1.本发明涉及中药提取、分离领域，尤其涉及从马齿苋药材中提取、分离和鉴别出的含氮有机酸类化合物及其提取分离方法。


背景技术：

2.马齿苋（portulaca oleracea l.），又名长命菜、马苋菜、五行草，为马齿苋科一年生肉质草本植物。马齿苋耐旱耐涝，且耐光耐阴，分布广泛，资源丰富。大多为野生，很少有人种植，是我国卫生部规定的78种药食同源的野生植物之一。2020版《中华人民共和国药典》中收载马齿苋的干燥地上部分入药，具有清热解毒、凉血止血、止痢等功效，用于热毒血痢、痈肿疔疮、湿疹、丹毒、蛇虫咬伤、便血、痔血、崩漏下血等。
3.马齿苋现代药理学研究表明，其具有抗炎止痛、抗菌、抗病毒、降血压、降血脂、抗氧化、抗癌、松弛骨骼肌和平滑肌、调节免疫功能等作用。研究表明马齿苋众多化学成分为其多样的药理作用提供了物质基础，马齿苋主要化学成分包括黄酮类、香豆素类、萜类、甾类、有机酸类、挥发油、生物碱类、氨基酸类、各种色素类和矿物质类等。其中有机酸类是马齿苋中一类主要的化学成分，目前已报道的有机酸类成分有4-羟基-5-甲基呋喃-3-羧酸、5-羟甲基糠酸、l-焦谷氨酸、水杨酸、香草酸、对羟基苯甲酸、硬脂酸、棕榈酸、油酸、亚油酸和亚麻酸等。
4.目前从马齿苋中分离出的化学成分大多数是已知的，且结构新颖性较低，因此，对马齿苋中新化合物的开发和分离是亟待需要的。


技术实现要素：

5.针对上述问题，本发明提供从马齿苋中提取一种含氮有机酸类化合物，经研究发现本发明的含氮有机酸具有抗胆碱酯酶的作用，同时提供一种针对本发明新生物碱化合物的简便、快速、环保、纯度高的提取分离方法。
6.为了实现上述目的，本发明提供了如下技术方案。
7.本发明提供一种从马齿苋药材中分离出的含氮有机酸类化合物，其特征在于，分子式为c
16h30
n2o5，命名为5-(diethylamino)-2-(3-(diethylamino)-3-oxopropyl)-2-hydroxy-5-oxopentanoic acid。化学结构式为：。
oxopropyl)-2-hydroxy-5-oxopentanoic acid的高分辨质谱图。
20.图2为本发明含氮有机酸化合物5-(diethylamino)-2-(3-(diethylamino)-3-oxopropyl)-2-hydroxy-5-oxopentanoic acid1h-nmr光谱图。
21.图3为本发明含氮有机酸化合物5-(diethylamino)-2-(3-(diethylamino)-3-oxopropyl)-2-hydroxy-5-oxopentanoic acid的
13
c-nmr光谱图。
22.图4为本发明含氮有机酸化合物5-(diethylamino)-2-(3-(diethylamino)-3-oxopropyl)-2-hydroxy-5-oxopentanoic acid的核磁共振碳谱（dept）光谱图。
23.图5为本发明含氮有机酸化合物5-(diethylamino)-2-(3-(diethylamino)-3-oxopropyl)-2-hydroxy-5-oxopentanoic acid的核磁共振1h-1
hcosy光谱图。
24.图6为本发明含氮有机酸化合物5-(diethylamino)-2-(3-(diethylamino)-3-oxopropyl)-2-hydroxy-5-oxopentanoic acid的核磁共振hmbc光谱图。
25.图7为本发明含氮有机酸化合物5-(diethylamino)-2-(3-(diethylamino)-3-oxopropyl)-2-hydroxy-5-oxopentanoic acid的核磁共振hsqc光谱图。
26.图8为本发明含氮有机酸化合物5-(diethylamino)-2-(3-(diethylamino)-3-oxopropyl)-2-hydroxy-5-oxopentanoic acid的核磁共振noesy光谱图。
具体实施方式
27.以下实施例将有助于对本发明的了解，但这些实施例仅为了对本发明加以说明，本发明并不限于这些内容。在实施例中的操作方法均为本技术领域常规操作方法。
28.实施例1。
29.本发明提供一种含氮有机酸类化合物，分子式为c
16h30
n2o5，命名为5-(diethylamino)-2-(3-(diethylamino)-3-oxopropyl)-2-hydroxy-5-oxopentanoic acid。化学结构式为：。
30.所述含氮有机酸类化合物根据结构命名为5-(diethylamino)-2-(3-(diethylamino)-3-oxopropyl)-2-hydroxy-5-oxopentanoic acid，表1为该含氮有机酸化合物的核磁数据：1h-nmr与
13
c-nmr在meod-d4中。
31.表1：本发明含氮有机酸化合物的核磁数据
。
32.本发明含氮有机酸化合物5-(diethylamino)-2-(3-(diethylamino)-3-oxopropyl)-2-hydroxy-5-oxopentanoic acid的结构鉴定与推导。
33.得到的化合物为淡黄色粉末状物质，易溶于甲醇。hresi(-)tofms给出m/z：230.1397[m-h]-的准分子离子峰，分子量为330.2155。点样于硅胶薄层板后，喷稀碘化铋钾试液斑点显橘黄。结合1h-nmr，
13
c-nmr以及dept数据，推测该化合物可能的分子式为c
16h30
n2o5，不饱和度为6。
[0034]
13
c-nmr谱、hmbc谱和dept谱显示9个碳信号，分别为4个ch2（δc44.5、44.7、62.0、63.0，重叠)，2个ch3（δc14.5、14.6，重叠），2个羰基碳（δc171.5、175.1，δc171.5重叠），1个季碳（δc74.7）。在1h nmr谱中，δh1.23（t，3h，j=7.2hz，重叠），δh1.28（t，3h，j=7.2hz，重叠）证明4个甲基的存在。δh2.75（t，2h，j=15.36hz，重叠），δh2.91（dd，2h，j1=15.24hz，j2=7.74hz，重叠），δh4.11（dd，2h，j1=14.28hz，j2=7.14hz，重叠），δh4.22（dd，2h，j1=14.28hz，j2=7.14hz，重叠）证明8个亚甲基的存在。通过
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c-nmr谱图可以看出c-1
ʹʹ
（δh62.0），c-5
ʹʹ
（δh62.0）和c-3
ʹʹ
（δh63.0），c-7
ʹʹ
（δh63.0）具有低场化学位移，根据δh4.11（dd，2h），δh4.22（dd，2h）处的信号和分子式，可以说明c-1
ʹʹ
，c-5
ʹʹ
和c-3
ʹʹ
，c-7
ʹʹ
与n原子相连。1h-1
h cosy光谱中，h-1
ʹʹ
（δh4.11）, h-5
ʹʹ
（δh4.11）与h-2
ʹʹ
（δh1.23），h-6
ʹʹ
（δh1.23），h-3
ʹʹ
（δh4.22），h-7
ʹʹ
（δh4.22）与h-4
ʹʹ
（δh1.28），h-8
ʹʹ
（δh1.28）显示了明显的相关性，根据c-5（δc171.5），c-3
ʹ
（δc171.5）的低场化学位移，连同从h-1
ʹʹ
，h-3
ʹʹ
到c-5和h-5
ʹʹ
，h-7
ʹʹ
到c-3
ʹ
的hmbc相关性，可以推测存在两个对称的n,n-二乙基甲酰胺。
13
c-nmr谱图中δc171.5（c-1）显示了羧
基的信号，δc74.7（c-2）偏向低场，hmbc谱中h-3（δh2.75）到c-1，c-2，c-4，c-5，h-1
ʹ
（δh2.75）到c-1，c-2，c-2
ʹ
，c-3
ʹ
和h-4（δh2.91）到c-1，c-2，c-3，c-5，h-2
ʹ
（δh2.91）到c-1，c-2，c-1
ʹ
，c-3
ʹ
显示了相关性信号，根据以上信息，可以确定此含氮有机酸化合物5-(diethylamino)-2-(3-(diethylamino)-3-oxopropyl)-2-hydroxy-5-oxopentanoic acid的结构。
[0035]
本发明还提供上述该含氮有机酸化合物的提取分离方法，具体步骤为：步骤1：称取马齿苋干燥药材150kg，采用50%乙醇回流提取，50%乙醇用量为药材的8～16倍，回流提取两次，每次2h，减压回收乙醇，放凉至室温，得药液备用；步骤2：将步骤1中浓缩液经硅胶柱层析分离，其中硅胶为100～200目，依次用乙酸乙酯-乙醇（5/1， 4/1， 3/1， 2/1，v/v）梯度洗脱，共得到4个部位，将3/1部分蒸干得到2.6kg提取物，提取物经聚酰胺柱分离，采用乙醇-水（1/100，50/50，70/30，90/10，v/v）梯度洗脱，将70%乙醇部分蒸干后备用；步骤3：将步骤2中所得部分经预处理的ods中压柱层析分离，其中填料粒度为20～40μm，用甲醇-水（50/50，70/30，90/10v/v）洗脱（加压，使流速为1ml/min，温度为室温），将50/50部分在40℃以下减压浓缩至干，备用。所述ods的预处理过程为甲醇浸泡过24h，上柱，用甲醇洗至滴入水中无混浊，再以初始流动相平衡；步骤4：将步骤3中所得物再经si中压柱层析分离，以乙酸乙酯等度洗脱，得到6个部位（即洗脱得6个瓶，每瓶200ml），经薄层色谱进行检测，将第一个部位50℃以下减压浓缩至干，备用。所述si的预处理过程为甲醇浸泡过24h，上柱，用甲醇洗至滴入水中无混浊，再以初始流动相平衡；步骤5：将步骤4中所得物经hplc分离制备，以乙腈-水-0.1%甲酸（10/90，v/v）作为流动相，检测波长为210nm，280nm，制备得到本发明含氮有机酸类化合物，归一法测定纯度均为90～99%。
[0036]
实施例2 本发明含氮有机酸化合物的抗胆碱酯酶作用。
[0037]
1、主要材料。
[0038]
1.1、药品和试剂：实验所用含氮有机酸化合物由上述方法制备，纯度为90～99%，磷酸二氢钠、磷酸氢二钠（国药集团化学试剂有限公司），毒扁豆碱（瀚香生物科技），磷5，5’－二硫代双(2－硝基苯甲酸)(dithiobisnitrobenzoic acid，dtnb，上海金穗生物科技有限公司)，乙酰胆碱酯酶(ache)和碘化硫代乙酰胆碱( acetylthiocholine iodide，atci，大连美仑生物技术有限公司)。
[0039]
1.2、分组：分为阴性对照组、阳性对照组和实验组，各一组。
[0040]
2、实验方法。
[0041]
2.1样品准备，分别精密称取样品和毒扁豆碱1mg，分别以甲醇为溶剂，配置成lmg/ml、0.5mg/ml、0.1mg/ml、0.05mg/ml、0.01mg/ml的五个梯度浓度。分别精密称取7.098g的磷酸二氢钠和5.999g的磷酸氢二钠，用蒸馏水定容至50ml，取3.40ml的磷酸二氢钠和46.6ml的磷酸氢二钠，配制成50ml pbs( 0.1m ph=8.0)；精密称取0.0594gdtnb，加入10ml的pbs，配制成dtnb溶液(15mmol/l)；精密称取0.01g ache，加入10mlpbs，配制成ache溶液(0.2u/ml)；精密称取0.044g atci，用蒸馏水定容至10ml，配制成atci溶液(15mmol/l)。
[0042]
2.2改进的ellman方法测定抗胆碱酯酶活性，在96孔酶标板中依次加入140μlpbs(0.1m ph=8.0)，10μl dtnb(15mmol/l)，15μlache (0.2u/ml)，20μl样品溶液。阴性对照组
实验用甲醇代替样品，阳性对照组实验用毒扁豆碱代替样品。37℃孵育10min后，加10μlatci(15mmol/l)。20℃孵育10min后，用酶标仪在410nm下测定其吸光度值。根据下式计算抑制率:抑制率(%)=（空白组－样品）/空白组
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100%。
[0043]
3、实验结果。
[0044]
实验结果表明本发明含氮有机酸化合物有抗胆碱酯酶作用。实验结果如表2所示。
[0045]
表2：本发明抗胆碱酯酶抑制活性。