专利名称：大环内酯类化合物及其制备方法
技术领域：
本发明涉及的是一种抗生素，具体地说是一种大环内酯类抗生素。本发明还涉及这种抗 生素的制备方法。
(二)
背景技术：
目前，国内外应用广泛的大环内酯类农用抗生素多拉菌素属双糖类化合物，是以环己氨 羧酸(cyclohexanecarboxylic)为前体，通过基因重组的阿维链霉菌(Wreptowycey flw,'w/"7/s yVE^"/06P)新菌株发酵而成的一种阿维菌素类抗生素，最早发现它驱杀寄生虫的能力是在驱 鼠继代的蛇形毛圆线虫和杀兔痒螨的动物模型中(参见Goudie, AC.等人，Fefen'"a 7 i^raw'to/ogy.49(1993)5-15)。多拉菌素为内外兼杀剂，对线虫、节肢动物均有良好的驱杀效果， 与市售的伊维菌素类产品比较，其抗生寄虫范围更广泛、血药浓度高峰维持时间更长、半衰 期也相对较长。而且多拉菌素在动物体内持效时间更长，是目前最具有开发潜力的兽用抗寄 生虫药物之一。
(三)

发明内容
本发明的目的是提供一种具有强的抗寄生虫及其虫卵的活性，可用以控制动物体内外寄 生虫及其虫卵生存的大环内酯类化合物。 本发明的目的是这样实现的 它的分子结构如下
! H
OH
当X-Y...R为CH二C...H时为新化合物1的结构；新化合物2的结构特征是X-Y...R为 CH2-CH...OH。本发明的另一个目的是提供这种大环内酯化合物的制备方法。 本发明涉及的化合物是采用这样的方法来制备的.-
1、 发酵
(1) 发酵菌种发酵菌种是阿维链霉菌突变株(5^e/ Awy^ey mww/"to Wra/'" vV￡^f/ 由东北农业大学生物化工实验室提供，是于2009年03月11日保藏于"中国生物菌种保藏管 理委员会普通微生物中心"，保藏登记号为CGMCC N0.2943，命名为NEAU 1069
(5^repf纖yce5: averm/"7!'s )的菌株。
(2) 斜面培养采用YMS培养基(可溶性淀粉10g，酵母抽提物2g， KN03lg，琼脂 20 g，蒸馏水1000ml， pH值7.0)于121。C下灭菌20 min，接菌后在28 。C下培养6-8 d;
(3) 种子培养培养基(葡萄糖20g，大豆粉15g，酵母粉5.0g，蒸馏水1000 ml， pH 值7.0)，用250 ml的三角瓶每瓶分装25 ml，然后用10 ml无菌水将斜面的冰城链霉菌孢子 洗下并制成孢子悬浮液，使其浓度为Ixl07 lxl08个/ml。每瓶加2ml孢子悬浮液，置于摇 床上，转速250r/min, 28。C培养24h;
(4) 发酵采用液体摇瓶发酵，培养基(玉米粉10%,大豆粉1%，棉花籽粉1%， a-淀粉 酶0.02%， NaCl 0.1%, K2HP04 0.2%， MgS04'7H20 0.1%， CaC03 0.7%，环己烷羧酸盐0.1%, pH 7.0，加蒸馏水1000ml。于121。C下灭菌20min，分装于1000ml三角瓶，每瓶100ml。接种 量8% (V/V)，摇床转速250 r/min， 28 。C振荡培养12-13 d。
2、 发酵液处理
(1) 发酵液经100 200目筛网过滤后，滤渣用甲醇提取。
(2) 将得到的浸提液浓縮至一定体积后进行溶剂萃取，硅胶柱层析和RP-18层析后，得 到两种无色的粉末状化合物。
本发明还涉及结构表征如下化合物化合物1
<formula>formula see original document page 5</formula>化合物1的物理化学性质如下 性状(Appearance):白色粉末 溶解性(Soliibility):易溶于氯仿、丙酮、甲醇 比旋度(Specific rotation): [a]g +123.86 (c 0.088， EtOH); 分子式(Molecular formula): C35H46O6
ESIMS w/z: 563 [M+H]+， High-resolution ESIMS: 585.3102 [M+Na]+ (calcd for C35H4606Na， 585.3187);
UV absorption spectrum Amax (EtOH) nm 0): 249 (37318) 283 (17828) 200 (67032); IR absorption spectrum: vmaxcm-1 3417,2927,2854,1706，1610, 1504,1450,1365,1278,1157,994; !H NMR (CDC13,400 MHz) (5 7.36 (1H， s， H-3) ， 6.56 (1H， s， H-6) ， 6.45 (1H， d， /=15.1， H-8) ， 6.08 (1H， dd， J=10.4， 25.5， H-9) ， 6.03 (1H， dd， J40.4， 24.9， H-10) ， 5.62 (1H， dd， J二9.9， 14.5， H-ll) ， 2.58 (1H， m， H-12) ， 4.04 (IH， brs， H-13) ， 5.29 (1H， brd， 7=10.8， H-15) , 2.31 (2H， m， H-16) ， 3.99 (IH， m， H-17) ， 0.88 (1H， q， /=12.1， H-18a) ， 1.98 (1H， m， H-18b) ， 5.56 (1H， m， H-19) ， 1.50 (IH， t， 7=11.8， H-20a) ， 2.02 (1H， m， H-20b) ， 5.53 (1H， dd， 7=2.4， 10.0， H-22) ， 5.72 (1H， dd， J=1.2， 9.9， H-23) ， 2.29 (1H， m， H-24) ， 3.32 (IH， d， J40.0， H-25) ， 1.53 (1H， m， H-26) ， 1.63 (1H， m， H-26a) ， 1.19-1.37 (IH， m， H-26b) ， 1.19-1.37 (1H， m， H-27a) ， 1.79-1.89 (1H， m， H-27b) ， 1.65 (2H， m， H-29) ， 1.19-1.37 (1H， m， H-30a) ， 1.79-1.89 (1H， m, H-30b) ， 1.48-1.63 (2H， m， H-31) ， 2.21 GH， s， H-32) ，1.22 (3H， d， J=6.9， H-33) ， 1.58 (3H， brs， H-34) ， 0.92 (3H， d，凡1， H-35);
13C NMR (CDC13, 100 MHz) (5 169.6 (s， C-l), 123.6 (S， C-2), 132.5 (d, C-3), 122.7 (s， C-4), 155.6 (s， C-5)， 115.3 (d, C-6), 137.1 (S， C-7)， 128.7 (d， C-8)， 134.4 (d, C-9)， 130.4 (d, C-10), 135.7 (d， C-ll)， 40.6 (d, C-12), 78.5 (d, C-13), 138.1 (s, C-14), 117.7 (d, C-15), 33.8 (t, C-16), 68.6 (d, C-17), 36.5 (t, C-18), 68.1 (d， C-19), 40.8 (t, C-20), 95.9 (d, C-21)， 128.0 (d， C-22)， 136.0 (d， C-23), 30.1 (d， C-24), 77.3 (d， C-25), 38.7 (d， C-26), 25.6 (t, C-27), 26.7 (t, C-28), 26.5 (t, C-29), 27.0 (t, C-30)， 31.6(t，C-31)， 15.3 (q， C-32)， 18.4 (q, C-33)， 14.8 (q, C-34)，16.6 (q, C-35);
本发明还涉及结构表征如下化合物化合物27页
化合物2的物理化学性质如下-性状(Appearance):白色粉末 溶解性(Solubility):易溶于氯仿、丙酮、甲醇 比旋度(Specific rotation): [a]g +66.35 (c 0.104， EtOH); 分子式(Molecular formula): C35H4807
ESIMS w/z: 581 [M+H]+， High-resolution ESIMS: 603.3292 [M+Na〗+ (calcd for C35H4807Na, 603.3292);
UV absorption spectrum Amax (EtOH) nm (￡): 250 (42540) 282 (21403) 200 (105206); IR absorption spectrum: VmaxCm" 3445,2928,2855,1699,1615, 1452,1382,1278,1163,994; 'HNMR(CDCl3,400 MHz) <5 7.37 (1H， s， H陽3) ， 6.56 (1H， s， H-6) ， 6.45 (IH， d， /=14.9， H-8) ， 6,05 (1H， dd， J二10.4， 25.4， H-9) ， 6.02 (1H， dd， J二10.4, 25.2， H-10) ， 5.61 (IH， dd， J:9.8， 14.4， H-ll) ， 2.58 (1H， m， H-12) ， 4.04 (IH， brs， H-13) ， 5.28 (1H， m， H-15) ， 2.31 (2H， m， H-16) ， 3.79 (1H， m， H-17)， 0.88 (1H， q， >/=12.0， H-18a) ， 1.96 (1H， m， H-18b) ， 5.48 (1H， m， H-19) ， 1.44
(1H， t， >/=11.8， H-20a) ， 1.97 (1H， m， H-20b) ， 1.65 (2H， m， H-22) ， 3.76 (IH， brs， H-23) ， 1.65 (1H， m， H-24) ， 3.41 (1H， d, J:10.7， H-25) ， 1.49 (IH， m， H-26) ， 1.58 (1H， m， H-27a) ， 1.20-1.29 (1H， m， H國27b) ， 1.19-1.30 (1H， m， H-28a) ， 1.77-1.87 (IH， m， H-28b) ， 1.67 (2H， m， H-29) ， 1.19-1.30 (1H， m， H-30a) , 1.77-1.87 (1H， m， H-30b) ， 1.50 (1H， m， H-31a) ， 1.63 (1H， m， H-31b)， 2.21 (3H， s， H-32) ， 1.20 (3H， d，凡9， H-33) ， 1.58 (3H， brs， H-34) ， 0.92
(3H， d， 7=6.9， H-35);
13
C NMR (CDC13, 100 MHz) (5 169.6 (s, C陽l), 123.6 (S， C-2), 132.6 (d， C-3)， 122.9 (s， C-4), 155.9
7
三H陽7)， 128.8 (d， C-8), 134.3 (d, C-9), 130.4 (d, C-10), 135.7 (d, C-ll), 40.6 (d, C-12)， 78.3 (d, C陽13)， 138.6 (s， C-14), 117.0 (d， C-15), 33.6 (t， C-16), 68,6 (d, C-17), 36.2 (t, C-18), 67.3 (d， C-19), 41.1 (t， C-20), 99.9 (d, C-21)， 41.0 (d, C-22)， 70.3 (d, C-23), 35.1 (d, C-24), 72.5 (d, C-25), 38.1 (d， C-26) , 24.5 (t, C-27), 26.6 (t, C-28), 26.5 (t, C-29)， 26.9 (t, C-30), 31.2(t,C-31)，15.4(q, C-32)，18.5 (q, C-33)，14.8 (q, C-34)，13.6 (q, C-35);
采用本发明的方法得到的化合物具有强的杀螨活性，能杀灭，例如寄生在果树、蔬菜和
花上的四爪螨属、全爪螨属和锈螨属的成螨和卵。它们对于寄生于动物身上的硬蜱科、皮刺
螨科和疥螨科也有活性。它们还能杀灭动物体内外寄生物，如对牛体内的奥氏奥斯特线虫、 琴形奥斯特线虫、柏氏血矛线虫捻转血矛线虫、似血矛线虫、艾氏毛圆线虫、蛇形毛圆线虫、 肿空古柏线虫、点状古柏线虫栉状古柏线虫、匙形古柏线虫、菇拉巴德古柏线虫、牛仰口线 虫、乳突类圆线虫和辐射食道口线虫等的成虫及幼虫均显示驱虫活性对猪蛔虫、齿食道口
线虫、长沟球首线虫、猪毛首线虫、兰氏类圆线虫、猪肺线虫、猪肾虫、鲍杰氏线虫等具有 很好的驱除效果。对绵羊消化道线虫包括毛圆线虫、夏伯特线虫、奥斯特线虫、马歇尔线虫、
钝刺细颈线虫、毛首线虫、捻转血矛线虫驱净率为95%。 具体实施例方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明
1、 化合物制备发酵
(1) 种子培养培养基(葡萄糖20g，大豆粉15g，酵母粉5.0g，蒸馏水1000ml， pH 值7.0)，用250 ml的三角瓶每瓶分装25 ml，然后用10 ml无菌水将斜面的冰城链霉菌孢子 洗下并制成孢子悬浮液，使其浓度为Ixl07 lxl08个/ml。每瓶加2ml孢-了悬浮液，置于摇 床上，转速250r/min, 28。C培养24h;
(2) 发酵采用液体摇瓶发酵，培养基(玉米粉10%，大旦粉1%，棉花籽粉1%， 《-淀粉酶0.02%， NaCl 0.1%， K2HP04 0.2%, MgS04'7H20 0.1%, CaC03 0.7%，环己垸羧酸盐 0.1%, pH 7.0，加蒸馏水1000ml。于121。C下灭菌20 min，分装于1000 ml三角瓶，每瓶100 ml。接种量8% (V/V)，摇床转速250 r/min， 28 。C振荡培养12-13 d。
2、 化合物的分离
30L发酵液经200目筛网过滤，并且用水清洗虑饼，发酵液和清洗用的水全都弃掉，用 10L甲醇浸提过滤后得到的滤渣，通过减压蒸馏的方法最后将甲醇溶液浓縮到大约2L，再 将浓縮液用相同体积的EtOAc浸提3次，将得到的EtOAc相减压蒸馏会产生20 g油状物质。
将所得油状物上硅胶柱(粒径200 300目)进行层析，分别用石油醚乙酸乙酯=9:1- 5:5 两种洗脱液混合进行梯度洗脱，得到了五个组分，将组分二上RP-18硅胶柱进行层析，n用甲醇水=80:20-95:5 二种洗脱液混合进行梯度洗脱，会得到化合物1 (18mg);将组分三上 RP-18硅胶柱进行层析，用甲醇水=70:30-卯:10 二种洗脱液混合进行梯度洗脱,会得到化合 物2 (15mg)。
其中化合物l的结构式为
OH
3、抗虫活性测定
对猪体内外寄生虫及其虫卵的触杀作用
将100头断奶仔猪分为五组，分别进行如下处理。第一组为高剂量组，皮下注射剂量为400
吗/kg;第二组为中剂量组，皮下注射剂量为300吗/kg;第三组为低剂量组200吗/kg;第四组 为对照组，不做任何处理。依试验前后猪体内外寄虫(卵)罹患数量进行比较来确定新化合物 对驱杀猪休内线虫和体外血虱的效果。依据猪再感染寄生虫的时间，确定药物在猪体内的残 效期。
…三llu
ol三-:
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9化合物1和新化合物2在以300 ^g/kg的计量下能够有效驱杀猪体内线虫和体外血虱。对 抑制线虫感染长达25 d，对血虱抑制长达98 d。
权利要求
1、一种大环内酯类化合物，其特征在于大环内酯类化合物的结构图为当X-Y...R为CH＝C...H时为化合物1的结构；当X-Y...R为CH2-CH...OH时为化合物2的结构
2、 一种制备权利要求l所述的大环内酯类化合物的制备方法，其特征是制备化合物l和化 合物2的方法为将来源于产多拉菌素的细胞株，即由阿维链霉菌基因工程变异株(5^户towycM avmm力'fo Wra/w A^L4" ^69)，是于2009年03月11日保藏于"中国生物菌种 保藏管理委员会普通微生物中心"，保藏登记号为CGMCC N0.2943，命名为NEAU1069 (5^^tow;;c^ m^7m力'fo)的菌株，经斜面培养、种子培养、摇瓶发酵、分离纯化而得。
3、 根据权利要求书2所述的大环内酯类化合物的制备方法，其特征是所述的斜面培养为-培养基的组成包括可溶性淀粉20 g、 KN03 1 g、 K2HPO40.5 g、 MgS04'7H20 0.5 g、 FeS04'7H20 0.01 g、琼脂20 g和蒸馏水1000 ml， pH值7.2 7.4，于1><105 Pa下灭菌30 min，接菌后在 28 32'C下培养4d。
4、 根据权利要求书2所述的大环内酯类化合物的制备方法，其特征是所述的种子培养为 培养基的组成包括葡萄糖5 10g、可溶性淀粉5 10g、牛肉膏5 10g、蛋白胨10 18g、 氯化钠5 8 g和蒸馏水1000 ml， pH值7.2，用250 ml的三角瓶每瓶分装100 ml，然后用1 ml 无菌水将斜面的冰城链霉菌孢子洗下并制成孢子悬浮液，使其浓度为1><106 1><107个/1111，每 瓶加1 ml孢子悬浮液，置于摇床上28 32t:培养24 36 h。
5、 根据权利要求书2所述的大环内酯类化合物的制备方法，其特征是所述的摇瓶发酵为-采用液体摇瓶发酵，培养基组成为小米10 30 g加蒸馏水1000 ml煮沸15 min后滤去米粒， 加入葡萄糖15 30g、碳酸钙2 15g、氯化钠5 12g和蛋白胨5 15 g， pH值7.2 7.4， 于lx105 Pa下灭菌30 min，分装于250 ml三角瓶，每瓶20 100ml，按体积比的接种量为 10%，摇床转速150 240r/min， 28 32。C振荡培养4 5 d。
6、 根据权利要求书2所述的大环内酯类化合物的制备方法，其特征是所述的分离和提存的 方法为发酵液经100 200目筛网过滤后，滤渣用甲醇提取，提取液浓縮至一定体积后用 EtOAc萃取，将萃取夜浓縮后依次进行硅胶柱层析，RP-18柱层析所得到的化合物，得到两 种无色的粉末状化合物1和化合物2。
7、 根据权利要求书6所述的大环内酯类化合物的制备方法，其特征是所述的硅胶层析用到 的填料是200-300目的硅胶，流动相为石油醚和乙酸乙酯按不同比例混合进行梯度洗脱。
8、 根据权利要求6所述的制备权利要求1所述的大环内酯类化合物的制备方法，其特征是 所述的RP-18是使用混合溶剂，即80:20-95:5和70:30-90:10的甲醇与水溶液进行梯度洗脱的。
全文摘要
本发明提供了一种大环内酯类化合物及其制备方法。本发明的化合物是由阿维链霉菌基因工程变异株(Streptomyces avermitilis strain NEAU 1069)加入环己烷基羧酸后生物合成获得的一种十六元环内酯类化合物，发酵液经过滤后，滤渣用甲醇提取，提取液浓缩至一定体积后用EtOAc萃取，将萃取夜浓缩后依次进行硅胶柱层析，RP-18柱层析所得到的化合物。本发明的化合物具有强的抗动物体内外寄生虫的活性，可用以控制动物体内外寄生虫及其虫卵生存，对绵羊消化道线虫包括毛圆线虫、夏伯特线虫、奥斯特线虫、马歇尔线虫、钝刺细颈线虫、毛首线虫、捻转血矛线虫驱净率为95％。
文档编号C07D493/20GK101619067SQ200910071629
公开日2010年1月6日 申请日期2009年3月25日 优先权日2009年3月25日
发明者向文胜, 玲 姜, 明 王, 王相晶 申请人:东北农业大学