烟草ntpif1基因及其编码蛋白和应用
技术领域
1.本发明涉及植物分子生物学与基因工程相关技术领域，具体涉及烟草ntpif1基因及其编码蛋白和应用。
背景技术：
2.烟草是我国主要的经济作物之一。因生物量大、遗传转化体系成熟完善、种植栽培技术简单，烟草被认为是开展植物生物反应器研究，生产有益化合物(如虾青素、胡萝卜素、花青素等)和蛋白质(如胶原蛋白、流感疫苗等)的理想模式植物。
3.胡萝卜素类化合物是自然界中一类天然色素的总称，普遍存在于动物、高等植物、真菌藻类中的黄色、橙黄色或红色的色素之中。在植物体内，类胡萝卜素具有促进光形态发生、参与非光化学抑制反应、脂质过氧化反应及吸引昆虫传粉等作用，是植物生长所必须的一类次生代谢物；在动物细胞中，类胡萝卜素具有抗氧化活性，其中β-胡萝卜素是人体合成对视觉神经和免疫系统极为重要的维生素a的前体物质。然而，由于动物细胞不能自身不能合成类胡萝卜素，植物中的类胡萝卜素就成为人体中最主要的摄入来源。由于具有共价多烯结构，类胡萝卜素具有超强的抗氧化活性，在功能营养品、化妆品、食品添加剂、动物饲料等领域被广泛应用。据估计，类胡萝卜素的全球市场价值在2018年已达15亿美元。目前类胡萝卜素的生产主要依赖于化学合成和微生物合成，但是合成产率较低，过程繁琐，且生产期间产生的化学污染较大。
4.作为主要的经济作物，烟草叶片中胡萝卜素类物质的含量对烤烟品质至关重要，是烤烟中重要的致香前体物。如β-胡萝卜素降解产生的β-环柠檬醛、β-紫罗兰酮、β-大马酮、二氢猕猴桃内酯等是重要的香精香料的原料；叶黄质降解产生的巨豆三烯酮、氧化异佛尔酮是烟草香味物质的前体物。这些香味物质阈值相对较低，刺激性较小，对烟叶香气贡献率大，是形成烤烟细腻、高雅和清新香气的主要成分。大马酮和紫罗兰酮可增加烟草的花香香味，二氢猕猴桃内酯和巨豆三烯酮可消除刺激性作用，增加烟叶中的花香和木香特性。因此，提高胡萝卜素类物质在烟草中合成、积累，不仅能够提高烟草的生物可用性，而且能够提高烟叶香气品质。
5.干旱胁迫是制约全球农业生产的重大问题之一，也是非生物胁迫的重点研究领域。植物遇到干旱胁迫后细胞含水量下降，活性氧平衡被打破，细胞膜系统受损，导致植物生长发育迟缓，严重者甚至死亡。烟草是一种重要的种植规模较大的模式植物，近年来广泛地用于抗旱胁迫的研究。
6.光敏色素互作因子pif(phytochrome interacting factors)属于植物碱性-螺旋-环-螺旋(bhlh)转录因子家族的第15亚族。是植物光信号反应中的重要调控因子，在调控种子萌发、幼苗形态建成、避荫反应、昼夜节律以及各种植物激素响应过程中起着重要作用。但由于物种进化的多样性，不同植物中的pif基因功能却不尽相同。在烟草中，对光敏色素互作因子的研究尚未报道，其家族基因的功能仍不清楚。本发明挖掘和鉴定的烟草ntpif1基因不仅在调控烟叶胡萝卜素类物质合成积累中发挥重要作用，而且对烟草抗逆性
提升效果显著。
技术实现要素：
7.本发明的目的是提供烟草ntpif1基因。
8.本发明的另一目的是提供一种烟草转录因子ntpif1基因的应用。
9.本发明的目的可通过以下技术方案实现：
10.烟草ntpif1基因，其cds序列如seq id no.1所示。
11.烟草ntpif1基因编码的蛋白，氨基酸序列如seq id no.2所示。
12.本发明所述的烟草ntpif1基因在调节烟草类胡萝卜素含量、烤后烟叶香气品质和/或烟草抗旱性中的应用，优选在提高烟草紫黄质、新黄质、叶黄质以及β-胡萝卜素的含量、提高烤后烟叶香气品质和/或提高烟草抗旱性中的应用；进一步优选在提高烟草对aba胁迫及干旱胁迫抗性中的应用。
13.作为本发明的一种优选，沉默、敲除或突变所述的烟草ntpif1基因在提高烟草类胡萝卜素、提高烤后烟叶香气品质和/或提高烟草抗旱性中的应用。
14.本发明利用基因编辑技术和转基因技术失活或过量表达烟草中内源的ntpif1基因编码的蛋白，获得三种纯合的ntpif1基因编辑和过表达材料后，所述的基因编辑和过表达材料具有如下1) 2)3)4)应用：
15.1)调节烟草内源性类胡萝卜素类物质的含量；
16.2)参与aba和甘露醇胁迫处理下烟草种子的萌发及生长发育；
17.3)参与干旱胁迫下的烟草生长发育；
18.4)调节烤后烟叶香气品质。
19.所述参与调节烟草内源性类胡萝卜素类物质的含量为升高(降低)类胡萝卜素化合物紫黄质、新黄质、叶黄质及β-胡萝卜素等物质的含量。
20.所述参与aba和甘露醇胁迫为不同浓度的aba处理后，ntpif1突变体材料的发芽率均显著升高，过表达材料的发芽率显著降低；并将正常生长的幼苗转移至3μm aba和250mm甘露醇处理后发现ntpif1突变体材料的主根长显著长于wt，过表达材料的主根长显著短于wt。
21.在正常供水处理条件下，ntpif1过表达和突变体材料的相对含水率、存活率、mda、pro、 pod、cat、sod等，与其各自的野生型对照相比，均无显著差异。参与干旱胁迫为断水处理2 周后，与野生型对照相比，ntpif1过表达材料的相对含水率、存活率、pro、pod、cat、sod 等生理指标均显著降低，而ntpif1突变体材料的相对含水率、存活率、pro、pod、cat、sod 等生理指标均显著高于野生型材料。
22.所述参与调节烤后烟叶香气品质为突变普通烟草基因组中ntpif1基因后，烤后烟叶中由质体色素降解产生的香气成分含量显著升高，香气品质显著提升；过量表达ntpif1基因后，烤后烟叶中由质体色素降解产生的香气成分含量显著降低，香气品质显著降低。
23.有益效果：
24.本发明的实验证明，通过抑制或过量表达ntpif1基因在烟草中表达的蛋白水平，可以升高或降低烟草内源性类胡萝卜素类物质的含量，提高或降低烟草烤后烟叶品质，并提高或降低烟草对aba、甘露醇及干旱等胁迫的耐受性。因此，本发明发现了简单有效的调
节植物类胡萝卜素类物质含量、烤后烟叶香气品质、响应aba、干旱等胁迫的关键基因ntpif1，该基因可应用于高类胡萝卜素及抗旱性强的烟草新品种的高效培育，同时也为培育类胡萝卜素差异的烟草基因工程品系提供了一种新的方法。在食品科学、医药以及分子植物育种领域都有着非常重要的价值与意义。
附图说明
25.图1 ntpif1基因克隆
26.图2 ntpif1基因编辑纯合插入位点及编码蛋白序列
27.图3 pcambia 1305载体图谱
28.图4 ntpif1超表达材料鉴定
29.图5 ntpif1突变体和过表达材料类胡萝卜素含量鉴定
30.图6 ntpif1突变体材料烤后烟叶中质体色素降解的香气成分统计
31.图7 ntpif1突变体材料烤后烟叶中显著差异的香气成分
32.图8 ntpif1超表达材料烤后烟叶中显著差异的香气成分
33.图9 ntpif1超表达材料烤后烟叶中质体色素降解的香气成分统计
34.图10 ntpif1突变体材料c3f的烤后烟叶总体得分和质量档次
35.图11 ntpif1超表达材料c3f的烤后烟叶总体得分和质量档次
36.图12 ntpif1突变体材料在aba和甘露醇胁迫后的萌发率
37.图13 ntpif1过表达材料在aba和甘露醇胁迫后的萌发率
38.图14 ntpif1突变体材料在aba和甘露醇胁迫后的根长
39.图15 ntpif1过表达材料在aba和甘露醇胁迫后的根长
40.图16 ntpif1过表达烟草的抗旱性显著降低
41.图17 ntpif1敲除突变烟草的抗旱性显著提高
42.图18干旱对ntpif1突变体材料光合特性的影响
43.图19干旱对ntpif1过表达材料光合特性的影响
44.图20干旱对ntpif1过表达材料叶绿素含量及叶绿素荧光动力学参数的影响
45.图21干旱对ntpif1突变体材料叶绿素含量及叶绿素荧光动力学参数的影响
具体实施方式
46.下面结合实施例和附图说明对本发明的技术方案做进一步描述，以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若为特别指明，实施例均按照常规条件进行。
47.实施例1烟草幼苗培养及ntpif1基因扩增
48.野生型wt烟草种子用75％酒精消毒30s，然后用15％h2o2溶液浸泡消毒10min，蒸馏水清洗3次，播种于1/2ms(murashigeandskoog)固体培养基上，置于22℃光照培养箱中萌发生长，培养条件为(25
±
1)℃，光照16h/d。
49.待烟苗长至“两叶一心”时，用灭过菌的剪刀剪取烟草叶片约0.1g，液氮迅速研磨后，用于rna提取：所用实验药品均购自广州睿博生物科技有限公司。所用研钵、枪头、离心管等一应物品事先用1％depc水浸泡过夜后高温高压灭菌备用。取新鲜幼苗约0.1g左右，于液氮中研磨成粉状，加1ml trizol提取液混匀，静置10min；4℃下12,000r/min离心10min；
取上清加300μl氯仿混匀，静置5min后4℃下12,000r/min离心15min，样品分为3 层，rna位于上层水相中；取500μl水相转移到新离心管中，加等体积异丙醇沉淀10～20min；12,000r/min离心10min，弃上清；用75％酒精洗涤1～2次，7,000r/min离心2min，晾干3min左右，加60μl无rnase水，轻轻震荡使rna溶解，参照vazyme提供的primescriptrt-pcr kit(takara,dalian,china)说明书进行反转录，产物用ntpif1-f/r(表1)引物进行 pcr扩增后，进行1％的琼脂糖凝胶电泳检测，发现其条带大小与目标产物大小相一致(图1)，测序结果与seq id no.1所示的结果一致。
50.表1实施例1所涉及的引物
[0051][0052]
实施例2烟草ntpif1纯合突变体材料和纯合过表达材料的获得
[0053]
将实施例1中pcr产物用1％的琼脂糖凝胶电泳检测、纯化后，连入peasy-blunt zerocloning kit载体，转入大肠杆菌dh5α感受态细胞，转化子用含有卡那霉素(50mg/l)的lb 固体培养基进行筛选培养12h，挑取单克隆进行菌液pcr验证，阳性克隆进行双向测序，获得含有ntpif1基因序列的阳性质粒blunt-ntpif1。
[0054]
以克隆获得的blunt-ntpif1阳性质粒为模板，利用crispr/cas9技术常规操作获得三种 ntpif1纯合插入突变体材料，基因编辑位点如表2所示，突变后ntpif1基因编码的氨基酸与 ntpif1正常编码的氨基酸截然不同(图2)，该结果可导致烟草ntpif1基因编码蛋白的活性缺失或抑制。
[0055]
利用sls法提取突变体烟草基因组dna，用ntpif1-f/r引物进行高保真pcr扩增后，1％琼脂糖凝胶电泳检测并委托睿博生物科技有限公司进行测序，筛选并鉴定获得三种纯合突变体材料。
[0056]
使用改造过的植物双元表达载体pcambia1305.1作为构建ntpif1过表达载体的骨架载体，所用的引物为ntpif1-1305-f/r，细菌筛选抗性为卡那霉素，载体图谱如图3所示。以克隆获得的blunt-ntpif1阳性质粒为模板，三种ntpif1过量表达材料的获得利用转基因技术常规操作进行完成。如图4所示，过表达后ntpif1基因的表达量显著高于对照。
[0057]
表2 ntpif1基因编辑位点
[0058][0059][0060]
表3实施例2所涉及的引物
[0061]
引物名称5
’‑3’
ntpif1-fttaggtttacccgccaata
ntpif1-rtcctgtggttggcatgcacatacaantpif1-1305-fgaacgataggagctcggtaccatgaatcattcagttcctgattttgantpif1-1305-rtttgcggacctgcaggtcgactcaccatatgcaacaactagacttttcqactin-fcaaggaaatcaccgctttggqactin-raagggatgcgaggatggantpif1-qpcr-fcaagatccaatgctaaatccacgccgntpif1-qpcr-rtggtttctacatgaacatagtcgg
[0062]
实施例3烟草ntpif1突变体和过表达材料中类胡萝卜素含量的测定及类胡萝卜素生物合成途径基因表达量的测定
[0063]
将实施例2中鉴定获得的ntpif1-1、ntpif1-2、ntpif1-3三种突变体材料以及wt种子经 0.1％agno3处理10min，清水冲洗并晾干，然后按照托盘育苗法育苗并进行假植，挑取长势一致的6周龄烟草幼苗，用液氮速冻并冷冻干燥后研磨至粉末状，准确称量0.05g，置于15ml 离心管中，加入90％丙酮(含0.1％bht)，上下颠倒混匀后超声20min，12000rpm离心5min，用 1ml过滤器取上清液过0.22um有机膜于1ml棕色进样瓶中进样，进样10ul。流动相：异丙醇、 80％乙腈，流速0.5ml/min。色谱柱：waters nova-pak c18柱，3.9
×
150mm，4μm。仪器： hplc hitachi5430 dad检测器。
[0064]
结果如图5a所示。可知ntpif1-1、ntpif1-2、ntpif1-3三个突变体材料中的β-胡萝卜素、紫黄质、叶黄质和新黄质含量均显著高于wt，此结果说明烟草中ntpif1基因编码的蛋白缺失导致烟草中类胡萝卜素类物质含量的升高。与此相反地，ntpif1的3个过表达株系oe3、 oe7和oe16材料中的β-胡萝卜素、紫黄质、叶黄素和新黄质含量均显著低于wt，此结果说明烟草中ntpif1基因过量表达导致烟草中类胡萝卜素类物质含量的降低(图5b)。
[0065]
为进一步明确ntpif1对烟草类胡萝卜素类物质合成积累的影响，提取上述烟草烟草叶片的rna，测定ntpif1突变体和过表达材料中类胡萝卜素生物合成途径的结构基因。ntpif1过量表达后，psy、pds、zds、lcyb和crtiso的表达量显著降低，特别是pds、zds和lcyb，其基因表达量与野生型相比降低近1倍；而参与由新黄质到紫黄质转化的zep基因在不同的转基因株系中表达量与对照相比无显著性差异，这可能与代谢流中玉米黄质和紫黄质相互转化生成有关。与此相反，在ntpif1突变体材料中，pds、zds、lcyb和crtiso的表达量显著上调。
[0066]
本实施例说明ntpif1基因负调控烟草类胡萝卜素生物合成代谢途径中β-胡萝卜素、紫黄质、新黄质和叶黄素等物质的合成。定量结果表明，ntpif1可能系统性地负调控整个类胡萝卜素代谢途径，为研究ntpif1参与调控萜类代谢提供了研究基础。由此可见，该基因在培育高类胡萝卜素类物质植物材料中具有重要用途。
[0067]
上述所涉及的基因表达量测定采用premix ex taqtm(perfect real time)(takapa 公司)的试剂盒以及操作说明书进行，每个样品重复三次，pod、sod和cat酶活性参照北京方程佰金科技有限公司提供的试剂盒说明书进行并略有更改，mda含量的测定参照植物丙二醛 (mda)检测试剂盒(北京雷根生物技术有限公司)进行测定。
[0068]
表4实施例3所涉及的荧光定量引物
[0069][0070][0071]
实施例4
[0072]
4.1烟草类胡萝卜素功能基因模块材料烤后烟叶香气成分鉴定
[0073]
为进一步分析胡萝卜素类致香成分功能基因模块材料的香气品质，对其c3f等级的烤后烟叶中由质体色素降解产生的中性香气成分进行了检测分析。烤后烟末用水蒸气蒸馏后，用二氯甲烷溶剂对中性香气成分进行萃取后，通过液质联用仪对香气成分进行相对定量检测。在 ntpif1突变体材料的烤后烟末中，共检测到19种由质体色素降解产生的香气成分，其中74％的香气成分，共计14种，含量显著高于野生型对照(图6)。与野生型对照中烟300相比，在 ntpif1突变体材料pif1-1和pif1-2的烤后烟叶中6-甲基-5-庚烯-2-醇、β-大马酮、香叶基丙酮、巨豆三烯酮、β-二氢大马酮、法尼基丙酮、新植二烯、茄酮等中性香气成分显著升高 (图7)。
[0074]
相反的，在ntpif1超表达材料烤后烟末中，由质体色素降解产生的各种香气成分显著低于野生型对照。在检测到的18种香气成分中，有61％的香气成分，共计11种，含量显著低于野生型对照(图9)。与野生型对照k326相比，ntpif1超表达材料oe3和oe7的烤后烟叶
中β
ꢀ‑
大马酮、香叶基丙酮、巨豆三烯酮、β-二氢大马酮、法尼基丙酮、新植二烯等中性香气成分显著降低(图8)。
[0075]
4.2烟草类胡萝卜素功能基因模块材料烤后烟叶香气品质评价
[0076]
对ntpif1超表达和突变体材料c3f的烤后烟叶进行切丝卷制，于恒温恒湿箱中平衡48h 后，由农业部烟草产业产品质量监督检验测试中心进行评价。结果如表4和5所示，ntpif1 超表达和突变体及其各自对照中烟300和k326均属于中间香型。ntpif1突变体材料，特别是 ntpif1-1，在浓度、香气质、燃烧性和灰分与对照中烟300相比无明显差异，而香气量、余味显著高于对照中烟300。总体得分和质量档次明显优于对照中烟300(图10)。
[0077]
ntpif1超表达材料oe3和oe7在浓度、香气质、香气量和余味等方面都显著低于对照k326，总体得分和质量档次明显低于对照k326(图11)。说明ntpif1基因能够有效调节烤烟香气品质，敲除ntpif1提升了烤烟香气量和余味。
[0078]
表4 ntpif1突变体材料c3f的烤后烟叶香气品质评吸结果
[0079][0080]
表5 ntpif1超表达材料c3f的烤后烟叶香气品质评吸结果
[0081][0082]
实施例5不同ntpif1突变体、过表达和wt材料在aba和甘露醇胁迫下的种子萌发以及主根长的变化
[0083]
在含有3μm aba、250mm甘露醇以及正常的1/2ms培养基上生长14d后，观察表型及统计发芽率，如图12-13所示。ntpif1-1、ntpif1-2、ntpif1-3在正常的1/2ms培养基下发芽率没有明显差异，但在3μm aba和250mm甘露醇处理下，突变体材料的发芽率均显著高于wt，说明ntpif1基因的缺失导致烟草对aba和甘露醇胁迫后的种子萌发率升高；与此相反地，oe3、 oe7、oe16在正常的1/2ms培养基下发芽率没有明显差异，但在3μm aba和250mm甘露醇处理下，过表达材料的发芽率均显著高于wt，说明ntpif1基因的过量表达导致烟草对aba和甘露醇胁迫后的种子萌发率降低。
[0084]
为了进一步研究ntpif1基因对aba和甘露醇胁迫的响应，本发明将正常1/2ms生长至1 周龄的烟草幼苗移至含有3μm aba和250mm浓度的1/2ms培养基中生长2周后，观察表型及测定主根长，如图所示，无论在3μm aba胁迫还是在250mm甘露醇胁迫下，突变体材料的主根长显著高于wt(图14)，过表达材料的主根长显著低于wt(图15)。因此本实施例说明烟草ntpif1 基因具有对aba和甘露醇胁迫的敏感性的功能。
[0085]
实施例6不同ntpif1突变体、过表达和wt材料在干旱处理后表型、生理指标的变化
[0086]
按照上述实施例2方法育苗获得的4周龄的突变体与野生型材料在缺水处理2周后，观察表型，如图所示，种子萌发4周后断水处理，2周后检测ntpif1表达量，并统计相对含
水率、存活率等抗旱指标；同时检测了丙二醛(mda)、脯氨酸(pro)、过氧化物酶(pod)、过氧化氢酶(cat)、超氧化物歧化酶(sod)等生理指标。
[0087]
结果表明，在正常供水处理条件下，ntpif1过表达和突变体材料的相对含水率、存活率、 mda、pro、pod、cat、sod等，与其各自的野生型对照相比，均无显著差异。而在干旱处理下，与野生型对照相比，ntpif1过表达材料的相对含水率、存活率、pro、pod、cat、sod等生理指标均显著降低(图16)，而ntpif1突变体材料的相对含水率、存活率、pro、pod、cat、sod 等生理指标均显著高于野生型材料(图17)。上述结果表明，ntpif1基因能够负调节烟草的抗旱性。
[0088]
已有的研究表明，干旱胁迫主要通过影响植物的气孔孔径、细胞代谢以及光合作用等生理过程，进而抑制植物的生长发育，影响产量和品质。光合作用是地球上最重要的化合反应，逆境胁迫下光合作用的强弱反映了植物抵御逆境胁迫的能力。为了探究干旱对ntpif1过表达和突变体材料光合特性的影响，我们使用li-cor 6400光合仪检测了干旱处理前后ntpif1过表达和突变体材料的光合作用强度。光照强度设定为1500μmol/(m2
·
s-1)、流量设定为500ml/s，测定时间为上午9:00-12:00。
[0089]
结果表明，在正常供水处理条件下，ntpif1过表达和突变体材料的光合速率，气孔导度及蒸腾速率等光合作用指标，与其各自的野生型对照相比，均无显著差异。在干旱胁迫条件下，与野生型对照相比，ntpif1过表达材料的光合速率、气孔导度、蒸腾速率均显著低于野生型对照wt(图19)，表明ntpif1基因过表达显著降低了干旱条件下烟草的光合作用强度。相反地，干旱条件下，在ntpif1突变体材料中，其叶片的光合速率、气孔导度、蒸腾速率均显著高于野生型对照(图18)，表明ntpif1基因的突变显著增强了干旱条件下烟草的光合作用强度。
[0090]
叶绿体是植物进行光合作用的场所，为了进一步探究干旱对ntpif1过表达和突变体材料光合作用的影响，对干旱处理下的上述材料叶绿素含量以及叶绿素荧光动力学参数进行了检测分析。结果表明，在干旱处理下，与野生型对照相比，ntpif1过表达材料中的叶绿素含量显著降低，相应的叶绿素荧光动力学参数fv/fm、npq、qn、rfd也显著减少，表明过表达材料吸收、传递、转化、利用光能的能力减弱，不利于植物抵御逆境胁迫(图20)。与之相反地，在干旱处理条件下的突变体材料中，其叶片的叶绿素含量显著高于野生型对照，相应的叶绿素荧光动力学参数fv/fm、npq、qn、rfd与野生型相比也显著升高(图21)。上述结果表明，烟草光敏色素互作因子ntpif1通过影响干旱条件下烟草的光合作用能力，负调节烟草的抗旱性。