环状rna cggnbp2的用途
技术领域
1.本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及环状rna cggnbp2在诊断、治疗肝内胆管细胞癌，以及肝内胆管细胞癌预后中的应用。


背景技术：

2.肝内胆管细胞癌(intrahepatic cholangiocarcinoma，icc)约占原发性肝癌的15％～20％，近年来发病率显著上升。高转移率和术后快速复发导致了肝内胆管细胞癌的预后较差。增强对关键促癌事件的认知将有助于开发新型有效的以转移为靶向的治疗方法，并改善肝内胆管细胞癌患者的预后。
3.目前，炎症与癌症之间的关系受到了广泛关注。白细胞介素(il)-6，一种在炎症刺激存在的情况下产生的多效性细胞因子，在肿瘤发生和癌症进展中发挥着重要的作用。肿瘤微环境中慢性炎症所导致的il-6的异常表达可以通过激活下游信号通路来促进肿瘤细胞的生长和转移。
4.环状rna(circrnas)是一类不具有5’末端帽子和3’末端poly(a)尾巴，且以共价键形成的环形结构的非编码rna。由于环状rna呈封闭式的环状结构，不易被rnase r酶消化，相较于线性rna能够更稳定地存在于生物体中。越来越多的研究证明环状rna在许多类型的癌症中存在异常表达且发挥重要作用。
5.环状rna cggnbp2(circbase id:hsa_circ_0003930)包含基因ggnbp2的第3个至第6个外显子，其环化的核苷酸序列有548个碱基，目前尚未有任何关于环状rnacggnbp2在诊断、治疗肝内胆管细胞癌，以及肝内胆管细胞癌预后中应用的报道。


技术实现要素：

6.cggnbp2(circbase id:hsa_circ_0003930)的cdna序列如seq id no：1所示，cggnbp2的序列如seq id no：2所示。cggnbp2的结构为seq id no：2所示的核苷酸序列首尾连接而成的环状结构。
7.越来越多的研究证明炎症与癌症的进程有关，白细胞介素il-6在多种肿瘤中过表达并调节增殖、侵袭、转移等癌症功能特征。发明人通过实验研究发现，血清il-6水平升高与肝内胆管细胞癌更具侵袭性的肿瘤特征和不良预后显著相关，il-6能够诱导环状rna的表达以促进肝内胆管细胞癌的进程。通过分析华西医院136例icc患者的肿瘤组织和相匹配的非肿瘤组织发现cggnbp2在肿瘤组织中的表达水平明显高于非肿瘤组织，表明其在icc的发生发展中可能发挥重要作用。接下来，通过研究cggnbp2的表达水平与临床病理特征、以及患者预后之间的关系发现，cggnbp2的表达水平升高为总生存期(overall survival，os)和无复发生存率(recurrence-free survival，rfs)的独立危险因素，表明受il-6刺激而上调的cggnbp2的表达水平可以作为icc患者的重要的预后指标之一。此外，通过体外实验发现，cggnbp2敲低能够显著地抑制细胞的生长、迁移和侵袭能力，而cggnbp2的过表达将提升细胞的生长、迁移和侵袭能力；通过体内实验发现，cggnbp2敲低后可以抑制肿瘤的生长、肝
内转移和肺转移，而过表达的cggnbp2将加速肿瘤的生长、肝内转移和肺转移。
8.通过机理研究发现，环状rna cggnbp2是一种受il-6诱导的环状rna，受il-6诱导的环状rna cggnbp2能够编码一种新的蛋白cggnbp2-184aa，异常的cggnbp2-184aa表达在体内和体外促进icc细胞生长和转移，重要的是，cggnbp2-184aa直接与信号传导与转录激活因子-3(stat-3)相互作用并增强其在tyr705位点的磷酸化，之后转移至细胞核以激活靶基因的转录。结合实验结果及机理研究，证实了环状rna cggnbp2在icc细胞的生长与转移中发挥至关重要的作用，因此可作为治疗肝内胆管细胞癌的潜在的药物作用靶点。
9.本发明的目的在于基于发明人对环状rna cggnbp2在肝胆管癌细胞生长和转移中的功能和机制研究，提供一种诊断肝内胆管细胞癌的试剂盒、治疗肝内胆管细胞癌的药物组合物，以及环状rna cggnbp2作为治疗靶点在肝内胆管细胞癌的预后、诊断和治疗中的应用。
10.本发明的上述目的通过下述技术方案实现：
11.一种用于诊断肝内胆管细胞癌的试剂盒，所述试剂盒包括检测环状rna的表达量的试剂，所述环状rna的circbase id为hsa_circ_0003930。
12.进一步地，所述检测环状rna的表达量的试剂包括用于扩增所述环状rna的引物。
13.作为本发明中用于扩增环状rna cggnbp2的引物的优选实施方案，所述引物包括如下引物对：
14.正向引物：5'-cgaaaacacagatggtgatgga-3'(seq id no：3)
15.反向引物：5'-tgatgtcaccaccatggcaa-3'(seq id no：4)
16.进一步地，所述试剂盒还包括肝组织rna提取试剂、逆转录反应体系。所述rna提取试剂为trizol试剂，所述逆转录反应体系包括逆转录酶、缓冲液、rnase抑制剂、oligo、dntps等。
17.本发明还提供一种药物组合物，所述药物组合物包括环状rna和/或降低所述环状rna的表达量的试剂，以及药物学上可接受的载体，所述环状rna的circbase id为hsa_circ_0003930。
18.本发明进一步提供上述任一种药物组合物在制备用于抑制肝胆管癌细胞增殖、迁移的药物或治疗肝内胆管细胞癌的药物中的应用。
19.本发明还提供环状rna cggnbp2在制备用于诊断肝内胆管细胞癌的试剂盒中的用途，所述环状rna cggnbp2的circbase id为hsa_circ_0003930。
20.本发明还提供环状rna cggnbp2在制备或筛选治疗肝内胆管细胞癌的药物中的用途，所述环状rnacggnbp2的circbase id为hsa_circ_0003930。
21.本发明还提供一种降低环状rnacggnbp2的表达量的试剂在制备治疗肝内胆管细胞癌的药物中的用途，所述环状rnacggnbp2的circbase id为hsa_circ_0003930。
22.本发明还提供环状rna cggnbp2的表达量在肝内胆管细胞癌患者预后中的应用，所述环状rna cggnbp2的circbase id为hsa_circ_0003930。
23.本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：
24.1、本发明通过设计能够扩增cggnbp2的特异性引物，进行rt-pcr、一代测序、rna酶降解实验证实了cggnbp2的拼接位点以及cggnbp2为具有闭合环状结构的环状rna分子；
25.2、本发明通过qpcr检测匹配的icc和相邻非肿瘤样本中cggnbp2的表达差异情况，
发现cggnbp2在icc样本中的表达明显低于相邻非肿瘤样本，表明cggnbp2能够用于icc诊断；
26.3、本发明通过研究cggnbp2的表达水平与临床病理特征、以及患者预后之间的关系，证明了cggnbp2的表达水平升高为总生存期和无复发生存率的独立危险因素，故cggnbp2的表达水平可以作为icc患者的重要的预后指标之一；
27.4、本发明通过cck-8增殖实验发现cggnbp2敲低能够显著抑制icc细胞的增殖能力，通过transwell迁移与侵袭实验证实cggnbp2敲低后，icc细胞迁移与侵袭能力受到明显抑制，表明cggnbp2能够作为治疗靶点应用于icc的治疗；
28.5、本发明通过构建裸鼠皮下肿瘤模型、裸鼠肝癌原位模型和裸鼠肺转移模型，检验了cggnbp2敲低对裸鼠体内icc细胞增殖、侵袭和转移的影响，证明cggnbp2的敲低能够在动物体内起到抑制icc细胞增殖、侵袭和转移的作用。
附图说明
29.此处所说明的附图用来提供对本发明实施例的进一步理解，构成本技术的一部分，并不构成对本发明实施例的限定。在附图中：
30.图1为本发明具体实施例中cggnbp2的特征结构图、以及cggnbp2扩增产物拼接位点的一代测序图；
31.图2为本发明具体实施例中rnase r对cggnbp2和mggnbp2的消化对比图；
32.图3为本发明具体实施例中在指定时间点利用放线菌素d处理rbe细胞后，通过qrt-pcr检测的cggnbp2和mggnbp2的相对rna表达水平；
33.图4为本发明具体实施例中qpcr检测肿瘤组织和匹配的非肿瘤组织中cggnbp2的表达结果对比图；
34.图5示出了本发明具体实施例中kaplan-meier生存分析显示icc患者的cggnbp2表达水平与总生存期(os)、无复发生存率(rfs)之间的相关性；
35.图6为本发明具体实施例中敲低cggnbp2的hccc9810细胞和hucct1细胞中的细胞增殖曲线示意图，其中横坐标为时间，纵坐标为酶标仪检测的450nm的吸光值；
36.图7示出了本发明具体实施例中敲低cggnbp2的hccc9810细胞和hucct1细胞中细胞侵袭和迁徙能力；
37.图8示出了本发明具体实施例中敲低cggnbp2对裸鼠体内肝癌肿瘤生长的影响，其中(a)为裸鼠皮下注射敲低cggnbp2的hucct1细胞后裸鼠皮下成瘤情况；(b)为裸鼠皮下肿瘤体积增长曲线；(c)为裸鼠皮下肿瘤重量增长曲线；
38.图9示出了本发明具体实施例中敲低cggnbp2对裸鼠体内肿瘤肝内转移的影响，其中(a)示出了具有转移灶的裸鼠肝脏，图中箭头示出了转移灶；(b)为裸鼠肝脏转移性病变(虚线)的he染色照片；(c)为量化分析图，示出了肝脏中形成的转移灶数量；
39.图10示出了本发明具体实施例中敲低cggnbp2对裸鼠体内肿瘤的肺转移的影响，其中(a)为荧光视野，展示了裸鼠尾静脉注射敲低cggnbp2的hucct1细胞的肺转移瘤结果；(b)为裸鼠肺转移肿瘤he染色照片；(c)为肺转移实验量化分析图，其中纵坐标为荧光视野下的肿瘤个数。
具体实施方式
40.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。
41.本发明所涉及的技术为分子克隆常规技术手段，其中涉及的酶、引物、试剂以及反应条件在未作说明的情况下均可根据本领域技术人员的经验进行合理选择，其中涉及试剂耗材属于市售的普通产品，其中涉及的检测手段以及仪器均为本领域技术人员所熟知并熟练掌握。
42.除非另有说明，实施例中各实验方法采用现有的实验方法步骤，并严格按照试剂盒制造商说明执行。
43.本发明中，所有的统计分析均使用spss(version 23.0,spss inc.,chicago,il,usa)，graphpad prism(version 8.0,la jolla,ca,usa)，或medcalc software(version 15.2.2)进行。双尾p值小于0.05表示具有统计学意义。
44.本发明中，数据显示为平均值
±
标准偏差(sd)。适当地进行了student t检验、单因素方差分析或mann-whitney u检验进行比对。通过pearson相关分析测量两组之间的相关性。采用x-tile软件确定icc组织中相对cggnbp2表达量的最优截断值。使用kaplan-meier法绘制生存曲线并通过时序检验测试。cox比例风险回归模型用于评估潜在的独立预后因素。
45.【实施例1】
46.本实施例中，发明人设计能够扩增cggnbp2(circbase id:hsa_circ_0003930)的特异性引物对，并利用该引物对扩增环状rna cggnbp2，通过一代测序的方法证实了该环状rna的拼接位点(back-splice site)，之后通过rnase r消化实验，确定了cggnbp2为具有闭合环状结构的环状rna分子，通过放线菌素d实验证明了cggnbp2的稳定性。
47.本实施例的实验方案如下：
48.使用trizol试剂(invitrogen，ca，usa)从rbe(人肝胆管癌细胞)细胞中提取总rna，并采用scandrop100超微量核酸测定仪检测细胞总rna纯度和浓度。在冰上进行逆转录反应体系配制(以20μl体系为例)，配制完成后加入已准备好的细胞总rna进行逆转录，所述逆转录反应体系为：
[0049][0050]
逆转录反应条件如下：
[0051]
在37℃下反应15分钟，之后在85℃下反应5秒。降温至4℃后，将反应得到的cdna稀释5倍，之后置于-20℃冰箱保存。
[0052]
采用下述设计的引物对扩增逆转录得到的cdna：
[0053]
正向引物：5'-cgaaaacacagatggtgatgga-3'(seq id no：3)
[0054]
反向引物：5'-tgatgtcaccaccatggcaa-3'(seq id no：4)
[0055]
利用上述引物对扩增逆转录得到的cdna后，对扩增产物进行一代测序。如图1所示，cggnbp2源自基因ggnbp2的第3个至第6个外显子，一代测序的结果证明cggnbp2存在反向剪切连接，且准确地显示了扩增产物的拼接位点，表明cggnbp2的形成不是由于基因组的重组错配。
[0056]
1.rnase r消化实验：
[0057]
使用trizol试剂(invitrogen，ca，usa)从rbe(人肝胆管癌细胞)中提取总rna，大约3μg的rna进行rnase r处理(epicentre，10u，37℃，30min)，之后于75℃下孵育10分钟以使rnase r酶失活，已知的环状rna circ7用于对照。最后通过实时pcr分析cggnbp2和mggnbp2的相对rna表达水平，并将其标准化为mock组(未经rnase r处理)的值。实验结果如图2所示，线性的mggnbp2经rnase r酶消化后表达显著降低，而cggnbp2耐受rnase r酶的消化作用，证实其具有环状结构。
[0058]
2.放线菌素d实验：
[0059]
将rbe细胞以2
×
105个细胞/孔的密度接种至6孔板的5个孔中，细胞经放线菌素d(1μg/ml)处理后，分别在0、4、8、12、24小时后收获，通过实时pcr分析cggnbp2和mggnbp2的相对rna表达水平，并通过0小时组的值进行归一化。实验结果如图3所示，表明cggnbp2的半衰期比mggnbp2的半衰期更长，证明了环状rna cggnbp2的稳定性。
[0060]
【实施例2】
[0061]
本实施例中，通过荧光定量pcr检测cggnbp2在肿瘤组织和对应的非肿瘤组织中的表达差异，发现环状rna cggnbp2在肿瘤组织中的表达明显高于对应的非肿瘤组织，表明可以利用检测环状rna cggnbp2的表达量来诊断肝内胆管细胞癌。
[0062]
经华西医院伦理审查委员会批准，根据委员会的政策向每位患者提供书面知情同意书，在患者完全知情并签署知情同意书后，肿瘤组织和成对的非肿瘤组织取自2009年至2018年在华西医院(四川大学，中国成都)未经任何术前治疗的136例icc患者的手术标本档案。
[0063]
本实施例的实验方案如下：
[0064]
使用总rna分离试剂盒(成都福际生物技术有限公司，成都，中国)根据制造商的说明提取细胞和肿瘤组织的总rna，并采用scandrop100超微量核酸测定仪检测rna纯度和浓度。采用chamqtm sybr@qpcr master mix(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)进行定量实时pcr分析，所有实时pcr反应均在cfx96tm touch实时pcr系统(bio-rad,california,usa)上重复三次。
[0065]
具体地，采用实施例1中的cdna逆转录反应进行组织rna逆转录。
[0066]
在冰上进行pcr反应体系配制(以20μl体系为例)，配制完成后再加入已逆转录得到的cdna模板。其中，pcr反应体系为：
[0067][0068][0069]
用于扩增环状rna的引物对采用实施例1中优选的引物对：
[0070]
正向引物：5'-cgaaaacacagatggtgatgga-3'(seq id no：3)
[0071]
反向引物：5'-tgatgtcaccaccatggcaa-3'(seq id no：4)
[0072]
反应条件包括：
[0073]
第一步：预变性
[0074]
95℃，5分钟；
[0075]
第二步：pcr反应(40个循环)
[0076]
95℃，20秒；60℃，20秒；72℃，20秒。
[0077]
第三步：融解曲线分析
[0078]
65℃，5秒；95℃，5秒。
[0079]
pcr扩增后进行定量分析。目标基因的相对表达量计算公式为：2
‑△△
ct＝2-【(
△
ct)test-(
△
ct)control】。其中，
△
ct＝ct目的-ct管家，ct目的为目标基因ct值，ct管家为管家基因ct值，
△
ct表示各样本目的基因相对管家基因的相ct值，
△△
ct＝(
△
ct)test-(
△
ct)control，表示处理组相对对照组进行归一化，2
‑△△
ct表示处理组相对对照组的相对表达量，表示目标基因相对表达倍数。
[0080]
上述qpcr实验结果如图4所示。从图4可以看出，环状rna cggnbp2在肿瘤组织中的表达水平明显高于非肿瘤组织，表明环状rna cggnbp2在icc发生发展中有重要意义，能够在icc诊断中产生积极作用。
[0081]
【实施例3】
[0082]
本实施例中，利用x-tile软件确定icc组织中相对cggnbp2表达量的最优截断值后，将136名icc患者分为高cggnbp2表达组(high cggnbp2 expression，n＝72)和低cggnbp2表达组(low cggnbp2 expression，n＝64)。表1示出了136名icc患者的基线特征。
[0083]
表1：
[0084]
[0085][0086]
如表1所示，cggnbp2表达水平的升高与ca19-9的升高、肿瘤体积的增大、肿瘤数量的增多、淋巴结转移、以及更加晚期的肿瘤阶段显著相关，说明环状rna cggnbp2与icc的发生发展有关。
[0087]
进一步地，如图5所示，通过kaplan-meier生存分析表明，具有更高的cggnbp2表达水平的icc患者在治愈性切除后，总生存期(os)和无复发生存率(rfs)更短。
[0088]
表2示出了单变量cox比例风险回归模型的总生存期和无复发生存期的预后因素。在单变量分析中，血清ca19-9的水平、肿瘤体积、肿瘤数量、肿瘤分化、微血管侵犯、淋巴结转移、tnm分期和cggnbp2表达水平被确认为与总生存期、无复发生存率相关的潜在因素。
[0089]
表2：
[0090][0091]
hr：风险比；ci：置信区间
[0092]
接下来，利用多变量分析检查了单变量分析中与总生存期、无复发生存率相关的各潜在因素。结果显示，升高的ca19-9水平、较差的肿瘤分化、微血管侵犯、以及更高的cggnbp2表达水平被确定为总生存期的独立危险因素。此外，更高的cggnbp2表达水平也与更大的肿瘤体积、微血管侵犯和更晚期的tnm分期一同被确定为无复发生存率的独立危险因素(表3)。
[0093]
表3：
[0094][0095][0096]
综上，cggnbp2的表达水平升高为总生存期和无复发生存率的独立危险因素，故
cggnbp2的表达水平可以作为icc患者的理想的预后标志物。
[0097]
【实施例4】
[0098]
本实施例中，通过cck-8增殖实验发现，利用特定的sirna敲低hccc9810细胞和hucct1细胞中的cggnbp2后，icc细胞增殖能力受到明显抑制；而通过transwell迁移与侵袭实验可证实，cggnbp2敲低将显著抑制细胞的迁移和侵袭能力。上述实验表明，cggnbp2能够作为治疗靶点应用于icc的治疗。
[0099]
1.cck-8细胞增殖实验
[0100]
活细胞线粒体中的脱氢酶可以与wst-8化合物相互反应，最终将其还原成亲水溶性甲瓒染料，溶解后呈黄色，生成的黄色甲瓒数量与活细胞的数量呈正相关，也即活细胞数量越多，溶液的黄色程度越高。因此利用这一特征进行细胞增殖检测。
[0101]
使用100μl培养基悬浮总共2000个细胞并加入到96孔板中，向各孔板加入10μl的cck-8试剂，在37℃，5％co2的恒温培养箱中孵育2小时，之后在指定时间使用酶标仪在450nm处测定吸光值。
[0102]
cck-8细胞增殖实验结果见图6，利用sirna敲低hccc9810细胞和hucct1细胞中的cggnbp2后，icc细胞增殖能力受到明显抑制，icc细胞增殖速度明显减慢。
[0103]
2.细胞迁移与侵袭实验
[0104]
根据制造商的说明使用transwell小室(8.0μm孔径，corning costar，kennebunk，usa)以进行细胞迁移与侵袭实验。对于细胞迁移实验，将3
×
104个细胞悬浮于不含fbs的培养基中，然后接种到上室；对于细胞侵袭实验，将5
×
104个细胞悬浮于不含fbs的培养基中，并接种到预涂有基质胶的上室中。之后，将含有10％fbs的培养基加入至下室。在37℃下孵育24或48小时后，将迁移或侵入下室下表面的细胞固定并染色，晾干后使用image j软件采图。
[0105]
实验结果见图7，证明敲低hccc9810细胞和hucct1细胞中的cggnbp2后，icc细胞的迁移与侵袭能力受到明显抑制。
[0106]
【实施例5】
[0107]
本实施例中，通过构建裸鼠皮下肿瘤模型、裸鼠肝癌原位移植模型和裸鼠肺转移模型，检验了利用短发夹rna(ggnbp2 shrna)敲低hucct1细胞中的cggnbp2对裸鼠体内icc细胞增殖、侵袭和转移的影响。
[0108]
体内动物实验得到了华西医院(四川大学，中国成都)动物伦理委员会的批准。采用5周龄balb/c裸鼠进行体内异种移植实验，所述裸鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司。所有质粒均转染到hek293t细胞中用于慢病毒生产，为了产生稳定的细胞株，细胞株被慢病毒感染，之后利用嘌呤霉素筛选稳定感染细胞株。
[0109]
对于裸鼠皮下肿瘤模型，将2
×
106个稳定转染的细胞悬浮于100μl无血清培养基中，并皮下注射到裸鼠右侧腋窝。接种后，每周测量一次肿瘤体积(v＝1/2
×a×
b2，a为长轴，b为短轴)，游标卡尺测量肿瘤最长和最短部位，绘制肿瘤体积增长曲线。7周后处死裸鼠，测量皮下肿瘤的重量。如图8所示，cggnbp2敲低后，肿瘤的生长受到了明显的抑制。
[0110]
对于裸鼠肝癌原位移植模型，将1
×
106个细胞移植到肝左叶，植入4周后处死裸鼠，然后利用ivis@lumina ii系统(caliper life sciences,hopkinton,ma,usa)扫描肝脏。如图9所示，在cggnbp2敲低后，在肝脏中观察到的肝内转移灶明显减少。
[0111]
对于裸鼠肺转移模型，通过尾静脉注射2
×
106个细胞，6周后在腹膜内注射含3mg荧光素底物，之后使用ivis@lumina ii系统观察裸鼠。随后处死裸鼠，并观察肺部。如图10所示，与之前的结果一致，cggnbp2的缺失抑制了肺转移的形成。
[0112]
以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。