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马齿苋中一种含氮有机酸及其提取分离方法与流程

时间:2022-02-17 阅读: 作者:专利查询

马齿苋中一种含氮有机酸及其提取分离方法与流程

1.本发明涉及中药提取、分离领域,尤其涉及从马齿苋药材中提取、分离和鉴别出的含氮有机酸类化合物及其提取分离方法。


背景技术:

2.马齿苋(portulaca oleracea l.),又名长命菜、马苋菜、五行草,为马齿苋科一年生肉质草本植物。马齿苋耐旱耐涝,且耐光耐阴,分布广泛,资源丰富。大多为野生,很少有人种植,是我国卫生部规定的78种药食同源的野生植物之一。2020版《中华人民共和国药典》中收载马齿苋的干燥地上部分入药,具有清热解毒、凉血止血、止痢等功效,用于热毒血痢、痈肿疔疮、湿疹、丹毒、蛇虫咬伤、便血、痔血、崩漏下血等。
3.马齿苋现代药理学研究表明,其具有抗炎止痛、抗菌、抗病毒、降血压、降血脂、抗氧化、抗癌、松弛骨骼肌和平滑肌、调节免疫功能等作用。研究表明马齿苋众多化学成分为其多样的药理作用提供了物质基础,马齿苋主要化学成分包括黄酮类、香豆素类、萜类、甾类、有机酸类、挥发油、生物碱类、氨基酸类、各种色素类和矿物质类等。其中有机酸类是马齿苋中一类主要的化学成分,目前已报道的有机酸类成分有4-羟基-5-甲基呋喃-3-羧酸、5-羟甲基糠酸、l-焦谷氨酸、水杨酸、香草酸、对羟基苯甲酸、硬脂酸、棕榈酸、油酸、亚油酸和亚麻酸等。
4.目前从马齿苋中分离出的化学成分大多数是已知的,且结构新颖性较低,因此,对马齿苋中新化合物的开发和分离是亟待需要的。


技术实现要素:

5.针对上述问题,本发明提供从马齿苋中提取一种含氮有机酸类化合物,经研究发现本发明的含氮有机酸具有抗胆碱酯酶的作用,同时提供一种针对本发明新生物碱化合物的简便、快速、环保、纯度高的提取分离方法。
6.为了实现上述目的,本发明提供了如下技术方案。
7.本发明提供一种从马齿苋药材中分离出的含氮有机酸类化合物,其特征在于,分子式为c
16h30
n2o5,命名为5-(diethylamino)-2-(3-(diethylamino)-3-oxopropyl)-2-hydroxy-5-oxopentanoic acid。化学结构式为:。
oxopropyl)-2-hydroxy-5-oxopentanoic acid的高分辨质谱图。
20.图2为本发明含氮有机酸化合物5-(diethylamino)-2-(3-(diethylamino)-3-oxopropyl)-2-hydroxy-5-oxopentanoic acid1h-nmr光谱图。
21.图3为本发明含氮有机酸化合物5-(diethylamino)-2-(3-(diethylamino)-3-oxopropyl)-2-hydroxy-5-oxopentanoic acid的
13
c-nmr光谱图。
22.图4为本发明含氮有机酸化合物5-(diethylamino)-2-(3-(diethylamino)-3-oxopropyl)-2-hydroxy-5-oxopentanoic acid的核磁共振碳谱(dept)光谱图。
23.图5为本发明含氮有机酸化合物5-(diethylamino)-2-(3-(diethylamino)-3-oxopropyl)-2-hydroxy-5-oxopentanoic acid的核磁共振1h-1
hcosy光谱图。
24.图6为本发明含氮有机酸化合物5-(diethylamino)-2-(3-(diethylamino)-3-oxopropyl)-2-hydroxy-5-oxopentanoic acid的核磁共振hmbc光谱图。
25.图7为本发明含氮有机酸化合物5-(diethylamino)-2-(3-(diethylamino)-3-oxopropyl)-2-hydroxy-5-oxopentanoic acid的核磁共振hsqc光谱图。
26.图8为本发明含氮有机酸化合物5-(diethylamino)-2-(3-(diethylamino)-3-oxopropyl)-2-hydroxy-5-oxopentanoic acid的核磁共振noesy光谱图。
具体实施方式
27.以下实施例将有助于对本发明的了解,但这些实施例仅为了对本发明加以说明,本发明并不限于这些内容。在实施例中的操作方法均为本技术领域常规操作方法。
28.实施例1。
29.本发明提供一种含氮有机酸类化合物,分子式为c
16h30
n2o5,命名为5-(diethylamino)-2-(3-(diethylamino)-3-oxopropyl)-2-hydroxy-5-oxopentanoic acid。化学结构式为:。
30.所述含氮有机酸类化合物根据结构命名为5-(diethylamino)-2-(3-(diethylamino)-3-oxopropyl)-2-hydroxy-5-oxopentanoic acid,表1为该含氮有机酸化合物的核磁数据:1h-nmr与
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c-nmr在meod-d4中。
31.表1:本发明含氮有机酸化合物的核磁数据

32.本发明含氮有机酸化合物5-(diethylamino)-2-(3-(diethylamino)-3-oxopropyl)-2-hydroxy-5-oxopentanoic acid的结构鉴定与推导。
33.得到的化合物为淡黄色粉末状物质,易溶于甲醇。hresi(-)tofms给出m/z:230.1397[m-h]-的准分子离子峰,分子量为330.2155。点样于硅胶薄层板后,喷稀碘化铋钾试液斑点显橘黄。结合1h-nmr,
13
c-nmr以及dept数据,推测该化合物可能的分子式为c
16h30
n2o5,不饱和度为6。
[0034]
13
c-nmr谱、hmbc谱和dept谱显示9个碳信号,分别为4个ch2(δc44.5、44.7、62.0、63.0,重叠),2个ch3(δc14.5、14.6,重叠),2个羰基碳(δc171.5、175.1,δc171.5重叠),1个季碳(δc74.7)。在1h nmr谱中,δh1.23(t,3h,j=7.2hz,重叠),δh1.28(t,3h,j=7.2hz,重叠)证明4个甲基的存在。δh2.75(t,2h,j=15.36hz,重叠),δh2.91(dd,2h,j1=15.24hz,j2=7.74hz,重叠),δh4.11(dd,2h,j1=14.28hz,j2=7.14hz,重叠),δh4.22(dd,2h,j1=14.28hz,j2=7.14hz,重叠)证明8个亚甲基的存在。通过
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c-nmr谱图可以看出c-1
ʹʹ
(δh62.0),c-5
ʹʹ
(δh62.0)和c-3
ʹʹ
(δh63.0),c-7
ʹʹ
(δh63.0)具有低场化学位移,根据δh4.11(dd,2h),δh4.22(dd,2h)处的信号和分子式,可以说明c-1
ʹʹ
,c-5
ʹʹ
和c-3
ʹʹ
,c-7
ʹʹ
与n原子相连。1h-1
h cosy光谱中,h-1
ʹʹ
(δh4.11), h-5
ʹʹ
(δh4.11)与h-2
ʹʹ
(δh1.23),h-6
ʹʹ
(δh1.23),h-3
ʹʹ
(δh4.22),h-7
ʹʹ
(δh4.22)与h-4
ʹʹ
(δh1.28),h-8
ʹʹ
(δh1.28)显示了明显的相关性,根据c-5(δc171.5),c-3
ʹ
(δc171.5)的低场化学位移,连同从h-1
ʹʹ
,h-3
ʹʹ
到c-5和h-5
ʹʹ
,h-7
ʹʹ
到c-3
ʹ
的hmbc相关性,可以推测存在两个对称的n,n-二乙基甲酰胺。
13
c-nmr谱图中δc171.5(c-1)显示了羧
基的信号,δc74.7(c-2)偏向低场,hmbc谱中h-3(δh2.75)到c-1,c-2,c-4,c-5,h-1
ʹ
(δh2.75)到c-1,c-2,c-2
ʹ
,c-3
ʹ
和h-4(δh2.91)到c-1,c-2,c-3,c-5,h-2
ʹ
(δh2.91)到c-1,c-2,c-1
ʹ
,c-3
ʹ
显示了相关性信号,根据以上信息,可以确定此含氮有机酸化合物5-(diethylamino)-2-(3-(diethylamino)-3-oxopropyl)-2-hydroxy-5-oxopentanoic acid的结构。
[0035]
本发明还提供上述该含氮有机酸化合物的提取分离方法,具体步骤为:步骤1:称取马齿苋干燥药材150kg,采用50%乙醇回流提取,50%乙醇用量为药材的8~16倍,回流提取两次,每次2h,减压回收乙醇,放凉至室温,得药液备用;步骤2:将步骤1中浓缩液经硅胶柱层析分离,其中硅胶为100~200目,依次用乙酸乙酯-乙醇(5/1, 4/1, 3/1, 2/1,v/v)梯度洗脱,共得到4个部位,将3/1部分蒸干得到2.6kg提取物,提取物经聚酰胺柱分离,采用乙醇-水(1/100,50/50,70/30,90/10,v/v)梯度洗脱,将70%乙醇部分蒸干后备用;步骤3:将步骤2中所得部分经预处理的ods中压柱层析分离,其中填料粒度为20~40μm,用甲醇-水(50/50,70/30,90/10v/v)洗脱(加压,使流速为1ml/min,温度为室温),将50/50部分在40℃以下减压浓缩至干,备用。所述ods的预处理过程为甲醇浸泡过24h,上柱,用甲醇洗至滴入水中无混浊,再以初始流动相平衡;步骤4:将步骤3中所得物再经si中压柱层析分离,以乙酸乙酯等度洗脱,得到6个部位(即洗脱得6个瓶,每瓶200ml),经薄层色谱进行检测,将第一个部位50℃以下减压浓缩至干,备用。所述si的预处理过程为甲醇浸泡过24h,上柱,用甲醇洗至滴入水中无混浊,再以初始流动相平衡;步骤5:将步骤4中所得物经hplc分离制备,以乙腈-水-0.1%甲酸(10/90,v/v)作为流动相,检测波长为210nm,280nm,制备得到本发明含氮有机酸类化合物,归一法测定纯度均为90~99%。
[0036]
实施例2 本发明含氮有机酸化合物的抗胆碱酯酶作用。
[0037]
1、主要材料。
[0038]
1.1、药品和试剂:实验所用含氮有机酸化合物由上述方法制备,纯度为90~99%,磷酸二氢钠、磷酸氢二钠(国药集团化学试剂有限公司),毒扁豆碱(瀚香生物科技),磷5,5’-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(dithiobisnitrobenzoic acid,dtnb,上海金穗生物科技有限公司),乙酰胆碱酯酶(ache)和碘化硫代乙酰胆碱( acetylthiocholine iodide,atci,大连美仑生物技术有限公司)。
[0039]
1.2、分组:分为阴性对照组、阳性对照组和实验组,各一组。
[0040]
2、实验方法。
[0041]
2.1样品准备,分别精密称取样品和毒扁豆碱1mg,分别以甲醇为溶剂,配置成lmg/ml、0.5mg/ml、0.1mg/ml、0.05mg/ml、0.01mg/ml的五个梯度浓度。分别精密称取7.098g的磷酸二氢钠和5.999g的磷酸氢二钠,用蒸馏水定容至50ml,取3.40ml的磷酸二氢钠和46.6ml的磷酸氢二钠,配制成50ml pbs( 0.1m ph=8.0);精密称取0.0594gdtnb,加入10ml的pbs,配制成dtnb溶液(15mmol/l);精密称取0.01g ache,加入10mlpbs,配制成ache溶液(0.2u/ml);精密称取0.044g atci,用蒸馏水定容至10ml,配制成atci溶液(15mmol/l)。
[0042]
2.2改进的ellman方法测定抗胆碱酯酶活性,在96孔酶标板中依次加入140μlpbs(0.1m ph=8.0),10μl dtnb(15mmol/l),15μlache (0.2u/ml),20μl样品溶液。阴性对照组
实验用甲醇代替样品,阳性对照组实验用毒扁豆碱代替样品。37℃孵育10min后,加10μlatci(15mmol/l)。20℃孵育10min后,用酶标仪在410nm下测定其吸光度值。根据下式计算抑制率:抑制率(%)=(空白组-样品)/空白组
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100%。
[0043]
3、实验结果。
[0044]
实验结果表明本发明含氮有机酸化合物有抗胆碱酯酶作用。实验结果如表2所示。
[0045]
表2:本发明抗胆碱酯酶抑制活性。