一种热稳定性增强的h7n9禽流感病毒ha蛋白及其制备方法和应用
技术领域
1.本发明涉及一种热稳定性增强的h7n9禽流感病毒ha蛋白及其制备方法和应用。


背景技术：

2.禽流感(avian influenza,ai)是由禽流感病毒(avian influenza virus,aiv)引起的绝大多数野生禽类和家禽都可感染的一种急性传染病，对我国养禽业构成了严重威胁。疫苗免疫是目前防控禽流感最主要的措施。现阶段，我国防控h7n9禽流感仍然依赖传统的胚毒灭活疫苗，但此类疫苗存在一定弊端，诸如生产周期容易受到鸡胚供应不足影响，生产过程存在操作活毒引起的生物安全风险以及人工成本高昂等等。因此，为了弥补传统灭活疫苗的不足之处，亟需研发改进的新型禽流感疫苗。亚单位疫苗作为新型基因工程疫苗的一种，经多项研究证实，能为机体提供有效的免疫保护。亚单位疫苗的特点在于不含病毒核酸而无感染性，且其生产过程不涉及鸡胚繁殖，既规避了散播病毒的生物安全问题，相比传统的灭活疫苗也极大地缩短了生产周期。
3.流感病毒表面的血凝素(hemagglutinin,ha)和神经氨酸酶(neuraminidase,na)是两种主要的病毒囊膜糖蛋白，当前研发禽流感亚单位疫苗选用最广泛的抗原是血凝素ha，其以三聚体的形式存在于病毒囊膜表面，结构由变异性较高的球状头部结构域和较为保守的茎部结构域组成。然而，禽流感亚单位疫苗所诱导的免疫应答强度还有进一步提升的空间，这仍然是当前禽流感亚单位疫苗研发寻求突破的重要目标。
4.对于以抗原蛋白为主要组成成分的亚单位疫苗而言，抗原蛋白的稳定性是至关重要的因素之一。一方面，增强抗原蛋白的稳定性可减缓抗原蛋白的降解；另一方面，增强抗原蛋白的稳定性可进一步提升抗原蛋白的免疫原性。国外研究团队通过融合外源序列实现ha蛋白的三聚化或者寡聚化，增强了ha蛋白的结构稳定性，进而在免疫动物体内表现出增强的免疫原性。此外，国内学者发现a型流感h3n2 ha蛋白跨膜区两个半胱氨酸突变后会对ha蛋白的热稳定性和融合活性产生影响，进一步将h3n2 ha蛋白跨膜结构域引入其他亚型(如h1、h5、 h7和h9)的流感ha蛋白后，可为小鼠和鸡提供增强的异源保护。这些研究充分说明了增强免疫原的稳定性从而进一步提高免疫原性是可行的。
5.针对当前禽流感疫苗存在的问题，研制一种改进的禽流感亚单位疫苗是目前市场急需的。有鉴于此，特在此提出本发明。


技术实现要素：

6.本发明的第一目的在于提供一种热稳定性增强的h7n9禽流感病毒ha蛋白；另一目的在于提供上述热稳定性增强的h7n9禽流感病毒ha蛋白的制备方法；再一目的在于提供上述热稳定性增强的h7n9禽流感病毒ha蛋白的应用。
7.为实现上述目的，所采取的技术方案：一种热稳定性增强的h7n9禽流感病毒ha蛋白，所述热稳定性增强的h7n9禽流感病毒ha蛋白的氨基酸序列如seq id no:2所示。
8.优选地，编码上述所述热稳定性增强的h7n9禽流感病毒ha蛋白的基因的核苷酸序列如 seq id no:1所示。
9.本发明提供了一种禽流感亚单位疫苗，包括上述所述的热稳定性增强的h7n9禽流感病毒 ha蛋白。
10.优选地，所述禽流感亚单位疫苗还包含佐剂。
11.优选地，所述佐剂为白油佐剂、seppic montanidetm gel 02pr、seppicmontanidetm isa 201vg、seppic montanide
tm isa 71vg或seppic essai isa 78 vg。本发明所述的热稳定性增强的h7n9禽流感病毒ha蛋白可配合多种油乳佐剂使用，与 seppic montanide
tm isa 71vg配合免疫spf鸡后可引起理想的hi抗体水平，针对异源 h7n9禽流感毒株的致死性攻击可提供完全临床保护，为研制改进的禽流感疫苗提供了新的思路。
12.本发明提供了一种上述所述的h7n9禽流感病毒ha蛋白的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
13.(1)扩增热稳定性增强的h7n9禽流感病毒ha蛋白基因，然后经限制性内切酶消化后插入到pacebac1转移质粒的ph启动子后面，构建重组转移质粒pacebac1-ha
(t)
；
14.(2)将重组转移质粒pacebac1-ha
(t)
转化dh10bac大肠杆菌，通过转座重组，获得重组杆状病毒质粒bacmid-ha
(t)
；
15.(3)用脂质体法将重组杆状病毒质粒bacmid-ha
(t)
转染sf9昆虫细胞从而获得重组杆状病毒rbv-pa1-ha
(t)
；
16.(4)将获得的重组杆状病毒rbv-pa1-ha
(t)
继续感染sf9昆虫细胞或high-five昆虫细胞即可获得热稳定性增强的h7n9禽流感病毒ha蛋白。
17.优选地，所述步骤(1)中扩增热稳定性增强的h7n9禽流感病毒ha蛋白基因包括以下步骤：
18.以禽流感病毒株h7n9-rgd79的ha基因作为底物模板，采用重叠pcr进行碱基定点突变并扩增，重叠pcr所用的引物包括如seq id no:3所示和如seq id no:4所示的引物对，以及如seq id no:5所示和如seq id no:6所示的引物对。
19.优选地，所述步骤(1)中扩增热稳定性增强的h7n9禽流感病毒ha蛋白基因得到的pcr 产物的n端融合kozak序列，扩增热稳定性增强的h7n9禽流感病毒ha蛋白基因得到的pcr 产物的c端融合6
×
his标签。
20.优选地，所述步骤(1)中扩增热稳定性增强的h7n9禽流感病毒ha蛋白基因得到的pcr 产物的两端分别引入bamhⅰ和ecorⅰ酶切位点。
21.优选地，所述重组杆状病毒的原始病毒为苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒(acmnpv)。
22.本发明提供了热稳定性增强的h7n9禽流感病毒ha蛋白在制备禽流感疫苗中的应用，所述热稳定性增强的h7n9禽流感病毒ha蛋白的氨基酸序列如seq id no:2所示。
23.有益效果：
24.本发明提供了一种热稳定性增强的h7n9禽流感病毒ha蛋白，相比较野生型ha蛋白，具有更强的热稳定性和免疫原性。所述热稳定性增强的h7n9禽流感病毒ha蛋白与seppicmontanide
tm isa 71vg配合免疫spf鸡后，相比较野生型ha蛋白，可刺激机体更快地产生更高水平的hi抗体，并提供针对异源h7n9禽流感病毒致死性攻击的完全临床保护，同
时减少攻毒后鸡群的排毒量。本发明提供的编码热稳定性增强的h7n9禽流感病毒ha蛋白的基因可以通过重叠pcr进行定点突变和扩增合成，操作便捷。本发明提供的热稳定性增强的h7n9禽流感病毒ha蛋白可以由昆虫-杆状病毒表达系统bac-to-bac表达，制备方法简易，成本低廉，适合大批量生产。
附图说明
25.图1为重组质粒pacebac1-ha
(t)
的鉴定结果图，其中m为dna marker(dl 5000 marker)；1为bamhi、ecori双酶切质粒pacebac1-ha
(t)
获得的dna片段；nc为以ddh2o 为模板的阴性对照。
26.图2为重组杆粒bacmid-ha
(t)
的鉴定结果图，其中m为dna maker(dl 5000marker)； 1-7为以阳性重组白斑为模板扩增外源基因；nc为以阴性蓝斑为模板扩增的阴性对照。
27.图3为重组杆状病毒rbv-pa1-ha
(t)
ifa鉴定结果图。
28.图4为重组蛋白ha(t)血凝活性鉴定结果图。
29.图5为重组蛋白ha(t)western blot鉴定结果图，其中m为protein maker(170kda)；1-5为不同批次制备的ha(t)样品；nc为对照细胞处理样品。
30.图6为重组蛋白ha(t)热稳定性评估结果图，其中a图为热处理温度为4℃-52℃，处理时间为30min时，重组ha蛋白的ha活性变化；b图为热处理温度为49.5℃-51.5℃，处理时间为30min时，重组ha蛋白的ha活性变化。
31.图7为免疫后鸡hi抗体水平的检测结果图，其中a图为免疫后2周hi抗体水平；b图为免疫后3周hi抗体水平。
32.图8为攻毒后鸡的存活结果。
具体实施方式
33.为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。
34.实施例1
35.1.重组杆状病毒的构建与鉴定
36.1.1.目的基因ha
(t)
的获得
37.以禽流感病毒株h7n9-rgd79的ha基因作为底物模板，通过重叠pcr技术，对ha基因编码蛋白的氨基酸位点进行定点突变，上述热稳定性增强的h7n9禽流感病毒ha蛋白的氨基酸突变位点为169，氨基酸突变为苏氨酸到丙氨酸的突变,以获得突变ha基因，命名为ha
(t)
，并在基因上游引入bamhⅰ酶切位点、kozak序列，下游引入6
×
his标签、ecorⅰ酶切位点，扩增引物如下：
38.p1：5'-cgggatccatgaacactcagatcctggt-3'；
39.p2：5'-agcgttgtcggtgttggaca-3'；
40.p3：5'-tgtccaacaccgacaacgc-3'；
41.p4：5'-cggaattcttagtgatggtggtgg-3'；
42.引物的扩增条件为：94℃预变性5min；98℃变性30sec；55℃退火45sec；72℃延伸1min；其中变性、退火及延伸共进行35个循环后72℃终延伸2min。
43.1.2.重组转递质粒pacebac1-ha
(t)
的构建与鉴定
44.回收扩增的目的基因产物，与空载转递质粒pacebac1一并用限制性内切酶bamhi和 ecori进行双酶切后，经t4连接酶连接插入到转递质粒pacebac1的ph启动子后面的bamhi 和ecori位点之间，接着转化大肠杆菌dh5a感受态细胞，获得阳性重组载体，命名为 pacebac1-ha
(t)
。用限制性内切酶bamhi和ecori对获得的重组阳性质粒进行酶切鉴定，结果如图1所示，并对该质粒进行测序，测序结果正确。
45.1.3.重组杆粒bacmid-ha
(t)
的构建与鉴定
46.将重组转递质粒pacebac1-ha
(t)
转化大肠杆菌dh10bac感受态细胞，通过转座重组，获得重组杆粒，命名为bacmid-ha
(t)
，按照invitrogen公司bac-to-bac杆状病毒系统操作手册的说明，用m13引物扩增特异性片段进行鉴定，结果正确，如图2所示。
47.2.重组杆状病毒rbv-pa1-ha
(t)
的获得与鉴定
48.2.1.重组杆状病毒rbv-pa1-ha
(t)
的获得
49.根据invitrogen公司bac-to-bac杆状病毒系统操作手册，利用脂质体介导转染法，将重组杆粒bacmid-ha
(t)
转染sf9细胞，放置于27℃恒温培养箱进行培养，待培养至72h时，细胞出现明显病变，离心收集培养上清液，即可获得第一代(p1)重组杆状病毒rbv-pa1-ha
(t)
。
50.2.2.重组杆状病毒rbv-pa1-ha
(t)
的扩增
51.采用摇瓶悬浮培养的方式进行重组杆状病毒的扩增传代。待sf9细胞密度达到2
×
10
6-3
×
10
6 cell/ml时，以moi＝0.1-0.5向sf9细胞中接种p1代重组杆状病毒，放置于27℃恒温摇床进行悬浮培养，摇床转速设置为120-130rpm/min，培养基选择sf-900tm ii sfm，培养48-72h后收取培养上清即为扩增的子代重组杆状病毒。
52.2.3.重组杆状病毒rbv-pa1-ha
(t)
ifa鉴定
53.6孔细胞培养板中接入sf9细胞，使密度保持约1
×
105cell/孔，放置于27℃恒温培养箱中培养，待第二天细胞长至70％-80％单层状态时，小心吸弃旧的培养基，用1％双抗pbs小心清洗细胞3遍，加入新的sf-900tm ii sfm培养基，然后小心滴加适量的重组杆状病毒 rbv-pa1-ha
(t)
，放置于27℃恒温培养箱中培养48-72h。培养结束后取出6孔细胞培养板，小心吸弃培养上清，用pbs小心清洗3遍，用4％多聚甲醛室温固定15min，再用pbs小心清洗 3遍；向细胞孔中加入抗his标签鼠单克隆抗体(1:3000)，37℃作用30min，然后用pbs小心清洗3遍；向细胞孔中加入fitc标记的羊抗鼠igg二抗(1:500)，37℃作用30min，然后用pbs 小心清洗3遍，放置于倒置荧光显微镜下观察是否有特异性荧光。结果如图3所示，重组杆状病毒rbv-pa1-ha
(t)
感染的sf9细胞能产生特异性的免疫荧光，说明重组杆状病毒 rbv-pa1-ha
(t)
能够感染sf9细胞，并能在ph启动子的作用下表达外源蛋白。
54.3.重组蛋白ha(t)的表达、鉴定及热稳定性评估
55.3.1.重组蛋白ha(t)的表达
56.采用摇瓶悬浮培养的方式进行重组ha蛋白的表达。待high-five细胞密度达到1
×
10
6-2
×
10
6 cell/ml时，以moi＝1-5向high-five细胞中接种p2代重组杆状病毒，放置于27℃恒温摇床进行悬浮培养，摇床转速设置为120-130rpm/min，培养基选择hf-502c，培养48-72h。培养结束后离心收集细胞，用pbs重悬细胞后进行超声波处理，超声处理条件为：工作时间4s，间歇时间6s，工作功率200～300w，破碎时间为5-10min，超声处理结束即可获得目
的蛋白。
57.3.2.重组蛋白ha(t)的血凝活性鉴定
58.在96孔微量反应板的1-12孔加入25μl pbs，吸取25μl的待测蛋白样品悬液加入到第1 孔中，依次倍比稀释至第11孔弃去，每孔均加入25μl 1％的鸡红细胞悬液，室温下孵育15-20min 后，观察结果。经血凝实验鉴定，表达的目的蛋白ha(t)具有良好的血凝活性，效价达到12log2，如图4所示。
59.3.3.重组蛋白ha(t)的western blot鉴定
60.按照western blot常规实验方法进行鉴定，结果表明目的蛋白表达正常，如图5所示，可见明显的目的蛋白条带，约63kda，与预期产物条带相符。
61.3.4.重组蛋白ha(t)的热稳定性评估
62.将重组蛋白ha(t)原液与作为对照的野生型ha蛋白原液分别进行2倍倍比稀释，选择血凝效价为8log2-10log2的稀释蛋白样品进行实验，设置温度梯度为36℃-52℃，采用pcr仪进行热处理，处理时间为20-30min，处理结束后测定各样品血凝效价，根据效价变化进行评估。结果如图6所示，突变后的ha蛋白热稳定性得到增强，尤其在46℃-51℃之间表现明显。
63.4.重组蛋白ha(t)的免疫原性评估
64.4.1.抗原灭活
65.采用bpl病毒灭活方法对抗原蛋白ha(t)进行杆状病毒灭活，具体方法如下：
66.用灭菌pbs对bpl灭活剂进行适当比例的稀释，以便后续实验操作；根据实际用量，取抗原液与稀释的bpl灭活剂加入无菌三角摇瓶中进行混合，并使bpl终浓度保持在 0.1％-0.8％，置于4℃摇床，避光，30rpm轻摇进行病毒灭活，灭活时间为12h-24h。
67.灭活结束后取灭活抗原液在sf9细胞上盲传两代，经验证残留杆状病毒灭活彻底，可用于后续实验。
68.4.2.疫苗制备
69.按照seppic montanide
tm isa 71vg佐剂使用说明书，根据具体用量，取灭活抗原液与71vg佐剂进行混合配备疫苗。
70.4.3.免疫程序
71.2周龄spf鸡随机分为4组并标记，每组10只。免疫分组：第一组为rgd79全病毒灭活疫苗组，每只鸡免疫剂量为300ul；第二组为ha(t)蛋白组，每只鸡免疫剂量为60μg/300μl；第三组为对照的野生型ha蛋白组(ha-wt)，每只鸡免疫剂量为60μg/300μl；第四组为pbs 对照组，每只鸡接种300ul pbs；免疫接种方式均采用皮下注射；免疫后第2、3周通过颈静脉采血分离血清进行后续实验。
72.4.4.血清hi抗体检测
73.在96孔微量反应板的1-11孔加入25ul pbs，第12孔加入50ul pbs。吸取25ul待测血清样品加入到第1孔，依次倍比稀释至第10孔，向1-11孔加入25ul灭活的4hau抗原液，室温孵育1h。每孔均加入25ul 1％的鸡红细胞悬液，室温孵育1h后，观察结果。
74.结果显示：
75.免疫后第二周，对于h7n9-e157毒株，突变蛋白ha(t)组平均hi抗体效价为5.1log2，与野生型ha组(4log2)存在显著差异，与灭活疫苗组(2.1log2)存在极显著差异；
对于 h7n9-e664毒株，突变蛋白ha(t)组平均hi抗体效价为7.6log2，野生型ha组为6.3log2，灭活疫苗组为3.1log2，ha(t)组平均hi抗体水平与后两组的平均hi抗体水平均存在极显著差异。
76.免疫后第三周，对于h7n9-e157毒株，突变蛋白ha(t)组平均hi抗体效价为6.6log2，与野生型ha组(5.8log2)存在显著差异，与灭活疫苗组(4.6log2)存在极显著差异；对于 h7n9-e664毒株，突变蛋白ha(t)组平均hi抗体效价为9log2，野生型ha组平均hi抗体效价为8.2log2，两者差异不显著。
77.对于pbs对照组，全程未检测到hi抗体，结果如图7所示。以上结果说明免疫突变蛋白ha(t)后可更快速地刺激机体产生更高水平的hi抗体。
78.5.攻毒保护实验研究
79.5.1.攻毒后拭子排毒检测
80.免疫后3周，对所有鸡进行滴鼻攻毒，攻毒毒株为 a/chicken/guangdong/e157/2017(h7n9-e157)，攻毒剂量为106eid
50
/200ul，攻毒后第5天采集口咽和泄殖腔拭子，按照常规实验方法用spf鸡胚进行病毒分离检测，结果如表1所示。
81.表1攻毒后鸡拭子排毒的检测结果。
[0082][0083]
5.2.攻毒后鸡的存活情况
[0084]
攻毒后连续14天对鸡进行观察，具体包括鸡每天的食欲饮欲，精神状况，存活情况等。
[0085]
结果如图8所示，pbs对照组在攻毒后第3天全部死亡，保护率为0％，死亡鸡发病过程快，症状明显。灭活疫苗组、ha(t)蛋白组、野生型ha蛋白组所有鸡均存活，保护率为100％。其中，灭活疫苗组有5只鸡攻毒后第2-3天有较明显的发病迹象，野生型ha蛋白组有2只鸡在攻毒后第3天有轻度发病症状，ha(t)蛋白组的鸡全程无发病症状，食欲饮欲及精神体况良好，实验结束后体重增加明显。
[0086]
上述所有实验结果表明：(1)h7n9-rgd79毒株ha蛋白经氨基酸169位点突变(苏氨酸突变为丙氨酸)后，ha蛋白热稳定性得到增强。(2)突变后的ha蛋白免疫原性得到进一步提升，表现为单次免疫后可诱导机体更迅速地产生更高水平的hi抗体。(3)突变后的ha蛋白配合seppic montanide
tm isa 71vg佐剂免疫spf鸡后，在应对异源毒株h7n9-e157 攻击时可提供100％的临床保护，并降低排毒。
[0087]
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。