1.本发明属于生物医药技术领域，涉及一种食管癌的检测方法，具体涉及一种基于血清糖蛋白寡糖链检测(g-test)特异指纹图谱的食管癌检测方法。
背景技术：
2.食管癌是(esophageal carcinoma)人类常见的恶性肿瘤，占食管肿瘤的90％以上，在全部恶性肿瘤死亡回顾调查中仅次于胃癌而居第2位。据估计全世界每年大约有20万人死于食管癌，是最常见的恶性肿瘤之一。早期食管癌无明显临床症状，多是因局部病灶刺激食管蠕动异常或痉挛，或因局部炎症、糜烂、表浅溃疡、肿瘤浸润所致，常反复出现，间歇期可无症状可持续几年时间。中期食管癌的典型症状是进行性吞咽困难，由于食管壁具有良好的弹性及扩张能力，在癌未累及食管全周一半以上时，吞咽困难症状尚不显著。咽下困难的程度与病理类型有关，缩窄型和髓质型较其他型为严重。初发症状不是咽下困难者占20％～40％，而造成食管癌的诊断延误。晚期食管癌的症状：多因压迫及并发症引起，并且可以发生淋巴及血行转移。食管病变段有溃疡、炎症或是肿瘤外侵，则产生胸骨后或背部持续性隐痛。癌肿压迫气管，可出现咳嗽及呼吸困难，有时由于食管高度梗阻，产生逆蠕动使食管内容物误吸入气道造成感染。癌组织侵透纵隔、气管、支气管、主动脉，形成纵隔炎、气管食管瘘，发生肺炎、肺脓肿，甚至致命性大出血等。病人因咽下困难出现营养不良，脱水等恶病质。若有骨、肝、脑等重要脏器转移，可出现骨痛、黄疸、腹水、昏迷等症状。
3.目前食管癌的病因虽尚未完全明了，但与强致癌物、促癌物，缺乏一些抗癌因素以及有遗传易感性等相关。涉及亚硝胺、营养、微量元素、真菌及病毒、遗传等多方面。一般认为食管癌的发生可能是多种因素综合作用的结果，并且与生活饮食习惯有关如吸烟与饮酒。
4.食管癌疾病诊断方法：1.食管脱落细胞学检查，有确诊价值，方法简便，受检者痛苦小，假阳性率低。2.对肿瘤标志物现在还没有高灵敏度和特异性的的标记物。鳞状细胞癌相关抗原(scc-ra)是最敏感的免疫标记物，在良性食管瘤中常为阴性，而在食管癌病人血清阳性率为40％～52％，但是在早期癌食管癌中灵敏度低，显示是阴性。其他肿瘤标记物如癌胚抗原(cea)、ca-50、ca19-9等都不能提供可靠的预后指标。3.dna倍体与肿瘤之组织学关系密切，但与临床病期无关。因此缺乏简单，快速，高灵敏度和特异度的食管癌疾病诊断的生物标志物进行无创快速的诊断方法来辅助早期诊断。而血清g-test糖组学检测技术正好满足这些条件，因此具有良好的应用前景。
5.蛋白质的糖基化(glycosylation)是一种最常见的蛋白翻译后修饰，是在糖基转移酶作用下将糖类转移至蛋白质和蛋白质上特殊的氨基酸残基形成糖苷键的过程。大多数的糖蛋白都是分泌蛋白，广泛存在于细胞膜、细胞间质、血浆以及粘液中。有些酶和激素是糖蛋白。糖蛋白具有多种生物功能。有些糖蛋白如原胶原是结构蛋白质。许多酶和激素(如黄体生成素、促甲状腺激素等)有糖蛋白结构，血液中的许多糖蛋白担负无机离子(fe2+、ca2+、cu2+等)和激素等生物活性物质的运输，血液凝固(纤维蛋白原是糖蛋白)和抗体活性
等生物功能。凝集素有凝集细胞的能力，糖链还可起稳定肽链的作用。糖蛋白的另一重要功能是直接或间接地参与细胞表面的种种识别现象。由于糖蛋白中糖链对于维持机体生物学功能的重要性，糖链的改变有助于阐明炎症、肿瘤细胞对周围组织侵袭及转移等异常生物行为学的分子机理。目前，己经在多种肿瘤中发现了n-糖链的改变。
6.糖链是重要的生物信息分子，在许多生理和病理过程中都发挥着独特作用。糖链结构非常复杂，具有微观不均一性，其分析和结构解析一直是糖生物学研究的瓶颈。目前糖链结构的分析方法发展迅速，主要包括(1)高效液相色谱法(hplc)：分辨率高，检测速度快，重复性高，高效液相色谱柱可以反复使用，但是柱效会随着使用次数的增加而变低，且流动相有毒，设备操作需要受过严格培训的专业人才进行，且设备相对昂贵，溶剂需要严格纯化；(2)质谱法(ms)：质谱具有灵敏度高、可获得多种结构信息和适于分析混合物等优点，是糖链定性定量分析的一种理想手段。但是质谱仪器精密，设备操作复杂，且质谱仪价格昂贵，不适合临床上普及推广使用；(3)毛细管电泳法(ce)：毛细管电泳成本低、柱效高、灵敏度高、速度快、进样量少、操作简单，但是重复性不高，稳定性不如hplc。
7.g-test检测法(glycan-test)是基于dna分析仪的毛细管微电泳技术(dsa-face)，将前列腺液样本中糖蛋白的n-糖链进行荧光标记后，用毛细管微电泳进行分离，通过测量荧光信号得到的n-寡糖链的含量即指纹图谱(简称g-test图谱)。该检测技术具有灵敏度高、操作简单、微量(2μl血清)、重复性高、稳定性好、高通量(96-孔板)等其他糖链分析技术无法比拟的优点，适用于一般检验科室，可望用于临床推广使用。
技术实现要素：
8.本发明采用的技术方案如下：
9.一种食管癌监测试剂，由以下试剂组成：
10.试剂a：浓度为10mm的碳酸氢铵溶液中加入质量浓度0.5～5％的sds配制而成；
11.试剂b：由0.01～10u/10μl糖胺酰酶和0.01～10u/10μl唾液酸酶混合配制而成，混合溶液ph值为4～9；
12.试剂c：由8-氨基芘-1,3,6-三磺酸溶于dmso中配制而成，浓度为0.01mm～1m；
13.试剂d：终止液。
14.优选地，所述试剂a、试剂b与试剂c的体积比为2：2：1。
15.一种食管癌检测试剂的制备方法，包括以下步骤：
16.步骤一寡糖链的制备
17.在经过灭活处理的2μl血清样品中加入4μl试剂a，进行变性，降温到室温后，加入4μl试剂b，孵育1～6h；
18.步骤二寡糖链的标记
19.在步骤一得到的液体中加入2μl试剂c，进行荧光标记，然后加入150μl试剂d终止标记反应；
20.步骤三寡糖链分离分析
21.取10μl步骤二处理后的液体，用分析仪进行糖链分离，得到图谱。
22.优选地，所述步骤一寡糖的制备中变性温度为不低于75℃加热，孵育温度为不低于25℃。
fucosylatedbiantennary)；na3，三天线(triantennary)。
47.图2是模型建立后的roc曲线图；检测样本通过函数ng1a2f/na3用于鉴别食管癌的roc曲线；检测样本总数为131例，其中食管癌患者血清61例，正常人对照组血清70例，得到曲线下面积auc＝0.804。
具体实施方式
48.下面结合实施例和附图对本发明作进一步详述。需要说明的是，下列实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件试验，或按照制造厂商建议的条件。
49.实施例1检测食管癌
50.通过测定血清糖蛋白寡糖链g-test特异指纹图谱，进行统计学分析，采用的材料和方法：
51.一、检测样本：收集食管癌患者和正常对照人的血清。
52.二、实验设备：糖组分析仪，pcr，离心机。
53.三、试剂制备：
54.试剂a：浓度为10mm的碳酸氢铵溶液中加入质量浓度0.5～5％的sds配制而成；
55.试剂b：由0.01～10u/10μl糖胺酰酶和0.01～10u/10μl唾液酸酶混合配制而成，混合溶液ph值为4～9；
56.试剂c：由8-氨基芘-1,3,6-三磺酸溶于dmso中配制而成，浓度为0.01mm～1m；
57.试剂d：终止液。
58.四、糖测序检测步骤：
59.步骤一寡糖链的制备
60.在经过灭活处理的2μl血清样品中加入4μl试剂a，进行变性，降温到室温后，加入4μl试剂b，孵育1～6h；
61.步骤二寡糖链的标记
62.在步骤一得到的液体中加入2μl试剂c，进行荧光标记，然后加入150μl试剂d终止标记反应；
63.步骤三寡糖链分离分析
64.取10μl步骤二处理后的液体，用分析仪进行糖链分离，得到图谱。
65.五、监测对比分析
66.利用g-test检测技术对收集的131例食管癌患者和正常人对照组的血清样本进行处理，其中食管癌患者血清61例，正常人对照组血清70例。对g-test检测技术测定样本得到的n-糖组图谱进行统计学分析。
67.将每个峰峰高值除以所有峰高度的总和，定量计算得到每个峰的相对含量，即n-糖组图谱峰值量化，然后对量化后的食管癌组和正常对照组n-糖组图谱中9个寡糖峰进行比对统计分析。如图1所示，人血清的g-test指纹图谱显示出9个n-寡糖链峰，寡糖链因分子大小的不同而表现出不同的迁移率，即表现在g-test指纹图谱上的不同的峰则代表了不同的寡糖链，所测出的峰高代表了寡糖链的相对浓度含量，图1a为正常对照组，图1b为食管癌组。n-糖组图谱的通过ng1a2f/na3的比值来检测食管癌。
68.对g-test指纹图谱的各个峰值进行量化，然后对食管癌组(61例)和正常对照组(70例)进行统计学分析，通过九个峰建立模型来预测食管癌，发现在两组的区分上具有统计学意义(p＜0.05)。roc曲线分析显示，模型在检测食管癌患者时具有显著的临床意义，即auc可达0.804(图2)。由此说明血清中九个寡糖峰可以作为食管癌的标志物。
69.以上所述的具体实施例，结合附图对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，本领域技术人员所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。