和73的cdr3序列。在各种实施方案中，结合cd33的vhh结构域包含选自以下的cdr1、cdr2和cdr3序列：seq id no:3、4和5；seq id no:7、8和9；seq id no:11、12和13；seq id no:15、16和17；seq id no:19、20和21；seq id no:23、24和25；seq id no:27、28和29；seq id no:31、32和33；seq id no:35、36和37；seq id no:47、48和49；seq id no:50、51和52；seq id no:53、54和55；seq id no:56、57和58；seq id no:59、60和61；seq id no:62、63和64；seq id no:65、66和67；seq id no:68、69和70；以及seq id no:71、72和73。在各种实施方案中，所述vhh结构域是人源化的。
[0088]
在一些实施方案中，结合cd33的vhh结构域包含与选自seq id no:2、6、10、14、18、22、26、30、34、38、39、40、41、42、43、44、45、46、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130和131的氨基酸序列至少85％、至少90％、至少95％、至
少96％、至少97％、至少98％、至少99％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，结合cd33的vhh结构域包含选自以下的氨基酸序列：seq id no:2、6、10、14、18、22、26、30、34、38、39、40、41、42、43、44、45、46、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130和131。
[0089]
在各种实施方案中，结合cd33的多肽包含一个、两个、三个或四个结合cd33的vhh结构域。
[0090]
在各种实施方案中，结合cd33的多肽包含结合cd33的至少一个vhh结构域和结合自然杀伤细胞抗原或t细胞抗原的至少一个vhh结构域。在一些此类实施方案中，所述结合cd33的多肽可以被称为多特异性抗体。
[0091]
在一些实施方案中，结合cd33的多肽包含与fc区融合的本文所述的至少一个vhh结构域。在一些实施方案中，所述fc区具有选自以下的序列：seq id no:74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108和109。
[0092]
在一些实施方案中，结合cd33的vhh结构域可以是人源化的。人源化抗体(诸如sdab或含有vhh的多肽)可用作治疗分子，因为人源化抗体降低或消除人对非人抗体的免疫反应，所述人对非人抗体的免疫反应可能导致对抗体治疗剂的免疫反应以及降低的治疗剂的有效性。通常，人源化抗体包含一个或多个可变结构域，其中cdr(或其部分)源自非人抗体，并且fr(或其部分)源自人抗体序列。人源化抗体任选地还将包含人恒定区的至少一部分。在一些实施方案中，人源化抗体中的一些fr残基被来自非人抗体(例如，cdr残基所来源的抗体)的相应残基取代，例如以恢复或改善抗体特异性或亲和力。
[0093]
人源化抗体和制备它们的方法综述于例如almagro和fransson,(2008)front.biosci.13:1619-1633中，并且进一步描述于例如riechmann等人,(1988)nature 332:323-329；queen等人,(1989)proc.natl acad.sci.usa 86:10029-10033；美国专利号5,821,337、7,527,791、6,982,321和7,087,409；kashmiri等人,(2005)methods 36:25-34；padlan,(1991)mol.immunol.28:489-498(描述“表面再塑”)；dall'acqua等人,(2005)methods 36:43-60(描述“fr改组”)；以及osbourn等人,(2005)methods 36:61-68和klimka等人,(2000)br.j.cancer,83:252-260(描述fr改组的“导向选择”方法)中。
[0094]
可以用于人源化的人框架区包括但不限于：使用“最佳拟合”方法选择的框架区(参见例如，sims等人(1993)j.immunol.151:2296)；源自重链可变区的特定亚组的人抗体的共有序列的框架区(参见例如，carter等人(1992)proc.natl.acad.sci.usa,89:4285；和presta等人(1993)j.immunol,151:2623)；人成熟(经体细胞突变的)框架区或人种系框架区(参见例如，almagro和fransson,(2008)front.biosci.13:1619-1633)；以及源自筛选fr文库的框架区(参见例如，baca等人,(1997)j.biol.chem.272:10678-10684和rosok等人,(1996)j.biol.chem.271:22611-22618)。通常，将vhh的fr区替代为人fr区以制备人源化vhh。在一些实施方案中，替代人fr的某些fr残基以改善人源化vhh的一种或多种特性。具有此类替代残基的vhh结构域在本文中仍被称为“人源化的”。
[0095]
在各种实施方案中，在结合cd33的多肽中所包括的fc区是人fc区，或者源自人fc区。
[0096]
在一些实施方案中，在结合cd33的多肽中所包括的fc区源自人fc区，并且在下铰
链中包含对应于igg1 e233、l234和l235的三个氨基酸的缺失，在本文中称为“fc xell”。fc xell多肽不接合fcγr，并且因此被称为“效应子沉默的”或“效应子无效的”；然而，在一些实施方案中，xell fc区结合fcrn，并且因此具有与fcrn介导的再循环相关的延长的半衰期和胞吞转运。
[0097]
在一些实施方案中，在结合cd33的多肽中所包括的fc区源自人fc区，并且包含突变m252y和m428v，在本文中称为“fc-yv”。在一些实施方案中，此类突变在内体的酸性ph(接近6.5)下增强与fcrn的结合，而在中性ph(约7.2)下失去可检测的结合，从而允许增强的fcrn介导的再循环和延长的半衰期。
[0098]
在一些实施方案中，在结合cd33的多肽中所包括的fc区源自人fc区，并且包含被设计用于异二聚化的突变，在本文中称为“杵状结构(knob)”和“臼状结构(hole)”。在一些实施方案中，“杵状”fc区包含突变t366w。在一些实施方案中，“臼状”fc区包含突变t366s、l368a和y407v。在一些实施方案中，用于异二聚化的fc区包含另外的突变，诸如异二聚体fc对的第一成员上的突变s354c，其与异二聚体fc对的第二成员上的相应突变y349c形成不对称二硫键。在一些实施方案中，异二聚体fc对的一个成员包含修饰h435r或h435k以防止蛋白a结合同时维持fcrn结合。在一些实施方案中，异二聚体fc对的一个成员包含修饰h435r或h435k，而异二聚体fc对的第二成员在h435处未被修饰。在各种实施方案中，臼状fc区包含修饰h435r或h435k(当修饰是h435r时，在一些情况下称为“臼状r”)，而杵状fc区并不如此。在一些情况下，臼状r突变相比于可能存在的同二聚体臼状fc区改善了异二聚体的纯化。
[0099]
可以用于结合cd33的多肽的非限制性的示例性的fc区包括包含seq id no:74至109的氨基酸序列的fc区。嵌合受体和工程化细胞
[0100]
本文提供了具有细胞外结构域的嵌合抗原受体(car)，所述细胞外结构域包含一个或多个本文提供的结合cd33的vhh结构域。本文提供的car构建体包括含有所述一个或多个结合cd33的vhh结构域的细胞外结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导区。形成所述car的抗原结合单元的所述一个或多个结合cd33的vhh结构域以足够的亲和力结合或能够结合(即靶向)cd33结合，这样所述car可用于靶向表达cd33结合的细胞或组织的疗法。
[0101]
car是通常在单个融合分子(其在细胞(诸如t细胞)的表面表达)中含有与一个或多个信号传导结构域相关的细胞外靶向/结合部分的合成受体。因此，car在单个融合分子中组合了抗原特异性和t细胞激活特性。第一代car通常包括cd3ζ或fc l受体γ链的胞质区作为它们的信号传导结构域。已经在患有卵巢癌、肾癌、淋巴瘤和神经母细胞瘤的患者的i期临床研究中测试了第一代car，在所述研究中它们已经诱导了适度的反应(综述于sadelain等人,curr opin immunol,21(2):215-223,2009中)。含有共刺激分子(诸如cd28和cd3ζ)的信号传导结构域的第二代car提供了双重信号传导以指导组合的激活和共刺激信号。第三代car更复杂，具有三个或更多个信号传导结构域(综述于sadelain等人,cancer discovery(3),388-398,2013和dotti等人,immuno.rev,257(1),1-36,2014中)。
[0102]
在一些实施方案中，所提供的car包含结合cd33的vhh结构域。在一些实施方案中，所述car含有至少两个靶向一种或多种抗原的vhh结构域。在一个实施方案中，car的抗原结合结构域包含两个或至少两个结合cd33的vhh结构域，从而提供二价分子。在一个实施方案
中，所述抗原结合结构域包含两个或至少两个结合cd33的vhh结构域，但是结合至cd33上的不同表位。在此类情况下，所述抗原结合结构域包含与cd33的第一表位结合的第一结合cd33的vhh结构域和与cd33的第二表位结合的第二vhh结构域。所述表位可以重叠。因此，在一些实施方案中，所述抗原结合结构域是双互补位的，并且所述car是双互补位car。在又另一个实施方案中，所述抗原结合结构域包含两个与cd33上的相同表位结合的结合cd33的vhh结构域。
[0103]
本文提供的car的跨膜结构域是这样的结构域，其通常穿过或能够穿过或跨越质膜并且直接或间接(例如经由间隔子，诸如免疫球蛋白铰链序列)连接至细胞外抗原结合结构域和含有细胞内信号传导结构域的内质部分。在一个实施方案中，所述car的跨膜结构域是跨膜蛋白(例如i型跨膜蛋白)的跨膜区、人工疏水序列或其组合。在一个实施方案中，所述跨膜结构域包含cd3ζ结构域或cd28跨膜结构域。其他跨膜结构域对于本领域技术人员来说应是清楚的，并且可以与本文提供的car的实施方案结合使用。
[0104]
本文提供的car的细胞内信号传导区含有一个或多个细胞内信号传导结构域，所述细胞内信号传导结构域在所述car的抗原结合结构域接合后(诸如在结合抗原后)将信号传输至t细胞。在一些实施方案中，所述细胞内区域含有细胞内信号传导结构域，所述细胞内信号传导结构域是或含有itam信号传导结构域。示例性的细胞内信号传导结构域包括例如源自以下的信号传导结构域：t细胞受体复合物的ζ链或其任何类似物(例如，η链、fcsriy和β链、mb 1(iga)链、b29(ig)链等)、人cd3ζ链、cd3多肽(δ、δ和ε)、syk家族酪氨酸激酶(syk、zap 70等)、src家族酪氨酸激酶(lck、fyn、lyn等)和参与t细胞转导的其他分子(诸如cd2、cd5、ox40和cd28)。在特定实施方案中，所述细胞内信号传导区含有源自人cd3ζ链的细胞内信号传导结构域。
[0105]
在一些实施方案中，car的细胞内信号传导区可以进一步含有源自共刺激分子的细胞内信号传导结构域。在此类例子中，例如与仅包含含有itam的信号传导结构域(例如cd3ζ)的car相比，在抗原特异性接合后，这样的信号传导结构域可以诸如经由增强记忆细胞的增殖、存活和/或发育来增强car-t细胞活性。在一些实施方案中，共刺激结构域是从选自以下的蛋白质获得的功能性信号传导结构域：cd28、cd137(4-ibb)、cd134(ox40)、dap10、cd27、cd2、cd5、icam-1、lfa-1(cd1 la/cd18)、lck、tnfr-i、tnfr-ii、fas、cd30、cd40或其组合。在特定实施方案中，所述共刺激信号传导结构域源自或获自人蛋白。在一些方面，所述共刺激信号传导结构域源自或获自人cd28或人cd137(4-ibb)。
[0106]
在一些实施方案中，所述共刺激信号传导结构域源自cd28或41bb。
[0107]
在特定实施方案中，所述car进一步包含连接所述细胞外抗原结合结构域和所述跨膜结构域的铰链区或间隔子区。此铰链区或间隔子区可以用于实现所得car的不同长度和柔性。可以使用的铰链区或间隔子区的例子包括但不限于抗体或其片段或衍生物的fc片段、抗体或其片段或衍生物的铰链区、抗体的ch2区、抗体的ch3区、人工间隔子序列(例如肽序列)或其组合。其他铰链区或间隔子区对于本领域技术人员来说应是清楚的并且可以使用。在一个实施方案中，所述铰链是lgg4铰链或cd8a铰链。
[0108]
在一些实施方案中，所述间隔子和跨膜结构域是源自cd8的铰链和跨膜结构域。
[0109]
本文还提供了包含至少一种编码如本文提供的car的核酸的分离的核酸构建体。在一些方面，所述构建体是用于在细胞中表达car的表达载体。所述表达载体可以是病毒载
体。病毒载体技术是本领域熟知的，并且描述于例如sambrook等人(molecular cloning:a laboratory manual,cold spring harbor laboratory,new york,2013)中。已经开发出多种基于病毒的系统用于将基因转移至哺乳动物细胞中。例如，使用逆转录病毒(诸如腺病毒)载体。在一个实施方案中，使用慢病毒载体。
[0110]
在一个进一步的方面，还提供了包含一种或多种如上所述的核酸构建体的分离的细胞或细胞群体。还提供了已经经基因修饰以表达本文提供的car的分离的细胞或细胞群体。因此，本文提供了包含(诸如稳定表达)本文提供的car的基因工程化细胞。在一个实施方案中，所述细胞选自t细胞、自然杀伤(nk)细胞、细胞毒性t淋巴细胞(ctl)、调节性t细胞、造血干细胞和/或多能胚胎/诱导干细胞。在一些情况下，所述细胞是t细胞，诸如cd4和/或cd8 t细胞。在一些实施方案中，所述细胞对于所述受试者是自体的。例如，在一些实施方案中，t细胞可以从患者中分离(也称为原代t细胞)用于工程化，例如用car核酸构建体进行转染或转导。
[0111]
在一个示例性例子中，可以离体纯化原代t细胞(cd4细胞或cd8细胞或二者)，并且将所述细胞用tcr/cd28激动剂(诸如抗cd3/抗cd28包被的珠)刺激。在2或3天的激活过程后，可以通过标准慢病毒或逆转录病毒转导方案或质粒电穿孔策略将编码所述car的重组表达载体稳定地引入原代t细胞中。可以使用与天然亲本分子交叉反应的抗表位标签或抗体通过例如流式细胞术监测细胞的car表达。表达所述car的t细胞可以通过用抗表位标签抗体分选来富集，或者根据应用针对高表达或低表达来富集。
[0112]
可以通过多种手段来测定car工程化t细胞的适当功能。在一些情况下，可以使用体外细胞毒性、增殖或细胞因子测定(例如，ifn-γ表达)来评估工程化t细胞的功能。示例性的标准终点是培养上清液中肿瘤系的裂解百分比、工程化t细胞的增殖或ifn-γ蛋白表达。在一些情况下，可以诸如通过监测激活标记物(诸如cd69、cd44或cd62l)的表达、增殖和/或细胞因子产生来评估在car刺激(例如经由抗原)后刺激t细胞激活的能力。多肽表达和产生
[0113]
提供了包含编码结合cd33的多肽的多核苷酸的核酸分子。在一些实施方案中，所述核酸分子还可以编码指导所述结合cd33的多肽分泌的前导序列，所述前导序列通常被切割，使得其不存在于所分泌的多肽中。所述前导序列可以是天然重链(或vhh)前导序列，或者可以是另一种异源前导序列。
[0114]
可以使用本领域常规的重组dna技术来构建核酸分子。在一些实施方案中，核酸分子是适于在选定的宿主细胞中表达的表达载体。
[0115]
提供了包含编码本文所述的结合cd33的多肽的核酸的载体。此类载体包括但不限于dna载体、噬菌体载体、病毒载体、逆转录病毒载体等。在一些实施方案中，选择经优化以用于在所需细胞类型(诸如cho或cho源性细胞)或nso细胞中表达多肽的载体。示例性的此类载体描述于例如running deer等人,biotechnol.prog.20:880-889(2004)中。
[0116]
在一些实施方案中，结合cd33的多肽可以在原核细胞(诸如细菌细胞)中表达；或者在真核细胞(诸如真菌细胞(诸如酵母)、植物细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞)中表达。这种表达可以例如根据本领域已知的程序进行。可以用于表达多肽的示例性真核细胞包括但不限于cos细胞，包括cos 7细胞；293细胞，包括293-6e细胞；cho细胞，包括cho-s、dg44.lec13 cho细胞和fut8 cho细胞；per.细胞(crucell)；以及nso细胞。在一些实施
方案中，可以在酵母中表达所述结合cd33的多肽。参见例如，美国公开号us 2006/0270045 a1。在一些实施方案中，基于其对所述多肽进行所需翻译后修饰的能力来选择特定的真核宿主细胞。例如，在一些实施方案中，cho细胞产生的多肽的唾液酸化水平高于293细胞中产生的相同多肽的唾液酸化水平。
[0117]
可以通过任何方法将一种或多种核酸(诸如载体)引入所需宿主细胞中，所述方法包括但不限于磷酸钙转染、deae-葡聚糖介导的转染、阳离子脂质介导的转染、电穿孔、转导、感染等。非限制性的示例性的方法描述于例如sambrook等人,molecular cloning,a laboratory manual,第3版cold spring harbor laboratory press(2001)中。根据任何合适的方法，可以在所需宿主细胞中瞬时地或稳定地转染核酸。
[0118]
还提供了包含本文所述的任何核酸或载体的宿主细胞。在一些实施方案中，提供了表达本文所述的结合cd33的多肽的宿主细胞。在宿主细胞中表达的结合cd33的多肽可以通过任何合适的方法进行纯化。此类方法包括但不限于使用亲和基质或疏水相互作用色谱法。合适的亲和配体包括ror1 ecd和结合fc区的药剂。例如，蛋白a、蛋白g、蛋白a/g或抗体亲和柱可以用于结合fc区并且纯化包含fc区的结合cd33的多肽。疏水相互作用色谱法(例如，丁基或苯基柱)也可以适于纯化一些多肽，诸如抗体。离子交换色谱法(例如阴离子交换色谱法和/或阳离子交换色谱法)也可以适于纯化一些多肽，诸如抗体。混合模式色谱法(例如反相/阴离子交换、反相/阳离子交换、亲水相互作用/阴离子交换、亲水相互作用/阳离子交换等)也可以适于纯化一些多肽，诸如抗体。许多纯化多肽的方法是本领域已知的。
[0119]
在一些实施方案中，所述结合cd33的多肽是在无细胞系统中产生。非限制性的示例性的无细胞系统描述于例如sitaraman等人,methods mol.biol.498:229-44(2009)；spirin,trends biotechnol.22:538-45(2004)；endo等人,biotechnol.adv.21:695-713(2003)中。
[0120]
在一些实施方案中，提供了通过上述方法制备的结合cd33的多肽。在一些实施方案中，在宿主细胞中制备所述结合cd33的多肽。在一些实施方案中，在无细胞系统中制备所述结合cd33的多肽。在一些实施方案中，纯化所述结合cd33的多肽。在一些实施方案中，提供了包含结合cd33的多肽的细胞培养基。
[0121]
在一些实施方案中，提供了包含通过上述方法制备的抗体的组合物。在一些实施方案中，所述组合物包含在宿主细胞中制备的结合cd33的多肽。在一些实施方案中，所述组合物包含在无细胞系统中制备的结合cd33的多肽。在一些实施方案中，所述组合物包含经纯化的结合cd33的多肽。使用结合cd33的多肽治疗疾病的示例性方法
[0122]
在一些实施方案中，提供了治疗个体的疾病的方法，所述方法包括施用结合cd33的多肽或表达结合cd33的多肽的细胞。在一些实施方案中，提供了用于治疗个体的癌症的方法。在一些实施方案中，提供了用于治疗个体的表达cd33的或cd33阳性癌症的方法。所述方法包括向所述个体施用有效量的本文提供的结合cd33的多肽或表达结合cd33的多肽的细胞。在一些实施方案中，所述结合cd33的多肽阻断cd33与唾液酸的结合。在一些实施方案中，所述结合cd33的多肽用于将细胞毒性剂带给表达cd33的细胞。在一些此类实施方案中，所述结合cd33的多肽包含结合细胞毒性t细胞或nk细胞的结合结构域。在一些此类实施方案中，所述结合结构域结合cd3、t细胞受体(tcr)α、tcrβ、cd28、cd16、cd32a、cd64、cd89、
nkp46或nkg2d。在一些实施方案中，所述结合结构域可以是vhh结构域或包含重链可变区和轻链可变区(诸如vh/vl、scfv、fab片段等)的抗体结合结构域。
[0123]
在一些实施方案中，所述结合cd33的多肽与细胞毒性剂连接以形成免疫缀合物。用于免疫缀合物的各种细胞毒性剂是本领域已知的，并且包括但不限于卡奇霉素、澳瑞他汀、多拉司他汀、度布立新、美登木素生物碱、念珠藻素、倍癌霉素、埃斯波霉素、吡咯并苯二氮卓和烯二炔抗生素。
[0124]
在一些实施方案中，所述结合cd33的多肽是在细胞毒性细胞(诸如t细胞(car-t)或nk细胞(car-nk))上表达的嵌合抗原受体。此类治疗方法可以用于人或动物。在一些实施方案中，提供了治疗人的方法。
[0125]
可以用本文提供的结合cd33的多肽或表达结合cd33的多肽的细胞治疗的非限制性的示例性的癌症包括但不限于淋巴瘤；霍奇金淋巴瘤；非霍奇金淋巴瘤；b细胞淋巴瘤；低分级/滤泡性非霍奇金淋巴瘤(nhl)；小淋巴细胞(sl)nhl；中分级/滤泡性nhl；中分级弥漫性nhl；高分级免疫母细胞nhl；高分级淋巴母细胞nhl；高分级小非裂细胞nhl；巨块病变nhl；套细胞淋巴瘤；艾滋病相关淋巴瘤；华氏巨球蛋白血症；急性髓性白血病(aml)；慢性淋巴细胞白血病(cll)；急性成淋巴细胞性白血病(all)；毛细胞白血病；慢性成髓细胞性白血病。在一些实施方案中，所述癌症是表达cd33的(即，cd33阳性)癌症。
[0126]
可以根据需要向受试者施用所述结合cd33的多肽或表达结合cd33的多肽的细胞。施用频率的确定可以由本领域技术人员(诸如主治医生)根据对被治疗的病症、被治疗的受试者的年龄、被治疗的病症的严重程度、被治疗的受试者的一般健康状况等的考虑来进行。在一些实施方案中，向受试者施用一次或多次有效剂量的结合cd33的多肽或表达结合cd33的多肽的细胞。在一些实施方案中，每天、每半周、每周、每两周、每月一次等向所述受试者施用有效剂量的结合cd33的多肽或表达结合cd33的多肽的细胞。向所述受试者施用至少一次有效剂量的结合cd33的多肽或表达结合cd33的多肽的细胞。在一些实施方案中，可以多次施用有效剂量的结合cd33的多肽或表达结合cd33的多肽的细胞，包括在至少一个月、至少六个月或至少一年的过程中多次施用。
[0127]
在一些实施方案中，药物组合物以有效治疗(包括预防)癌症的量施用。治疗有效量通常取决于被治疗的受试者的体重、他或她的身体或健康状况、待治疗的病症的广泛性或被治疗的受试者的年龄。通常，可以按每剂量约0.05mg/kg体重至约100mg/kg体重范围内的量施用抗体。在一些实施方案中，可以按每剂量约10μg/kg体重至约100mg/kg体重范围内的量施用抗体。在一些实施方案中，可以按每剂量约50μg/kg体重至约5mg/kg体重范围内的量施用抗体。在一些实施方案中，可以按每剂量约100μg/kg体重至约10mg/kg体重范围内的量施用抗体。在一些实施方案中，可以按每剂量约100μg/kg体重至约20mg/kg体重范围内的量施用抗体。在一些实施方案中，可以按每剂量约0.5mg/kg体重至约20mg/kg体重范围内的量施用抗体。在一些实施方案中，可以按每剂量约0.5mg/kg体重至约10mg/kg体重范围内的量施用抗体。在一些实施方案中，可以按每剂量约0.05mg/kg体重至约20mg/kg体重范围内的量施用抗体。在一些实施方案中，可以按每剂量约0.05mg/kg体重至约10mg/kg体重范围内的量施用抗体。在一些实施方案中，可以按约5mg/kg体重或更低(例如少于4、少于3、少于2或少于1mg/kg)的抗体的范围内的量施用抗体。
[0128]
在一些实施方案中，可以通过各种途径在体内施用结合cd33的多肽或表达结合
cd33的多肽的细胞，所述途径包括但不限于静脉内、动脉内、肠胃外、腹膜内或皮下。可以根据预期的应用选择适当的配制品和施用途径。
[0129]
在一些实施方案中，使用结合cd33的多肽的治疗性治疗是通过将细胞毒性剂靶向表达cd33的细胞(诸如表达cd33的癌细胞)来实现。在一些此类实施方案中，所述结合cd33的多肽是在细胞毒性细胞(诸如t细胞或nk细胞)上表达的嵌合抗原受体。药物组合物
[0130]
在一些实施方案中，包含结合cd33的多肽的组合物以具有各种药学上可接受的载体的配制品形式提供(参见例如，gennaro,remington:the science and practice of pharmacy with facts and comparisons:drugfacts plus,第20版(2003)；ansel等人,pharmaceutical dosage forms and drug delivery systems,第7版,lippencott williams and wilkins(2004)；kibbe等人,handbook of pharmaceutical excipients,第3版,pharmaceutical press(2000))。可使用各种药学上可接受的载体，其包括媒介物、佐剂和稀释剂。此外，还可使用各种药学上可接受的辅助物质，诸如ph调节剂和缓冲剂、张力调节剂、稳定剂、湿润剂等。非限制性的示例性的载体包括盐水、缓冲盐水、右旋糖、水、甘油、乙醇及其组合。
[0131]
在一些实施方案中，药物组合物包含以下浓度的结合cd33的多肽：至少10mg/ml、20mg/ml、30mg/ml、40mg/ml、50mg/ml、60mg/ml、70mg/ml、80mg/ml、90mg/ml、100mg/ml、125mg/ml、150mg/ml、175mg/ml、200mg/ml、225mg/ml或250mg/ml。组合疗法
[0132]
可以将结合cd33的多肽或工程化细胞单独施用或与其他治疗模式(诸如其他抗癌剂)组合施用。可以将它们在其他治疗模式之前、基本上同时或之后(即，并行或依次)提供。在一些实施方案中，本文所述的治疗方法可以进一步包括施用：放射疗法、化学疗法、疫苗接种、靶向肿瘤疗法、car-t疗法、溶瘤病毒疗法、癌症免疫疗法、细胞因子疗法、手术切除术、染色质修饰、消融、冷冻疗法、针对肿瘤靶标的反义药剂、针对肿瘤靶标的sirna剂、针对肿瘤靶标的微小rna剂或抗癌/抗肿瘤剂、或生物制剂(诸如抗体、细胞因子或受体细胞外结构域-fc融合物)。
[0133]
在一些实施方案中，将本文提供的结合cd33的多肽与一种或多种化学治疗剂、car-t(嵌合抗原受体t细胞)疗法、溶瘤病毒疗法、细胞因子疗法和/或靶向其他检查点分子(诸如vista、gpnmb、b7h4、hhla2、cd73、ctla4、tigit等)的药剂并行给予。
[0134]
在一些实施方案中，将本公开文本的结合cd33的多肽或工程化细胞与结合以下一种或多种靶标：erbb2、erbb3、erbb4、pdgfr-β、blys、april、bcma、pd-1、pdl1、pdl2、ctla4或一种或多种vegf受体、trail/apo2的其他抗肿瘤剂(诸如抗her-2抗体、抗cd20抗体、表皮生长因子受体(egfr)拮抗剂(例如，酪氨酸激酶抑制剂)、her1/egfr抑制剂(例如，厄洛替尼血小板源性生长因子抑制剂(例如，(甲磺酸伊马替尼))、cox-2抑制剂(例如，塞来昔布)、干扰素、ctla4抑制剂(例如，抗ctla抗体易伊匹单抗)、pd-1抑制剂(例如，抗pd1抗体，bms-936558)、pdl1抑制剂(例如，抗pdl1抗体，mpdl3280a)、pdl2抑制剂(例如，抗pdl2抗体)、细胞因子、拮抗剂(例如，中和抗体))以及其他生物活性剂和有机化学剂等组合使用。
[0135]
在一些实施方案中，将本文提供的结合cd33的多肽或工程化细胞与pd-1/或pd-l1
疗法并行给予。pd-1/pd-l1疗法的例子包括纳武单抗(bms)；匹地利珠单抗(pidilizumab)(curetech，ct-011)；派姆单抗(merck)；德瓦鲁单抗(medimmune/astrazeneca)；阿特珠单抗(genentech/roche)；阿维鲁单抗(avelumab)(pfizer)；amp-224(amplimmune)；bms-936559；amp-514(amplimmune)；mdx-1105(merck)；tsr-042(tesaro/anaptysbio，anb-011)；sti-a1010(sorrento therapeutics)；sti-a1110(sorrento therapeutics)；和针对程序性死亡-1(pd-1)或程序性死亡配体1(pd-l1)的其他药剂。
[0136]
在一些实施方案中，本公开文本的结合cd33的多肽或工程化细胞可以与化学治疗剂组合使用。化学治疗剂的例子包括但不限于烷基化剂，诸如噻替派和环磷酰胺；烷基磺酸酯，诸如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮杂环丙烷，诸如苯佐替派(benzodopa)、卡波醌、美妥替哌(meturedopa)和乌瑞替哌(uredopa)；乙烯亚胺和甲基蜜胺类(methylamelamines)，包括六甲蜜胺、三乙撑蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撑磷酰胺(trietylenephosphoramide)、三乙撑硫代磷酰胺(triethiylenethiophosphoramide)和三羟甲基蜜胺(trimethylolomelamine)；多聚乙酰(尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone))；喜树碱(包括合成类似物拓扑替康)；苔藓抑素；海洋抑素(callystatin)；cc-1065(包括其阿多来新、卡折来新和比折来新合成类似物)；念珠藻素(特别是念珠藻素1和念珠藻素8)；多拉司他汀；倍癌霉素(包括合成类似物、kw-2189和cb1-tm1)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；水鬼蕉碱(pancratistatin)；匍枝珊瑚醇(sarcodictyin)；海绵抑制素(spongistatin)；氮芥，诸如苯丁酸氮芥、萘氮芥、氯磷酰胺(chlorophosphamide)、雌氮芥、异环磷酰胺、二氯甲基二乙胺、盐酸氧化氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法仑、新恩比兴、苯芥胆甾醇(phenesterine)、松龙苯芥、曲磷胺、尿嘧啶氮芥；亚硝基脲，诸如卡莫司汀、氯脲菌素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀和雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素，诸如烯二炔抗生素(例如，卡奇霉素，尤其是卡奇霉素γ1i和卡奇霉素ωi1(参见例如，agnew,chem intl.ed.engl.,33:183-186(1994))；达尼霉素(dynemicin)，包括达尼霉素a；双磷酸盐，诸如氯膦酸盐；埃斯波霉素；以及新制癌菌素发色团和相关的色蛋白烯二炔抗生素发色团)、紫苏素(aclacinomysins)、放线菌素d(actinomycin)、土霉素(authramycin)、偶氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素c(cactinomycin)、卡拉比星(carabicin)、洋红霉素、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycinis)、更生霉素、柔红霉素、地托比星、6-重氮基-5-氧代-l-正亮氨酸、阿霉素(包括吗啉代-阿霉素、氰基吗啉代-阿霉素、2-吡咯啉-阿霉素和脱氧阿霉素)、表柔比星、依索比星、伊达比星、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素(诸如丝裂霉素c)、霉酚酸、诺加霉素、橄榄霉素、培洛霉素(peplomycin)、泛霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星、链黑菌素、链脲菌素、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星；抗代谢物，诸如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-fu)；叶酸类似物，诸如二甲叶酸(denopterin)、甲氨蝶呤、蝶罗呤、三甲曲沙；嘌呤类似物，诸如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，诸如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮杂尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、双脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷；雄激素，诸如卡普睾酮、丙酸甲雄烷酮(dromostanolone propionate)、环硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷、睾内酯；抗肾上腺素，诸如氨鲁米特、米托坦、曲络司坦；叶酸补充剂，诸如叶酸；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基酮戊酸(aminolevulinic acid)；恩
尿嘧啶；安吖啶；贝斯布西(bestrabucil)；比生群；依达曲酯(edatraxate)；去氧胺(defofamine)；秋水仙胺；地吖醌(diaziquone)；依法磷酸(elfornithine)；依利醋氨；埃博霉素；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明(lonidainine)；美登木素生物碱，诸如美登素(maytansine)和安丝菌素；米托胍腙；米托蒽醌；莫吡坦(mopidanmol)；二胺硝吖啶(nitraerine)；喷司他丁；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星；洛索蒽醌；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2-乙酰肼；丙卡巴肼；多糖复合物(jhs天然产物，eugene，or)；丙亚胺；根霉素；西佐喃；锗螺胺(spirogermanium)；替奴佐酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌；2,2',2"-三氯三乙胺；单端孢霉烯(trichothecenes)(尤其是t-2毒素、维拉库林a(verracurin a)、漆斑菌素a(roridin a)和胺癸叮(anguidine)；乌拉坦(urethan)；长春地辛；达卡巴嗪；甘露醇氮芥；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；加息托星(gacytosine)；阿糖胞苷(“ara-c”)；环磷酰胺；噻替派；紫杉烷，例如紫杉醇(bristol-myers squibb oncology，普林斯顿，新泽西州)、紫杉醇的无克列莫佛的白蛋白工程化的纳米粒子配制品(american pharmaceutical partners，schaumberg，伊利诺伊州)和多西他赛(rorer，antony，法国)；苯丁酸氮芥；吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯嘌呤；甲氨蝶呤；铂类似物，诸如顺铂、奥沙利铂和卡铂；长春碱；铂；依托泊苷(vp-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；能灭瘤(novantrone)；替尼泊苷；依达曲沙；道诺霉素；氨基喋呤；希罗达；伊班膦酸盐；伊立替康(camptosar，cpt-11)(包括伊立替康与5-fu和甲酰四氢叶酸的治疗方案)；拓扑异构酶抑制剂rfs 2000；二氟甲基鸟氨酸(dmfo)；类维生素a，诸如视黄酸；卡培他滨；康普瑞汀；甲酰四氢叶酸(lv)；奥沙利铂，包括奥沙利铂治疗方案(folfox)；减少细胞增殖的pkc-α、raf、h-ras、egfr(例如，厄洛替尼)和vegf-a的抑制剂；以及上述任一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
[0137]
其他非限制性的示例性的化学治疗剂包括起到调节或抑制对癌症的激素作用的抗激素剂，诸如抗雌激素和选择性雌激素受体调节剂(serm)，包括例如他莫昔芬(包括他莫昔芬)、雷洛昔芬(raloxifene)、屈洛昔芬、4-羟基他莫昔芬、曲奥昔芬、雷洛昔芬(keoxifene)、ly117018、奥那司酮和托瑞米芬；抑制酶芳香酶的芳香酶抑制剂，所述酶调节肾上腺中的雌激素产生，所述芳香酶抑制剂例如4(5)-咪唑、氨鲁米特、醋酸甲地孕酮、依西美坦、福美斯坦(formestanie)、法倔唑(fadrozole)、伏氯唑、来曲唑和阿那曲唑；和抗雄激素，诸如氟他胺、尼鲁米特、比卡鲁胺、亮丙瑞林和戈舍瑞林；以及曲沙他滨(1,3-二氧戊烷核苷胞嘧啶类似物)；反义寡核苷酸，特别是那些抑制参与异常细胞增殖的信号传导途径中的基因表达的反义寡核苷酸，例如像pkc-α、ralf和h-ras；核酶，诸如vegf表达抑制剂(例如，核酶)和her2表达抑制剂；疫苗，诸如基因疗法疫苗，例如疫苗、疫苗和疫苗；(阿地白介素)ril-2；拓扑异构酶1抑制剂；gnrh激动剂；以及上述任一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
[0138]
在一些实施方案中，将所述结合cd33的多肽和所述另外的药剂配制成单一治疗组
合物，并且同时施用所述结合cd33的多肽和所述另外的药剂。可替代地，所述结合cd33的多肽或工程化细胞和所述另外的药剂彼此分开，例如，各自配制成单独的治疗组合物，并且同时施用所述结合cd33的多肽或工程化细胞和所述另外的药剂，或者在治疗方案期间的不同时间施用所述结合cd33的多肽或工程化细胞和所述另外的药剂。例如，在施用所述另外的药剂之前施用所述结合cd33的多肽或工程化细胞，在施用所述另外的药剂之后施用所述结合cd33的多肽或工程化细胞，或者以交替的方式施用所述结合cd33的多肽或工程化细胞和所述另外的药剂。所述结合cd33的多肽和所述另外的药剂可以按单剂量或按多剂量施用。
[0139]
在一些实施方案中，同时施用所述结合cd33的多肽或工程化细胞和所述一种或多种另外的药剂。例如，可以将所述结合cd33的多肽和所述一种或多种另外的药剂配制成单一组合物或作为两种或更多种单独的组合物施用。在一些实施方案中，依次施用所述结合cd33的多肽或工程化细胞和所述一种或多种另外的药剂，或者在治疗方案期间的不同时间施用所述结合cd33的多肽或工程化细胞和所述另外的药剂。诊断和治疗的非限制性的示例性的方法
[0140]
在一些实施方案中，本文所述的方法可用于评价受试者和/或来自受试者(例如癌症患者)的样品。在一些实施方案中，评价是诊断、预后和/或对治疗的反应中的一种或多种。
[0141]
在一些实施方案中，本文所述的方法包括评价蛋白质的存在、不存在或水平。在一些实施方案中，本文所述的方法包括评价核酸的存在、不存在或表达水平。本文所述的组合物可以用于这些测量。例如，在一些实施方案中，本文所述的方法包括使肿瘤样本或从肿瘤培养的细胞与如本文所述的治疗剂接触。
[0142]
在一些实施方案中，所述评价可以指导治疗(包括用本文所述的抗体的治疗)。在一些实施方案中，所述评价可以指导切除术后辅助疗法的使用或停用。辅助疗法(也称为辅助护理)是在初级、主要或初始治疗之外给予的治疗。通过非限制性示例的方式，辅助疗法可以是通常在手术后给予的另外的治疗，其中所有可检测的疾病均已去除，但是由于隐匿性疾病仍然存在复发的统计学风险。在一些实施方案中，所述多肽用作治疗癌症的辅助疗法。在一些实施方案中，所述多肽用作治疗癌症的唯一辅助疗法。在一些实施方案中，本文所述的多肽不作为治疗癌症的辅助疗法。例如，如果患者不太可能对本文所述的抗体有反应或将具有最小反应，则可能为了生活质量和避免无效化学疗法引起的不必要毒性而不会施用治疗。在此类情况下，可以使用姑息护理。
[0143]
在一些实施方案中，在切除术之前将所述多肽作为新辅助疗法施用。在一些实施方案中，新辅助疗法是指在任何手术之前使肿瘤缩小和/或降级的疗法。在一些实施方案中，新辅助疗法意指在手术之前施用给癌症患者的化学疗法。在一些实施方案中，新辅助疗法意指在手术之前施用给癌症患者的抗体。通常考虑进行新辅助化学疗法的癌症类型包括例如乳腺癌、结直肠癌、卵巢癌、宫颈癌、膀胱癌和肺癌。在一些实施方案中，所述多肽用作治疗癌症的新辅助疗法。在一些实施方案中，在切除术之前使用。
[0144]
在一些实施方案中，本文所述的方法中考虑的肿瘤微环境是以下中的一种或多种：肿瘤血管；肿瘤浸润性淋巴细胞；成纤维细胞网状细胞；内皮祖细胞(epc)；癌症相关成纤维细胞；周细胞；其他基质细胞；细胞外基质(ecm)的组分；树突细胞；抗原呈递细胞；t细胞；调节性t细胞；巨噬细胞；其他淋巴细胞；嗜中性粒细胞；和位于肿瘤附近的其他免疫细
胞。试剂盒
[0145]
还提供了制品和试剂盒，所述制品和试剂盒包括如本文所述的任何结合cd33的多肽以及合适的包装。在一些实施方案中，本发明包括试剂盒，所述试剂盒具有(i)结合cd33的多肽和(ii)使用所述试剂盒向个体施用所述结合cd33的多肽的说明书。
[0146]
用于本文所述的组合物的合适包装是本领域已知的，并且包括例如小瓶(例如，密封的小瓶)、器皿、安瓿、瓶子、罐子、软包装(例如，密封的mylar或塑料袋)等。可以进一步将这些制品灭菌和/或密封。还提供了包含本文所述的组合物的单位剂型。这些单位剂型可以按单个或多个单位剂量储存在合适的包装中，并且也可以进一步灭菌和密封。本发明的试剂盒中所提供的说明书通常是标签或包装插页(例如，所述试剂盒中所包括的纸页)上的书面说明书，但是机器可读的说明书(例如，磁性或光学存储盘上携带的说明书)也是可接受的。与所述抗体的使用有关的说明书通常包括关于用于预期的治疗或工业用途的剂量、给药时间表和施用途径的信息。所述试剂盒可以进一步包括选择合适的个体或治疗的描述。
[0147]
所述容器可以是单位剂量、散装包装(例如，多剂量包装)或亚单位剂量。例如，还可以提供含有足够剂量的本文公开的分子的试剂盒，以在延长的时间段内为个体提供有效治疗，所述延长的时间段诸如约1周、2周、3周、4周、6周、8周、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月或更长时间中的任一个。试剂盒还可以包括多个单位剂量的分子和使用说明书，并且其包装量足以在药房(例如，医院药房和复合药房)中存储和使用。在一些实施方案中，所述试剂盒包括干燥(例如，冻干的)组合物，所述干燥组合物可以重构、再悬浮或再水合以形成总体上稳定的抗体水性悬浮液。实施例
[0148]
下文所讨论的实施例旨在纯粹作为本发明的示例，并且不应当视为以任何方式限制本发明。所述实施例并不旨在表示以下实验是进行的全部或仅有的实验。已经努力确保关于所使用的数字(例如，量、温度等)的准确性，但是应当考虑到一些实验误差和偏差。除非另外指示，否则份数是重量份，分子量是平均分子量，温度是按摄氏度计，并且压力是大气压或接近大气压。实施例1：cd33单结构域抗体
[0149]
靶向人cd33的单结构域抗体是经由用重组版本的人cd33细胞外结构域对美洲驼和羊驼进行免疫而产生的。
[0150]
在产生特异性抗cd33抗体效价后，从500ml来自经免疫动物的血液中分离出美洲驼/羊驼外周血单个核细胞(pbmc)，并且使用qiagen rneasy maxi试剂盒分离出总mrna并且随后使用thermo superscript iv逆转录酶和寡聚dt引发将其转化为第一链cdna。使用cdna作为模板经由pcr特异性扩增出vhh序列，并且将其克隆到酵母表面展示载体中作为vhh-fc-aga2融合蛋白。
[0151]
经由磁珠分离、之后经由荧光激活细胞分选(facs)使用重组形式的cd33ecd富集了展示vhh-fc-aga2融合蛋白的酵母文库。将分选出的酵母均铺，并且将分离出的菌落挑选到96孔块中并使其在将表面展示的vhh-fc的表达转换为分泌到培养基中的培养基中生长。将来自96孔酵母分泌培养物的上清液施加至瞬时转染了cd33的293f细胞(cd33阳性)或未转染的293f细胞(cd33阴性)，洗涤，用荧光团标记的抗人igg1 fc二抗处理，并且通过96孔
流式细胞术分析。
[0152]
将编码与cd33阳性细胞结合而不与cd33阴性细胞结合的vhh的核酸序列与人fc编码区同框克隆到哺乳动物表达载体中，并且使用聚乙烯亚胺通过瞬时转染到hek293 freestyle细胞(293f细胞)或cho细胞中表达。3-7天后收集上清液，通过蛋白a色谱法纯化所分泌的重组蛋白，并且由在280nm处的吸光度和消光系数计算浓度。
[0153]
将包含结合cd33的vhh结构域的单结构域抗体(sdab)的表位使用生物层干涉测量法进行比较。将7ug/ml的avitag
tm-带组氨酸标签的人cd33固定在链霉抗生物素蛋白包被的捕获传感器上。然后将100nm的一种sdab加载到cd33抗原上并且允许其达到平衡。然后将传感器转移到100nm的第二sdab中。测定信号的增加表示结合，表明第二sdab靶向与第一sdab的表位不同的表位。
[0154]
使用人vh3-23种系作为支架使骆驼源性cd33 vhh人源化。有助于溶解度、特异性、稳定性和/或亲和力的骆驼残基保持未修饰。此外，在可能的情况下并且根据需要修饰具有潜在可开发性可能性的氨基酸序列以减轻这种风险。此外，所有人源化变体均含有leu11glu(l11e)修饰，如us 20160207981中所述。
[0155]
结果表明在sdab 1e4、1h9、1g3和1c7的人源化版本中发现了一个表位。如图1所示，hz1e4v2、hz1h9v2、hz1g3v3和hz1c7v1具有共同的表位。实施例2：多肽与cd33的结合
[0156]
通过流式细胞术评估了sdab与人cd33的结合。每种sdab包含如下表3所指示的vhh结构域和人igg1 xell fc区，在其中缺失了氨基酸glu233、leu234和leu235(根据eu编号)(seq id no:75)。将molm-13细胞用编码包含“cd33m”的序列(seq id no:112)的质粒或编码包含截短版本“cd33m”的序列(seq id no:113)的质粒瞬时转染。由cd33m质粒编码的序列包括前导序列、全细胞外结构域、跨膜结构域和胞质结构域。由cd33m质粒编码的序列包括前导序列、近膜igc2结构域和跨膜结构域。将未转染的hek 293细胞用作cd33阴性细胞。将每种细胞类型以在facs缓冲液(pbs 1％bsa，0.1％nan
3 ph 7.4)中的30,000个细胞/孔铺板在96孔圆底板上。将sdab在facs缓冲液中以3倍11点连续稀释进行稀释。将sdab稀释液添加到铺板的细胞中，并且将测定板在4℃下孵育30分钟。在150μl的facs缓冲液中洗涤两次后，将在每个孔中的细胞再悬浮在100μl的在facs缓冲液中的1:2000alexa fluor 647缀合的抗人igg二次稀释液中，并且在4℃下孵育30分钟。将细胞再洗涤两次，然后通过流式细胞术检测结合的抗体。
[0157]
在intellicyte ique plus上进行流式细胞术分析，并且以中值荧光强度绘制荧光。在prism图形软件中使用单位点结合非线性回归确定表观亲和力(kd，nm)。
[0158]
如图2a至图2m所示，所测试的sdab展示出cd33结合，并且不结合不表达cd33的未转染的细胞。表观结合亲和力在下表3中示出。表3sdabcd33亚型表观kd(nm)vhh结构域的seq id no1e4cd33m0.0518hz1e4v2cd33m0.32421h9cd33m0.1434hz1h9v2cd33m0.2746
1g3cd33m0.4926hz1g3v3cd33m1.60441c7cd33m6.6414hz1c7v1cd33m6.2540hz1c7v11cd33m5.4541a07cd33m53.502a07cd33m19.902hza07v4cd33m56.6138hza07v4cd33m11.7638f02cd33m15.2522f02cd33m5.1522hzf02v18cd33m14.8343hzf02v18cd33m9.1343hzb07v7cd33m0.7539g11cd33m1.130hzg11v2cd33m2.6745
[0159]
在不脱离本公开文本的精神或本质特征的情况下，本公开文本可以按其他特定形式实施。因此，前述实施方案在所有方面均被认为是说明性的，而不是对本公开文本的限制。因此，本公开文本的范围由所附权利要求指示而不是由前述描述指示，并且因此在权利要求的等效含义和范围内的所有变化均旨在包含在本文中。某些序列的列表