1.本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种半胱氨酸响应的硫化氢荧光供体、制备及其应用。
背景技术：
2.硫化氢(h2s)是一种生物信号分子，在体内由l-半胱氨酸和高半胱氨酸为底物，在酶作用下催化产生。目前，硫化氢在神经系统、心血管系统、免疫系统及消化系统中的作用研究已经被广泛报道，是维持生物体内氧化还原平衡的重要内容。并且，硫化氢还有一系列重要的生理病理作用，其中包括调节血压、调控细胞的增殖及凋亡、抑制胰岛素信号、减轻缺血性再灌注损伤等生理作用。因此深入研究硫化氢的生理病理机制，对疾病预防、诊断及治疗有重要意义。
3.在硫化氢的相关研究中，硫化氢释放物质，即硫化氢供体被广泛应用。但理想的硫化氢供体仍然是领域亟需的，目前最常用的硫化氢供体类型主要是缓释型硫化氢供体，包括含硫无机盐类(如硫化氢、硫氢化钠)、劳森试剂类(如gyy4137)、二巯基硫酮类(如dtts)等，其最显著特点是遇水后发生水解，以一定速率释放出h2s气体。
4.近年来，一种羰基硫(o＝c＝s)供体被广泛开发出来，作为可控释放型的硫化氢供体使用。因为羰基硫在细胞或生物体内会被广泛存在的羰基水解酶水解，从而进一步释放硫化氢。这种供体具有广泛的可修饰前景、并且硫化氢释放率高，因此应用场景多，目前是一种非常热门的硫化氢释放方法。但是这类型供体的释放过程中，对于羰基水解酶的依赖性很高，尤其是活体中，羰基水解酶的富集位点具有极大的差异，因此羰基硫类硫化氢供体在释放的过程中仍存在不确定性。
技术实现要素：
5.针对现有的硫化氢供体缺陷的至少之一，本发明提供一种无需酶参与的、可直接由半胱氨酸响应释放的硫化氢荧光供体。
6.本发明的目的采用以下技术方案来实现：
7.一种半胱氨酸响应的硫化氢荧光供体，具有如下的结构式：
[0008][0009]
优选的，r＝n-bu。
[0010]
n-bu(正丁基)在合成中属于一个成本低、易合成的基团，出于合成经济性考虑，r＝n-bu为优选方案；除此之外，r还可以为其它低碳原子数的烷基，或者为水溶性基团，如羧酸基季铵盐等，或者为亚细胞器定位基团，如线粒体定位基团三苯基磷盐溶酶体定位基团吗啉基团等。
[0011]
另一方面，本发明提供一种前述半胱氨酸响应的硫化氢荧光供体的合成方法包括以下步骤：
[0012]
s1、以二氯甲烷为溶剂，在碳酸氢钠存在条件下，化合物(1)与硫光气反应制得化合物(2)；
[0013]
s2、在保护气氛和超低温条件下，以四氢呋喃为溶剂，化合物(2)与苯基格氏试剂，反应制得所述硫化氢荧光供体；
[0014]
所述化合物(1)、(2)的结构式如下：
[0015][0016]
优选的，所述半胱氨酸响应的硫化氢荧光供体的合成方法包括以下步骤：
[0017]
s1、在干燥的二氯甲烷中加入所述化合物(1)和碳酸氢钠，缓慢滴加硫光气的二氯甲烷溶液，并在室温下反应，反应完成后去除溶剂，经柱层析分离得到化合物(2)；
[0018]
s2、在-78℃和氩气气氛下，将所述化合物(2)和二倍当量的苯基格氏试剂加入到干燥的四氢呋喃中，依次在-78℃和室温下进行反应，加入去离子水猝灭反应，以二氯甲烷萃取有机相，干燥后减压蒸馏得到粗品，经柱层析分离得到所述硫化氢荧光供体。
[0019]
苯基具有大的π平面，苯基基团的存在可使得硫羰基片段稳定，相比其它烷基基团，硫羰基片段在7-8的ph值就难以稳定存在，会发生自发性分解，无法达到可控释放的效果。
[0020]
另一方面，本发明提供前述的一种半胱氨酸响应的硫化氢荧光供体的应用，包括：
[0021]
在制备体外或体内的缓释或控释硫化氢的药物中的应用。
[0022]
在制备体外或体内荧光可视化产生硫化氢的药物中的应用。
[0023]
作为体外或体内的半胱氨酸荧光探针的应用。
[0024]
本发明的有益效果为：
[0025]
(1)本发明所述硫化氢供体是由半胱氨酸刺激直接释放，解决了目前常用供体自发释放的问题。
[0026]
(2)本发明所述硫化氢供体在释放硫化氢的同时会释放出荧光信号分子，因此在复杂的生物体系下，可以实时监控硫化氢的释放，不需要额外的方法去检测、定量硫化氢的产生，大大提高了操作的简易性，降低实验难度。
[0027]
(3)本发明所述硫化氢供体的释放过程不需酶的参与，因此硫化氢的释放位点和荧光的产生位点具有高度的重合度，能提供更精确地生物信息，使其在细胞或者活体内具有更强的应用潜力。
附图说明
[0028]
利用附图对本发明作进一步说明，但附图中的实施例不构成对本发明的任何限制，对于本领域的普通技术人员，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据以下附图获得其它的附图。
[0029]
图1是本发明所述半胱氨酸响应的硫化氢荧光供体的结构式；
[0030]
图2是本发明实施例所述硫化氢供体的合成路线图；
[0031]
图3是本发明实施例所述硫化氢供体生成硫化氢的路线图；
[0032]
图4是本发明实施例所述hepg2细胞的激光共聚焦显微镜成像；
[0033]
图5是本发明实施例所述斑马鱼的激光共聚焦显微镜成像图。
具体实施方式
[0034]
结合以下实施例对本发明作进一步描述。
[0035]
本发明的实施例涉及一种半胱氨酸响应的硫化氢荧光供体，具有如下的结构式：
[0036][0037]
其制备方法包括以下步骤：
[0038]
s1、在15ml干燥的二氯甲烷中加入所述化合物(1)850mg、碳酸氢钠530mg，得到溶液a；将544mg硫光气溶于15ml干燥的二氯甲烷中，再缓慢滴入所述溶液a，在室温下反应2h，通过旋转蒸发仪将溶剂除去，再经400目的硅胶层析柱分离得到化合物(2)，洗脱液为体积比30：1的二氯甲烷与甲醇的混合溶液；
[0039]
s2、在-78℃和氩气气氛保护下，将所述化合物(2)500mg加入到20ml干燥的四氢呋喃中，并加入2倍当量的苯基格氏试剂，在-78℃下持续反应1h，再在室温下继续反应1h，加
入20ml去离子水将反应淬灭，以20ml二氯甲烷萃取三次，收集有机相，用无水硫酸镁干燥有机相后减压蒸馏得到粗品，再通过400目的硅胶层析柱分离得到所述硫化氢荧光供体，洗脱液为体积比20：1的二氯甲烷与甲醇的混合溶液。
[0040]
产物表征
[0041]
1、nmr、ms
[0042]
化合物(2)的核磁、质谱结果：
[0043]1h nmr(400mhz,cdcl3)δ:8.67(dd,j＝7.2,0.8hz,1h),8.55(d,j＝8.0hz,1h),8.46(dd,j＝8.4,0.8hz,1h),7.86(t,j＝8.0,1h),7.65(d,j＝8.0,1h),4.17(t,j＝7.2,2h),1.75-1.68(m,2h),1.48-1.42(m,2h),0.98(t,j＝7.6,3h).
13
c nmr(100mhz,cdcl3)δ:184.46,163.72,163.14,154.45,132.07,131.46,129.56,128.08,127.16,124.12,123.32,122.11,119.83,40.42,30.18,20.37,13.83.[m]
+
calcd.for c17h14clno3s,347.0383；found 347.0386.
[0044]
所述硫化氢荧光供体的核磁、质谱结果：
[0045]1h nmr(400mhz,cdcl3)δ:8.69(d,j＝8.0hz,1h),8.63(d,j＝7.2hz,1h),8.48(d,j＝7.8hz,2h),8.14(d,j＝8.4hz,1h),7.76-7.68(m,2h),7.54(t,j＝8.4hz,3h),4.20(t,j＝7.6hz,2h),1.77-1.70(m,2h),1.50-1.44(m,2h),0.99(t,j＝7.6,3h).
13
c nmr(100mhz,cdcl3)δ209.76,164.00,163.50,155.69,137.14,134.11,131.77,131.63,129.44,128.66,127.92,127.44,125.31,123.29,121.13,120.74,40.35,30.22,20.41,13.86.[m]
+
calcd.for c23h19no3s,389.1086；found 389.1095.
[0046]
2、所述供体在细胞中的应用
[0047]
(1)hsd560+hs-az655
[0048]
将所述半胱氨酸响应的硫化氢荧光供体(hsd560)10μm、商用细胞核染料dapi 10μm以及红色硫化氢探针hs-az655(yi zheng et al.，2013)10μm依次与hepg2细胞孵育15min后洗去。
[0049]
参见附图4，可以观察到明显的绿色荧光信号和红色荧光信号，说明供体在细胞体系内被刺激产生荧光，并释放硫化氢。
[0050]
(2)nem+hsd560+hs-az655
[0051]
将细胞hepg2先用马来酰亚胺(nem,500μm)处理30min，除去细胞内的硫醇类物质，洗去；再利用hsd560(10μm)和商用细胞核染料dapi(10μm)，hs-az655(10μm)依次孵育15min，洗去。
[0052]
参见附图4，细胞内无法观察到除dapi以外的荧光信号，说明当细胞内没有硫醇存在时，供体不能被激活。
[0053]
(3)nem+hsd560+hs-az655+cys
[0054]
将细胞hepg2先用马来酰亚胺(nem,500μm)处理，除去细胞内的硫醇类物质；再利用hsd560(10μm)和商用细胞核染料dapi(10μm)，hs-az655(10μm)依次孵育后洗去，之后加入200μm的半胱氨酸(cys)。
[0055]
参见附图4，可以观察到强烈的绿色荧光信号和红色荧光信号，说明供体在细胞体系内被半胱氨酸激活，释放硫化氢和产生荧光信号用于硫化氢的监控。
[0056]
(4)nem+hsd560+hs-az655+hcy/gsh
[0057]
将细胞hepg2先用马来酰亚胺(nem,500μm)处理，除去细胞内的硫醇类物质；再利用hsd560(10μm)和商用细胞核染料dapi(10μm)，hs-az655(10μm)依次与细胞共孵育，洗去；后加入高半胱氨酸(hcy)或谷胱甘肽(gsh)200μm。
[0058]
参见附图4，细胞内无明显信号，说明供体在细胞内是被半胱氨酸选择性激活。
[0059]
3、所述供体在活体中的应用
[0060]
(1)hsd560+hs-az655
[0061]
将hsd560和红色硫化氢探针hs-az655在72h的斑马鱼幼鱼中共孵育15min。
[0062]
利用激光共聚焦扫描，参见附图5，可以观察到明显的绿色荧光信号和红色荧光信号；说明供体在活体内被刺激产生荧光，并释放硫化氢。
[0063]
(2)nem+hsd560+hs-az655
[0064]
将斑马鱼用马来酰亚胺(nem,500μm)处理30min，除去活体内的硫醇类物质,再利用hsd560(10μm)，hs-az655(10μm)依次孵育15min后洗去。
[0065]
利用激光共聚焦扫描，参见附图5，鱼体内无法观察到荧光信号，说明当斑马鱼幼鱼体内没有硫醇存在时，供体不能被激活。
[0066]
(3)nem+hsd560+hs-az655+cys
[0067]
将斑马鱼先用马来酰亚胺(nem，500μm)处理30min，再利用hsd560(10μm)，hs-az655(10μm)依次孵育15min、洗去后，加入200μm的半胱氨酸。
[0068]
利用激光共聚焦扫描，参见附图5，可以观察到强烈的绿色荧光信号和红色荧光信号，说明供体是在活体内被半胱氨酸激活，释放硫化氢和产生荧光信号用于硫化氢的监控。
[0069]
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。