专利名称：普伐他汀钠的纯化方法
技术领域：
本发明涉及从发酵液中纯化普伐他汀钠的方法。
背景技术：
心血管疾病是人类死亡的主要原因之一，其发病率与死亡率都高居所有疾病之首。经研究证实心血管疾病的主要病理基础为动脉粥样硬化，高血脂症是导致动脉粥样硬化的首要因素，因此降脂药在减少心血管疾病发病率方面的重要性已引起人们的关注。
在众多类型的降血脂药物中，八十年代初发展起来了一类羟甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂，即他汀类药物，由于它们降低胆固醇的高效性，抑制胆固醇合成的高度选择性以及低毒性，已成为心血管药物研制中最活跃，发展最迅速的领域，这类他汀类药物主要包括洛伐他汀，辛伐他汀，普伐他汀钠，氟伐他汀与阿托伐他汀等。
普伐他汀钠(pravastatin sodium)是近年发展起来的一种新型他汀类降血脂药物，它最初由日本三共株式会社研制并开发上市。目前普伐他汀钠是在同类他汀药物中最有治疗优势的品种，它能有选择性地抑制人体内肝脏与小肠中的胆固醇合成，而在其它器官中分布极小。
工业上生产普伐他汀钠的方法为两步发酵法。在第一步发酵中，通过青霉属的一些微生物的培养获得前体化合物美伐他汀，其结构式为(I)；在第二步中通过微生物转化将美伐他汀羟化为普伐他汀钠，其结构式为(II)。

从发酵液中纯化普伐他汀钠的现有方法都是采用有机溶媒对发酵液直接进行抽提，所选用的有机溶媒一般为乙酸乙酯，乙酸丁酯等低级醇的酯，这一方法在工业化生产中面临两个问题首先，由于普伐他汀钠发酵液中存在有大量的化学结构与普伐他汀钠相类似的杂质，通过有机溶媒的抽提过程并不能很好地去除这些杂质，因而酯相中普伐他汀钠的纯度较低；其次，由于普伐他汀钠在发酵液中的浓度一般很低，仅为0.5-5g/L，用有机溶媒抽提法纯化普伐他汀钠时需要使用大量的溶媒(一般为发酵液的1-2.5倍)，这样在工业化大规模生产过程中会带来较为严重的环境污染与三废问题，且危害生产操作人员的健康。因此，在工业化大规模生产纯化普伐他汀钠的技术领域中一直在寻找不需要大量溶媒的纯化方法，从而克服上述现有技术中存在的缺陷，并提高普伐他汀钠的纯度。

发明内容
本发明的一个目的是提供一种不需要大量溶媒的并使普伐他汀钠纯度提高的从发酵液中纯化普伐他汀钠的方法。
本发明的目的是通过这样的构思实现的一种普伐他汀钠的纯化方法，包括a)使含有普伐他汀钠的发酵液与吸附树脂接触，b)使发酵液与所述的树脂分离，c)用选自水、有机溶剂或它们的混合物的洗涤液洗涤步骤b)中留下的吸附树脂，所述的有机溶剂可以是C1-4醇、C1-4酮等；和d)用选自有机溶剂、水或它们的混合液的洗脱液与步骤c)中得到的洗涤过的吸附树脂接触，然后收集含有纯化普伐他汀钠的洗脱液，所述的有机溶剂选自C1-4醇或C1-4酮。
所述的吸附树脂选自a)由苯乙烯与二乙烯苯聚合而成的非极性的脂肪族吸附树脂，可以例举的是美国罗门哈斯公司(RohmHaas)生产的XAD系列吸附树脂中的XAD-1、XAD-2、XAD-3、XAD-4、XAD-5、XAD-16、XAD-16HP、或它们的混合物，及日本三菱化学公司生产的Diaion HP系列吸附树脂中的HP-10、HP-20、HP-20ss，HP-21、HP-30、HP-40、HP-50、SP-825、SP-850、SP-70、SP-700、SP207、或它们的混合物；或是b)具有甲基丙烯酸酯单元结构的中等极性的甲基丙烯酸吸附树脂，可例举的是美国罗门哈斯公司生产的XAD系列吸附树脂中的XAD-6、XAD-7、XAD-7HP、XAD-8、或它们的混合物，也可以是日本三菱化学公司生产的Diaion HP系列吸附树脂中的HP-2MG。
所述的含有普伐他汀钠的发酵液可以是任何发酵制备普伐他汀钠方法中得到的发酵液。在本发明的一个实施方案中，所述的含有普伐他汀钠的发酵液可用工业上生产普伐他汀钠的方法制备得到，具体来说，通过青霉属的一些微生物的培养发酵获得美伐他汀，如桔青霉(penicilliun citrinum)；再用诸如毛霉属、链霉菌属、诺卡氏属等微生物发酵，将美伐他汀羟化为普伐他汀钠。优选的是，过滤滤去发酵液中的微生物菌丝体。最优选的技术方案是用常规的方法将该发酵液的pH调节到6.5以上，加入诸如磷酸盐、硅藻土、珍珠岩等的助滤剂，经由过滤装置过滤滤去微生物菌丝体，得到能实施本发明的最佳的含有普伐他汀钠的发酵液。
优选的是，本发明纯化方法步骤a)中所述的发酵与吸附树脂的接触包括将吸附树脂直接投入滤液中，然后搅拌5-120分钟；另一个优选的接触方案包括，是将吸附树脂装在层析柱等层析装置中，使发酵滤液流过层析柱，流速可以在每小时0.1-10个柱床体积。
b)步骤中的分离可通过过滤、离心等方法使树脂与滤液相分离；本发明中，C1-4醇优选地可为甲醇、乙醇、丙醇、丁醇，C1-4酮优选的是丙酮、丁酮或它们的混合物。
具体实施例方式
下面结合具体的实施例对本发明从发酵液中纯化普伐木他汀钠的方法作进一步详尽的阐述，但是，这些实施例仅供例举阐述用，并非用来限定本发明的范围。
实施例1取2.5升含有普伐他汀钠的微生物转化液，经HPLC检测，其中普伐他汀钠的含量为1.5克/升(共3.75克)，HPLC纯度为65％，以氢氧化钠调节转化液pH为7.0，然后加入20克硅藻土并搅拌15分钟，然后于铺有滤纸的布氏漏斗过滤并收集滤液。
将上步所得滤液上样到一个装有500ml XAD-16HP树脂的层析柱，上样流速为每小时0.5个柱床体积。上样结束后，以水洗涤树脂2个体积，洗涤流速为每小时1个柱床体积。洗涤完毕后，以700ml甲醇为洗脱液，洗脱液流速为每小时1个柱床体积，收集含有普伐他汀钠的部分并混匀。收集液经HPLC检测，其中的普伐他汀钠含量为3.5克(收率93.3％)，纯度为94.2％。
实施例2取15升含有普伐他汀钠的微生物转化液，经HPLC检测，其中普伐他汀钠的含量为1.25克/升(共18.75克)，HPLC检测的纯度为72％，以氢氧化钠调节转化液pH为7.2，然后加入80克珍珠岩并搅拌15分钟，然后于铺有滤纸的布氏漏斗过滤并收集滤液。
将上步所得滤液上样到一个装有2.5升HP-20树脂的层析柱，上样流速为每小时0.5个柱床体积。上样结束后，以水洗涤树脂2个体积，洗涤流速为每小时1个柱床体积。洗涤完毕后，以4升乙醇为洗脱液，洗脱液流速为每小时1个柱床体积，收集含有普伐他汀钠的部分并混匀。收集液经HPLC检测，其中的普伐他汀钠含量为17.3克(收率92.3％)，纯度为95.2％。
实施例3取5升含有普伐他汀钠的微生物转化液，经HPLC检测，其中普伐他汀钠的含量为1.25克/升(共6.25克)，HPLC检测的纯度为72％，以氢氧化钠调节转化液pH为7.2，然后加入80克珍珠岩并搅拌15分钟，然后于铺有滤纸的布氏漏斗过滤并收集滤液。
将上步所得滤液约5升置于10升不锈钢桶内，加入1000mlXAD-16树脂，于室温下搅拌120分钟，然后将含有树脂的滤液倾倒于铺有滤纸的布氏漏斗上过滤，所得滤液弃去，树脂装入层析柱中，以1000ml水洗涤，洗涤完毕以1600ml乙醇洗脱，收集含有普伐他汀钠的部分。收集液经HPLC检测，其中的普伐他汀钠含量为5.70克(收率91.2％)，纯度为95.6％。
实施例4取5升含有普伐他汀钠的微生物转化液，经HPLC检测，其中普伐他汀钠的含量为1.25克/升(共6.25克)，HPLC检测的纯度为72％，以氢氧化钠调节转化液pH为7.2，然后加入80克珍珠岩并搅拌15分钟，然后于铺有滤纸的布氏漏斗过滤并收集滤液。
将上步所得滤液上样到一个装有4升XAD-6树脂的层析柱，上样流速为每小时0.5个柱床体积。上样结束后，以水洗涤树脂2.5个体积，洗涤流速为每小时0.5个柱床体积。洗涤完毕后，以7.5升80％乙醇为洗脱液，洗脱液流速为每小时1个柱床体积，收集含有普伐他汀钠的部分并混匀。收集液经HPLC检测，其中的普伐他汀钠含量为5.88克(收率94.1％)，纯度为93.5％。
对照实施例取1.0升含有普伐他汀钠的微生物转化液，经HPLC检测，其中普伐他汀钠的含量为1.25克/升(共1.25克)，HPLC纯度为72％，以氢氧化钠调节转化液pH为7.2，然后加入8克珍珠岩并搅拌15分钟，然后于铺有滤纸的布氏漏斗过滤并收集滤液(1.0升)。
将上述1.0升滤液以盐酸调pH为4.0，然后加入1.0升乙酸乙酯，搅拌抽提15分钟，然后离心分离酯相与水相，水相中再加入0.5升乙酸乙酯第二次搅拌抽提15分钟，然后再次离心分离，水相弃去，合并两次抽提所得酯相。酯相体积共1.3升，经HPLC检测，其中的普伐他汀钠含量为1.12克(收率89.6％)，纯度为84.5％。
本发明的纯化方法与现有技术相比具有有机溶媒用量少，对环境的危害性小的优点，且能提高普伐他汀钠产品的纯度。
权利要求
1.一种普伐他汀钠的纯化方法，包括a)使含有普伐他汀钠的发酵液与吸附树脂接触，b)使发酵液与所述的树脂分离，c)用选自水、有机溶剂或它们的混合物的洗涤液洗涤步骤b)中留下的吸附树脂，和d)用选自有机溶剂、水或它们的混合液的洗脱液与步骤c)中得到的洗涤过的吸附树脂接触，然后收集含有纯化普伐他汀钠的洗脱液。
2.根据权利要求1所述的纯化方法，其中，所述的吸附树脂选自a)由苯乙烯与二乙烯苯聚合而成的非极性的芳香族吸附树脂；或b)具有甲基丙烯酸酯单元结构的中等极性的甲基丙烯酸吸附树脂。
3.根据权利要求2所述的纯化方法，其中所述的吸附树脂是XAD-1、XAD-2、XAD-3、XAD-4、XAD-5、XAD-16、XAD-16HP、或它们的混合物，或HP-10、HP-20、HP-20ss，HP-21、HP-30、HP-40、HP-50、SP-825、SP-850、SP-70、SP-700、SP207、或它们的混合物；或是XAD-6、XAD-7、XAD-7HP、XAD-8、或它们的混合物，或是HP-2MG。
4.根据权利要求1所述的纯化方法，其中步骤a)中所述的发酵与吸附树脂的接触包括将吸附树脂直接投入滤液中，然后搅拌5-120分钟。
5.根据权利要求1所述的纯化方法，其中步骤a)中所述的发酵液与吸附树脂接触包括将吸附树脂装层析装置中，使发酵滤液流过层析柱，流速为每小时0.1-10个柱床体积。
6.根据权利要求1所述的纯化方法，其中步骤b)中的分离包括过滤。
7.根据权利要求1所述的纯化方法，其中所述的有机溶剂是C1-4醇、C1-4酮。
8.根据权利要求7所述的纯化方法，其中所述的C1-4醇选自甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、或它们的混合物，C1-4酮选自丙酮、丁酮或它们的混合物。
全文摘要
本发明揭示一种普伐他汀钠的纯化方法，包括a)使含有普伐他汀钠的发酵液与吸附树脂接触，b)使发酵液与所述的树脂分离，c)用选自水、C
文档编号C07C69/732GK1517331SQ0311484
公开日2004年8月4日 申请日期2003年1月13日 优先权日2003年1月13日
发明者梅民权, 季晓铭, 高霄梁, 李严, 姚勇, 卓忠浩 申请人:上海天伟生物制药有限公司