一种副干酪乳杆菌207-27及其应用
1.本分案申请是基于申请号为cn202010858415.8，申请日为2020年08月24日，发明名称为“一种副干酪乳杆菌207-27及其应用”的原始中国专利申请的分案申请。
技术领域
2.本技术涉及一种副干酪乳杆菌或其后代。具体的，本技术涉及一种副干酪乳杆菌207-27以及包括其的组合物、培养物、食物产品或膳食补充剂。本技术还涉及副干酪乳杆菌207-27和包括其的组合物、培养物、食物产品或膳食补充剂在制备药物或保健品中的用途。


背景技术：

3.人体70％-80％的免疫细胞位于人体肠道内，同时人类肠道中的细菌总数可达100万亿，约占人体微生物总量的78％，因此肠道为宿主免疫系统与微生物相互作用提供了一个重要的平台。联合国粮食与农业组织fao和世界卫生组织who认为，益生菌是活的微生物，当摄入足够数量时，对宿主起到有益健康的作用。大量的体外试验和临床试验显示了益生菌在宿主肠道健康和免疫力调节等方面具有良好应用效果。
4.益生菌能够通过多种机制调节宿主的免疫功能。在黏膜屏障功能方面，益生菌可与入侵生物竞争黏膜细胞上的附着位点，从而阻止细菌穿透黏膜进入深部组织；调控肠上皮细胞间紧密连接，加强黏膜细胞的屏障机能；抑制肠黏膜细胞的溶破和凋亡，维护胃肠黏膜的完整性。益生菌还能增强先天性免疫功能，通过加强吞噬细胞、dcs等抗原提呈细胞apcs的吞噬活力、增强nk细胞的杀伤能力，以及提升细胞因子(如促炎因子il-12、ifn-γ、tnf-α和抗炎因子tgf-β、il-10等)的表达水平来控制炎症反应的强度等。同时益生菌能增强适应性免疫。在肠道黏膜定殖的益生菌，能够促进t、b淋巴细胞对抗原刺激的反应性，刺激肠黏膜内的相关淋巴组织，诱导siga的分泌。益生菌作为抗原物质被m细胞吞噬。m细胞内的抗原快速释放并被dcs摄取，并将抗原提呈给初始cd4+t淋巴细胞，激活th1或th2细胞来平衡th1与th2反应的比例。
5.另外，乳酸菌等益生菌能否对机体发挥以上益生作用，还取决于菌株能否耐受机体胃肠道的防御机制，如胃液中的低ph值环境和小肠中胆汁酸等，而以活菌的状态顺利到达肠道，粘附于肠上皮细胞，并在肠道内定植，才能够产生有益代谢产物并与宿主发生相互作用。
6.因此，筛选能够进入肠道、具有高生存性的乳酸菌，是益生菌开发的首要考虑的问题。具备高生存性，以及具备调节宿主免疫功能和抗过敏功能的益生菌还有待开发。


技术实现要素：

7.本技术的发明人经过大量实验从265株健康新生儿肠道来源的菌株中筛选到了一株具有显著菌株特异益生菌潜能的副干酪乳杆菌。本技术的发明人通过大量实验证实，该副干酪乳杆菌对胃液酸性环境以及胆汁盐有良好的耐受性，并对肠道有良好的粘附性，并且能够提高免疫力、改善或缓解过敏症状，并由此完成了本发明。
8.因此，在第一方面，本技术提供了一种副干酪乳杆菌(lactobacillus paracasei)或其后代，所述副干酪乳杆菌保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为gdmcc no.60960。
9.在第二方面，本技术提供了一种组合物，其包含所述副干酪乳杆菌或其后代。
10.在某些实施方案中，所述组合物还包含选自以下的微生物：细菌，真菌(例如酵母)，或其任何组合。
11.在某些实施方案中，所述副干酪乳杆菌可与一种或多种其他物种的微生物组合使用，所述其他物种的微生物能够对其施用的宿主的健康起到有益影响。
12.在某些实施方案中，所述微生物是益生菌。
13.在某些实施方案中，所述益生菌选自益生细菌，酵母，或其任何组合。
14.如本文所使用的，术语“益生细菌”被定义为任何非致病的细菌，并且将其以活菌向宿主施用足够数量时，能够对宿主的健康起到有益影响。
15.在某些实施方案中，所述细菌选自乳酸杆菌属，双歧杆菌属，芽孢杆菌属，丙酸杆菌属，链球菌属，乳球菌属，片球菌属，肠球菌属，葡萄球菌属，或其任何组合。
16.在某些实施方案中，所述乳杆菌属的细菌选自：副干酪乳杆菌(lactobacillus paracasei)，嗜酸乳杆菌(lactobacillus acidophilus)，短乳杆菌(lactobacillus brevis)，詹氏乳杆菌(lactobacillus jensenii)，惰性乳杆菌(lactobacillus iners)，干酪乳杆菌(lactobacillus casei)，卷曲乳杆菌(lactobacillus crispatus)，弯曲乳杆菌(lactobacillus curvatus)，德氏乳杆菌(lactobacillus delbrueckii)，发酵乳杆菌(lactobacillus fermentum)，加氏乳杆菌(lactobacillus gasseri)，瑞士乳杆菌(lactobacillus helveticus)，约氏乳杆菌(lactobacillus johnsonii)，植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)，罗伊氏乳杆菌(lactobacillus reuteri)，鼠李糖乳杆菌(lactobacillus rhamnosus)，清酒乳杆菌(lactobacillus sakei)，唾液乳杆菌(lactobacillus salivarius)，或其任何组合。
17.在某些实施方案中，所述双歧杆菌属的细菌选自：动物双歧杆菌(bifidobacterium animalis)，两歧双歧杆菌(bifidobacterium bifidum)，短双歧杆菌(bifidobacterium breve)，婴儿双歧杆菌(bifidobacterium infantis)，长双歧杆菌(bifidobacterium longum)，青春双歧杆菌(bifidobacterium adolescentis)，或其任何组合。
18.在某些实施方案中，所述芽孢杆菌属的细菌选自：枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)，凝结芽孢杆菌(bacillus coagulans)，或其任何组合。
19.在某些实施方案中，其中，所述丙酸杆菌属的细菌选自：谢氏丙酸杆菌(propionibacterium shermanii)，费氏丙酸杆菌(propionibacterium freudenreichii),产丙酸丙酸杆菌(propionibacterium acidipropionici)，或其任何组合。
20.在某些实施方案中，所述链球菌属的细菌选自：嗜热链球菌(streptococcus thermophilus)，唾液链球菌(streptococcus salivarius)，或其任何组合。
21.在某些实施方案中，所述乳球菌属的细菌为乳酸乳球菌(lactococcus lactis)。
22.在某些实施方案中，所述肠球菌属的细菌选自：粪肠球菌(enterococcus faecalis)，屎肠球菌(enterococcus faecium)，或其任何组合。
23.在某些实施方案中，所述酵母选自酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)，布拉氏酵母(saccharomyces boulardii)，马克斯克鲁维酵母(kluyveromyces marxianus)，或其任何组合。
24.在某些实施方案中，所述组合物还包括额外的添加剂。
25.本领域技术人员可以根据需求对额外的添加剂进行选择和调整。在某些实施方案中，所述额外的添加剂选自其他营养物质，矿物质，维生素，或其任何组合。
26.在某些实施方案中，所述额外的添加剂能够对其施用的宿主的健康起到有益影响。
27.在某些实施方案中，所述其他营养物质选自膳食纤维，益生元，蛋白质(例如酶)，碳水化合物，脂类物质(例如脂肪)，矿物质，维生素，植物成分(例如，植物提取物)，氨基酸，免疫调节剂，乳汁替代物，或其任何组合。
28.在某些实施方案中，所述矿物质选自铁，锌，钾，钠，钙，镁，及其任何组合。
29.在某些实施方案中，所述维生素选自维生素b1、维生素b2、维生素b6、维生素b12，维生素a，维生素c,维生素d，维生素e，维生素k，及其任何组合。
30.在某些实施方案中，所述组合物作为发酵剂(例如，植物发酵制品的发酵剂，乳制品发酵剂)。在此类实施方案中，所述组合物中的副干酪乳杆菌作为发酵剂参与发酵过程。例如，在制备酸奶的过程中，副干酪乳杆菌作为益生菌与鲜奶一同发酵，制备成酸奶。
31.在某些实施方案中，所述组合物用于制备食物产品和/或膳食补充剂(例如，保健食品)。
32.在某些实施方案中，所述食物产品选自固体饮料，糖果或果汁；或者，所述食物产品为乳制品(例如，酸奶，风味发酵乳，乳酸菌饮料，奶酪)。
33.在某些实施方案中，所述膳食补充剂被配制用于口服施用。
34.在某些实施方案中，所述膳食补充剂为丸剂、粉剂、胶囊剂、片剂、颗粒粉剂、盖膜剂(opercula)、口溶性颗粒剂、小袋剂、糖衣丸剂或液体剂的形式。
35.在某些实施方案中，优选地，所述组合物中副干酪乳杆菌以106至10
12
cfu/剂量的量存在(例如108至10
12
cfu/剂量)。
36.在第三方面，本技术提供了一种食物产品或膳食补充剂，其包含如前所述的副干酪乳杆菌或其后代或如前所述的组合物。
37.在文本中，“食物”一词是广义的，包括人类的食物和饮物，也涵盖动物的食物和饮物(即饲料)。在某些实施方案中，所述食物产品适合于以及设计用于人类进食。
38.可以理解的是，根据用途、应用方式或施用方式的不同，本技术的食物产品可以是液体、固体、悬浮液或粉末的形式。
39.在某些实施方案中，所述食物产品选自固体饮料，糖果或果汁，或者，所述食物产品为乳制品(例如，酸奶，风味发酵乳，乳酸菌饮料，奶酪)。
40.在某些实施方案中，所述膳食补充剂被配制用于口服施用。
41.在某些实施方案中，所述膳食补充剂为丸剂、粉剂、胶囊剂、片剂、颗粒粉剂、盖膜剂(opercula)、口溶性颗粒剂、小袋剂、糖衣丸剂或液体剂的形式。
42.在某些实施方案中，食物产品或膳食补充剂还可包括(但不限于)下列物质中的一种或任何组合：益生菌(例如益生细菌)，膳食纤维、益生元、蛋白质(例如酶)，碳水化合物，
脂类物质(例如脂肪)，维生素，矿物质，植物成分(例如植物提取物)，氨基酸，免疫调节剂，乳汁替代物，或者短双歧杆菌或其后代的代谢物或提取物。在某些实施方案中，还可将本发明的组合物与不同的甜味剂或调味剂、调色物质、稳定剂、助流剂、填充剂等食品中可接受的辅料进行组合。
43.在某些实施方案中，副干酪乳杆菌或其后代以浓缩物形式存在。
44.在某些实施方案中，所述食物产品或膳食补充剂中副干酪乳杆菌以106至10
12
cfu/剂量的量存在(例如108至10
12
cfu/剂量)。
45.在第四方面，本技术提供了一种药物组合物，其包含如前所述的副干酪乳杆菌或其后代。
46.在本文中，术语“药物”涵盖用于人类的药物以及用于动物的药物(即兽医应用)。在某些实施方案中，所述药物用于人。
47.在某些实施方案中，所述药物组合物包含副干酪乳杆菌的制剂。
48.在某些实施方案中，所述药物组合物包含药学上可接受的载体。
49.在某些实施方案中，所述药物组合物被配制用于口服施用。
50.在某些实施方案中，所述药物组合物为丸剂、粉剂、胶囊剂、片剂、颗粒粉剂、盖膜剂(opercula)、口溶性颗粒剂、小袋剂、糖衣丸剂或液体剂的形式。
51.优选地，所述药物组合物中副干酪乳杆菌以106至10
12
cfu/剂量的量存在(例如108至10
12
cfu/剂量)。
52.在第五方面，本技术提供了一种培养物，其包含如前所述的副干酪乳杆菌或其后代。
53.在某些实施方案中，所述培养物还包含选自以下的微生物：细菌，真菌(例如酵母)，或其任何组合。
54.在某些实施方案中，所述培养物还包含提供营养的成分(例如，固体或液体培养基，饲养细胞层)。
55.在某些实施方案中，所述提供营养的成分选自益生元，蛋白质(例如酶)，碳水化合物，脂类物质(例如脂肪)，益生菌，维生素，免疫调节剂，乳汁替代物，矿物质，氨基酸，或其任何组合。
56.在某些实施方案中，所述培养物还包含副干酪乳杆菌或其后代的无细胞培养滤液。
57.在某些实施方案中，所述培养物还包含副干酪乳杆菌或其后代的衍生物。
58.在某些实施方案中，所述衍生物选自代谢产物，酶，细胞结构成分(例如，细胞壁或其成分)，胞外多糖，细菌素，含有免疫原性成分的化合物，或其任何组合。
59.在某些实施方案中，所述微生物可以是任何形式，例如，是活的或死的，为裂解物或提取物，或为细菌产物，或为上清液形式。
60.在第六方面，本技术提供了如前所述的副干酪乳杆菌或其后代或如前所述的组合物或如前所述的药物组合物或如前所述的培养物在制备药物或膳食补充剂或保健品中的用途，所述药物或膳食补充剂或保健品用于在受试者中抑制炎症或缓解炎症性疾病，或用于提高受试者的免疫力，或用于在受试者中预防细菌或病毒感染或自身免疫疾病，或用于在受试者中改善或缓解过敏反应或其相关症状。
61.在某些实施方案中，所述炎症性疾病选自视网膜炎症引起的疾病(例如，视网膜炎，角膜炎)，皮肤炎症引起的疾病(例如，皮炎，湿疹)，呼吸道炎症引起的相关疾病(例如，上呼吸道感染)和消化道炎症引起的相关疾病(例如，炎性肠疾病)。
62.在某些实施方案中，所述细菌或病毒感染选自细菌性感冒，病毒性感冒，尿路感染，阴道炎和宫颈炎。
63.在某些实施方案中，所述自身免疫疾病选自系统性红斑狼疮，糖尿病，类风湿性关节炎和自身免疫性脑炎。
64.在某些实施方案中，所述过敏反应或其相关症状选自湿疹，特应性皮炎，哮喘和食物过敏。
65.在某些实施方案中，所述药物或膳食补充剂或保健品能够促激活免疫细胞，促进细胞因子的产生，抑制炎症或缓解炎症性疾病。
66.在某些实施方案中，所述细胞因子选自il-10，il-6，il-12，tnf-α，或其任何组合。
67.在某些实施方案中，所述抗炎细胞因子是il-10。
68.在某些实施方案中，所述药物或膳食补充剂或保健品能够降低ige水平，抑制ige介导的过敏反应。
69.在某些实施方案中，所述药物或膳食补充剂或保健品单独使用，或与其他抗真菌剂、止痛药、抗炎药、促愈合剂、或保湿剂联合使用。
70.在某些实施方案中，所述受试者是哺乳动物。
71.在某些实施方案中，所述受试者是人。
72.在第七方面，本发明提供了一种抑制炎症或缓解炎症性疾病、或预防细菌或病毒感染或自身免疫疾病、或改善或缓解过敏反应或其相关症状的方法，所述方法包括，将如上所述的副干酪乳杆菌或其后代或如前所述的组合物或如前所述的药物组合物施用于有此需要的受试者。
73.在某些实施方案中，所述炎症性疾病选自视网膜炎症引起的疾病(例如，视网膜炎，角膜炎)，皮肤炎症引起的疾病(例如，皮炎，湿疹)，呼吸道炎症引起的相关疾病(例如，上呼吸道感染)和消化道炎症引起的相关疾病(例如，炎性肠疾病)。
74.在某些实施方案中，所述细菌或病毒感染选自细菌性感冒，病毒性感冒，尿路感染，阴道炎和宫颈炎。
75.在某些实施方案中，所述自身免疫疾病选自系统性红斑狼疮，糖尿病，类风湿性关节炎和自身免疫性脑炎等。
76.在某些实施方案中，所述过敏反应或其相关症状选自湿疹，特应性皮炎，哮喘和食物过敏。
77.在某些实施方案中，通过选自下列的方式来施用如上所述的副干酪乳杆菌或其后代或如前所述的药物组合物：口服施用，注射施用(例如静脉内注射或肌肉注射)，局部施用(例如涂抹)，或其任何组合。
78.在某些实施方案中，单独施用如上所述的副干酪乳杆菌或其后代或如前所述的药物组合物，或将其与其他抗真菌剂、止痛药、抗炎药、促愈合剂、或保湿剂联合使用。
79.在某些实施方案中，所述受试者是哺乳动物。
80.在某些实施方案中，所述受试者是人。
81.在第八方面，本发明提供了一种提高受试者的免疫力的方法，所述方法包括，将如上所述的副干酪乳杆菌或其后代或如前所述的组合物或如前所述的药物组合物施用于有此需要的受试者。
82.在某些实施方案中，通过选自下列的方式来施用如上所述的副干酪乳杆菌或其后代或如前所述的药物组合物：口服施用，注射施用(例如静脉内注射或肌肉注射)，或其任何组合。
83.在某些实施方案中，所述受试者是哺乳动物。
84.在某些实施方案中，所述受试者是人。
85.在第九方面，本发明提供了一种如前所述的副干酪乳杆菌或其后代或如前所述的组合物或如前所述的培养物在制备发酵剂的用途，所述发酵剂用于固体食品(例如，奶酪)或液体食品(例如，酸奶，风味发酵乳，乳酸菌饮料)的发酵中。
86.术语定义
87.在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
88.如本文中所使用的，术语“后代”是指微生物通过生长(例如培养基中培养生长)而产生的子代细胞。易于理解的是，在微生物的生长和培养中，尤其是细菌的生长和培养中，遗传物质可能发生一定的变化(例如，一个或几个碱基的突变)，这些变化可以是自发发生，也可以是因化学和/或物理试剂(例如诱变剂)诱变和/或本领域已知的重组dna技术而导致的结果。因此，在本文中，副干酪乳杆菌的后代意欲涵盖与本发明的副干酪乳杆菌相比遗传物质未发生变化和发生变化的后代。当然，所述后代仍然保留其所衍生自的菌株的功能(例如，能够提高免疫力，改善过敏反应等)。
89.如本文中所使用的，术语“药学上可接受的载体”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体，其是本领域公知的(参见例如remington's pharmaceutical sciences.edited by gennaro ar,19th ed.pennsylvania:mack publishing company,1995)，并且包括但不限于：ph调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂。例如，ph调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液；表面活性剂包括但不限于阳离子，阴离子或者非离子型表面活性剂，例如tween-80；离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。
90.如本文中所使用的，术语“膳食补充剂”是指能够向消费者提供有益效果(例如，营养效果、预防效果、治疗效果或其他有益效果)的可食用的产品。在本文中，膳食补充剂涵盖保健品、营养品、补剂等产品。
91.如本文中所使用的，术语“药物”涵盖了人类医学和兽医学中供人类和动物两者使用的药物，同时涵盖了用于掺入动物饲料(例如牲畜饲料和/或宠物食物)中的药物。此外，本文中所使用的术语“药物”意指提供治疗、预防和/或有益效果的任何物质。本文中所使用的术语“药物”不一定限于需要上市许可证(marketing approval)的物质，而是包括可以用于化妆品、保健品、食物(包括例如饲料和饮料)、益生菌培养物和膳食补充剂的物质。
92.如本文中所使用的，术语“cfu(colony-forming units)”是指产品中细菌、真菌、酵母等微生物的群落总数，通常用作活菌数计算。
93.如本文中所使用的，术语“cfu/剂量”意指每天或每次向受试者提供的组合物/食物产品或膳食补充剂/药物组合物中细菌存在的量。例如，在某些实施方案中，所述食物产
culture)(r.i.弗雷谢尼(r.i.freshney)编辑(1987))。
104.另外，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。本领域技术人员知晓，实施例以举例方式描述本发明，且不意欲限制本发明所要求保护的范围。本文中提及的全部公开案和其他参考资料以其全文通过引用合并入本文。
105.实施例1.菌株的分离与鉴定
106.本技术从四川大学华西妇产儿童医院出生的正常足月新生儿粪便样本中分离出265株菌株，从中筛选到了一株副干酪乳杆菌，将其命名为副干酪乳杆菌207-27。其中，新生儿的纳入标准为：居住于成都市五城区；胎龄37-42周，出生体重在2500-4000g之间，婴儿无先天性异常或出生缺陷。排除标准为：母亲在产前一个月内使用过抗生素；父母有艾滋病、结核病、乙肝等传染性疾病；新生儿因新生儿肺炎等严重疾病无法收集粪便。
107.收集婴儿出生后1-4月内的新鲜粪便于无菌采便管。采样后立即暂存于4℃，由采样人员低温送至实验室随即进行粪便样品的稀释培养，如不能立即操作，则厌氧4℃保存，当日进行培养。
108.称取粪便0.5g，并加入4.5ml的粪便稀释液(4.5g kh2po4、6.0gna2hpo4、0.5g l-半胱氨酸盐酸盐、0.5g tween-80、1.0g琼脂混于1000ml蒸馏水，121℃15min高压灭菌备用)，充分振荡混匀，10倍系列稀释。取适宜稀释度的粪便混合液100μl，用l型棒表面涂布于乳酸杆菌选择性琼脂(lbs选择培养基84.0g、lab-lemco powder(oxoid)8.0g、乙酸na
·
3h2o 15.0g、纯水1000ml、乙酸3.7ml)，37℃厌氧培养48h。挑取lbs平板上的乳酸杆菌疑似菌落(一般为白色或略带透明，圆形，边缘光滑)继代培养于mrs培养基(北京陆桥)，37℃耗氧培养48h。对mrs上能耗氧生长的菌株进行革兰染色及显微镜观察，结果如图2所示。根据细菌对氧气的需求情况(兼性厌氧型)及细菌形态(革兰阳性，多样性杆菌：长或细长杆状、弯曲短杆、棒状，棱角分明，一般成链状排列，无芽孢)初步判定为乳酸杆菌。在平板上的培养形态见图1。
109.将分离得到的菌株复苏纯化后，采用梅里埃的api 50 ch和16srdna测序鉴定分离到的乳酸杆菌为副干酪乳杆菌。
110.进一步，采用pacbio sequel2测序平台对副干酪乳杆菌207-27进行全基因组测定，其基因组长度3,151,091bp，gc分别含46.33％(其中，gc含量是指在dna4种碱基中，鸟嘌呤和胞嘧啶所占的比率)，染色体基因组含有3,149个编码基因，59个trna基因，15个rrna基因(包括5s rrna、16s rrna和23s rrna)，35个其他类型rna基因。
111.综合上述pcr鉴定和全基因组测序的实验结果，本技术获得了一株全新的副干酪乳杆菌207-27，并于2020年1月15日对其进行了保藏。
112.实施例2.副干酪乳杆菌207-27的益生菌特性研究
113.1.副干酪乳杆菌207-27的耐酸、耐胆盐实验筛选
114.1.1供试菌悬液的制备：副干酪乳杆菌207-27经mrs培养基复苏，传代两次后备用。在mrs培养48h后，刮取细菌至2ml粪便稀释液中，旋涡震荡混匀，粗调其浓度为10
8-109cfu/ml。
115.1.2模拟胃酸和胆盐培养液的制备
116.模拟胃酸培养液的制备：配制mrs肉汤培养液，灭菌后用1mol/lhcl调节ph值至
3.0，制成模拟胃酸培养液。
117.模拟胆盐培养液的制备：配制mrs肉汤培养液，灭菌后加入牛胆盐至浓度为0.1％，用1mol/l hcl调节ph值至8.0，然后用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，制成胆盐培养液。
118.1.3胃酸、胆盐耐受性测试
119.副干酪乳杆菌207-27耐酸性测试：将0.9ml模拟胃酸培养液分装至ep管中，再加入制得的菌悬液0.1ml，旋涡混匀，然后将其置于37℃厌氧培养箱培养2小时。在0h和2h时分别进行测试，菌株在每个时间点设置3个平行。以未调整ph的mrs肉汤(ph＝7)作对照，观察细菌的生长状况，排除其他因素造成的细菌死亡。
120.副干酪乳杆菌207-27胆盐耐受性测试：将0.9ml胆盐培养液分装至ep管中，再加入制得的菌悬液0.1ml，旋涡混匀，然后将其置于37℃厌氧培养箱培养24小时。在0h和24h时分别进行测试，菌株在每个时间点设置3个平行。以未加胆盐的mrs肉汤(ph＝7)作对照，观察细菌的生长状况，排除其他因素造成的细菌死亡。
121.以上培养完毕后立即10倍梯度稀释，选择适宜稀释度点种mrs平板，37℃厌氧培养24-48h计数。以0小时稀释接种计数结果为初始细菌浓度。结果以存活率进行比较。计算公式如下：
122.存活率(％)＝培养后活菌浓度(cfu/ml)/0小时活菌浓度(cfu/ml)
×
100
123.实验结果显示：所述副干酪乳杆菌207-27在ph＝3的模拟胃酸培养液中消化2小时后的存活率为81.3％；在胆盐培养液中培养24小时后的存活率为78.9％。因此，可知所述副干酪乳杆菌207-27对胃酸和胆盐有良好的耐受性，能够有效抵御上游消化道极端环境，从而顺利抵达下游消化道，如结肠，发挥健康功能。副干酪乳杆菌207-27因此满足作为益生菌的基础要求。
124.2.副干酪乳杆菌207-27对肠粘膜的黏附能力
125.2.1黏附性实验方法：将副干酪乳杆菌207-27在mes平板上复苏、传代三次后，调节菌悬液od600吸光度为0.597
±
0.005(浓度为1
×
109cfu/ml)。以商业菌株动物双歧杆菌(bifidobacterium animalis subsp.lactis)bb-12和鼠李糖乳杆菌(lactobacillus rhamnosus)lgg为对照菌株进行平行试验，按照上述相同的方法制备菌悬液。
126.将500μg/ml黏蛋白溶液加入96孔maxisorp板(nunc)，每孔100μl。置于4℃冰箱过夜孵育。取出用pbs清洗三次，每孔200μl。再用含1％吐温20的pbs封闭1h，每孔100μl。将制备好的菌悬液各取100μl加入微孔，每个菌株设置3个平行。同时，以pbs代替菌悬液加入作为空白对照，设置3个平行。置于4℃冰箱过夜孵育。孵育完毕后，取出，用含0.05％吐温20的pbs清洗三次，除去未粘附的细菌。再于60℃烘箱中干燥1h。在干燥后的微孔板中加入1％结晶紫溶液，每孔100μl，染色45min。之后用pbs清洗6次，加入无水乙醇，静置10min，释放染液。最后通过酶标仪测定各孔在590nm波长下的吸光度。
127.2.2副干酪乳杆菌207-27黏附性结果：副干酪乳杆菌207-27的粘附性实验结果如表1所示。
128.表1.黏附性实验结果
129.[0130][0131]
黏蛋白是肠道上皮细胞产生大量黏液的主要成分,黏液能够保护肠黏膜细胞不与病原微生物接触,阻止病原菌侵入上皮细胞，从而保护上皮细胞的正常功能。研究证明，益生菌能够诱导长上皮细胞分泌黏蛋白，并以占据肠道黏膜附着点的方式在肠黏膜表面形成生物膜，阻止外来菌对肠黏膜的附着。黏蛋白的寡糖链上含有大量的与各种益生菌结合的特异位点，特别是糖链末端的抗原表位还可对肠道益生菌的菌群进行筛选和识别，协助肠道益生菌定植。
[0132]
本实验结果显示，副干酪乳杆菌207-27与商业化菌株动物双歧杆菌bb12和鼠李糖乳杆菌lgg具有相似的黏蛋白结合能力。因此申请人认为，副干酪乳杆菌207-27能够有效的黏附肠粘膜，具有优良的定植能力，以此为基础占据肠粘膜表面，形成益生菌屏障，抑制有害菌的定植和入侵，从而有效调节肠道菌群，保护肠道免疫细胞的正常免疫功能。
[0133]
实施例3.副干酪乳杆菌207-27的免疫特性的细胞实验
[0134]
1.实验方法
[0135]
培养小鼠巨噬细胞raw264.7(5
×
105/ml)，将副干酪乳杆菌207-27的菌悬液浓度调整为109cfu/ml，稀释10倍后与细胞共培养作为实验组，以pgn为阳性对照(pgn为革兰阳性菌的肽聚糖，作为革兰阳性菌刺激诱导宿主免疫细胞炎症作用的主要物质，故作为本实验的阳性对照)，以商业菌株鼠李糖乳杆菌lgg为乳酸杆菌的标准菌株对照，rpmi1640培养基为空白对照，每组设立三个平行样品。共培养24h后收集细胞上清液，酶联免疫吸附测定(elisa)法检测表2中细胞因子表达的蛋白的分泌水平。
[0136]
2.小鼠巨噬细胞raw264.7实验结果及分析
[0137]
2.1酶联免疫吸附试验结果及分析
[0138]
副干酪乳杆菌207-27与小鼠巨噬细胞raw264.7共培养的elisa实验结果如表2所示。
[0139]
表2.elisa实验结果(均数
±
标准差)
[0140][0141]
结果表明，相对于对照组，副干酪乳杆菌207-27能刺激细胞因子il-6、il-10和tnf-α基因的表达水平的升高，诱导巨噬细胞活化。
[0142]
实施例4.副干酪乳杆菌207-27免疫调节能力测试
[0143]
1.实验方法：
[0144]
选取balb/c小鼠，雄性，6周龄，体重18-20g，共18只。分为3组，包括：对照组6只，已在动物及临床试验中证明最具有显著的免疫调节能力的商业益生菌菌株lgg干预对照组6
只，副干酪乳杆菌207-27干预组6只。对照组每天灌胃生理盐水0.2ml，益生菌干预组每天灌胃菌液0.2ml(其含菌量为109cfu)。各分组饲养4周后处死。
[0145]
样品采集：在实验开始灌胃前一天，对所有小鼠进行称重、采便。在实验进行的第14天，对所有小鼠进行称重、采便。在实验进行的第28天，对所有小鼠进行称重、采便、处死、采集并称重脏器(脾、肺、胸腺、肝)。
[0146]
测定指标：用称重法测定脾脏和胸腺的脏器系数；用rt-pcr法测定脾脏组织中细胞因子基因的表达。
[0147]
2.实验结果：
[0148]
干预前后各组体重无显著差异，说明副干酪乳杆菌207-27对小鼠正常发育无不良影响。各组脾脏系数和胸腺系数无显著差异，说明益生菌发挥免疫调节作用不会影响到脏器的正常功能。动物实验证明副干酪乳杆菌207-27激活巨噬细胞活性，刺激其各种相关细胞因子的分泌，激活能力高于商业菌株lgg(表3)。尤其的，il-10显著增加。il-10是一种多功能负性调节细胞因子，在益生菌活化促炎应答(产生il-6和tnf-α)时同时促进了大量抗炎因子il-10的分泌，说明副干酪乳杆菌207-27能够而平衡炎症反应，维护细胞免疫稳态。动物实验结果与细胞实验结果一致。
[0149]
表3.脾脏细胞因子mrna相对表达量
[0150][0151]
实施例5.副干酪乳杆菌207-27抑制过敏反应测试
[0152]
1.实验方法：
[0153]
本实验通过卵白蛋白(ova)建立小鼠血清ige超敏反应的过敏模型，用已在动物及临床试验中证明有显著的抑制过敏反应能力的商业益生菌菌株lgg作对照，来研究副干酪乳杆菌207-27对于抑制过敏反应的作用。
[0154]
实验分组：选取雄性balb/c小鼠，6周龄，18-20g，共60只。分组情况如表4：
[0155]
表4.实验动物分组
[0156]
组别数量灌胃与干预对照组150.2ml生理盐水灌胃+生理盐水注射模型组150.2ml生理盐水灌胃+ova干预207-27实验组150.2ml 207-27+ova干预lgg+ova组150.2ml lgg+ova干预
[0157]
干预：其中ova的试剂为40ugova+0.2ml al(oh)3佐剂(绝对剂量为4mg al(oh)3)。益生菌组的绝对剂量为109cfu，灌胃体积为0.2ml/只/天。喂养42天，分别在7天、21天、28天、35天共进行4次腹腔ova注射干预。
[0158]
样品采集和检测：42天处死动物，测定血清ige含量以及脾脏细胞因子的表达。
[0159]
2.实验结果：
[0160]
ige是介导i型超敏反应的主要介质，i型超敏反应是大多数过敏性疾病的主要生理机制。结果显示，副干酪乳杆菌207-27能够降低过敏小鼠模型血清ige的水平，抑制ige介导的过敏反应，具有缓解过敏性疾病的作用(图3)。本实验还显示，副干酪乳杆菌207-27降低血清ige的能力高于商业菌株lgg。
[0161]
脾脏细胞因子检测结果显示，副干酪乳杆菌207-27使脾脏中的抗炎因子il-10的表达量显著增加(表5)。有报道显示，il-10能够参与th1、th2调节，结合上述结果分析认为，本技术的益生菌能够诱导il-10表达，从而抑制th1和th2细胞活性，下调机体免疫反应水平，从而达到缓解过敏反应的效果。
[0162]
表5.脾脏il-10细胞因子mrna相对表达量
[0163][0164]
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人员将理解：根据已经公布的所有教导，可以对细节进行各种修改和变动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部分为由所附权利要求及其任何等同物给出。