1.本发明具体涉及一种基于颜色判定的环介导的等温扩增(lamp)技术检测十二种马铃薯病害病原菌的引物组合物及检测方法，属于生物技术领域。专用于田间重要马铃薯病害病原菌：致病疫霉(phytophthora infestans)、链格孢菌(alternaria solani)、尖孢镰刀菌(fusarium oxysporum)、木贼镰刀菌(fusarium equiseti)、禾谷镰刀菌(fusarium graminearum)、层出镰刀菌(fusarium proliferatum)、接骨木镰刀菌(fusarium sambucinum)、茄丝核菌(rhizoctonia solani)、茄科雷尔氏菌(ralstonia solanacearum)、黑腐果胶杆菌(pectobacterium atrosepticum)、链霉菌(streptomyces scabies)、粉痂菌(spongospora subterranea)的高灵敏度快速检测，同时可用于田间马铃薯病害的早期诊断和病原菌的监测。


背景技术：

2.马铃薯病害是由多种病原真菌及卵菌侵染马铃薯导致的，严重危害马铃薯生产。引起马铃薯病害的病原菌主要是致病疫霉(phytophthora infestans)、链格孢菌(alternaria solani)、尖孢镰刀菌(fusarium oxysporum)、木贼镰刀菌(fusarium equiseti)、禾谷镰刀菌(fusarium graminearum)、层出镰刀菌(fusarium proliferatum)、接骨木镰刀菌(fusarium sambucinum)、茄丝核菌(rhizoctonia solani)、茄科雷尔氏菌(ralstonia solanacearum)、黑腐果胶杆菌(pectobacterium atrosepticum)、链霉菌(streptomyces scabies)、粉痂菌(spongospora subterranea)等。由上述病原菌造成的马铃薯病害包括：马铃薯晚疫病、马铃薯早疫病、马铃薯枯萎病、马铃薯干腐病、马铃薯黑痣病、马铃薯青枯病、马铃薯黑胫病、马铃薯疮痂病和马铃薯粉痂病等。这些病害分布广、危害重，往往导致农业生产的严重损失。及时对这些病原菌进行准确的检测有利于病害的快速诊断并及时指导防治。
3.传统的检测各种病原菌的方法是进行病原菌的分离纯化。传统方法在病原菌检测中发挥了重要作用，但是费时费力而且要求操作者具备专业的病原菌分离、形态学鉴定知识和丰富的经验。随着核酸相关的鉴定方法的发展，基于pcr的方法已经成功用于检测病原菌，虽然pcr法在特异性和敏感性上有较大的提高，但是检测时间仍然比较长，大概4～5h，同时pcr方法依赖精密的温度循环装置。其检测灵敏度比较高，但是检测过程复杂，不能满足快速检测的需求。
4.环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，lamp)是日本的荣研株式会发明的一种新的核酸扩增技术，因为其操作简单、快速、特异性高、成本低等优点，成为可以替代pcr的新的核酸扩增技术。它是针对靶基因的6个区域设计4种特异的引物，在bst大片段聚合酶的作用下引起自循环链置换反应，60～65℃范围60min内，大量合成目标dna的同时伴随有副产物——白色的焦磷酸镁沉淀产生。由于lamp扩增过程依赖识别靶序列6个独立区域，所以反应特异性很强，并且核酸扩增过程是在恒温条件下进行，普通
水浴锅或者有稳定热源的设备就能满足反应要求，检测成本大大降低。
5.靶标基因的选择是lamp检测的重要因素之一。本发明分析了致病疫霉、链格孢菌、尖孢镰刀菌、木贼镰刀菌、禾谷镰刀菌、层出镰刀菌、接骨木镰刀菌、茄丝核菌、茄科雷尔氏菌、黑腐果胶杆菌、链霉菌和粉痂菌的不同小种内、不同物种间靶标基因在序列上的差异，设计了特异性的lamp引物，在此基础上建立了检测致病疫霉的lamp体系。


技术实现要素：

6.本发明的目的是解决现有技术中导致常见马铃薯病害病原菌的生物学检测方法所需周期长、费时费力、繁琐、特异性差的问题及pcr检测技术需要热循环仪器，无法快速检测各马铃薯病害病原菌的技术问题，而提供了一种用于检测十二种马铃薯病害病原菌的lamp引物组合物、试剂盒及其可视化检测方法。本发明方法是对致病疫霉、链格孢菌、尖孢镰刀菌、木贼镰刀菌、禾谷镰刀菌、层出镰刀菌、接骨木镰刀菌、茄丝核菌、茄科雷尔氏菌、黑腐果胶杆菌、链霉菌和粉痂菌的新分子检测方法，对上述十二种病原菌进行lamp检测，检测周期短(仅需1h)、准确性高、灵敏性高、肉眼观察检测结果。
7.本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
8.一种用于检测十二种马铃薯病害病原菌的lamp引物组合物，该引物组合物包含以下(1)～(12)引物组中的至少一种：
9.(1)致病疫霉检测引物组(f3、b3、fip、bip、lb)；
10.(2)链格孢菌检测引物组(f3、b3、fip、bip、lf)；
11.(3)尖孢镰刀菌检测引物组(f3、b3、fip、bip、lf)；
12.(4)木贼镰刀菌检测引物组(f3、b3、fip、bip、lf、lb)；
13.(5)禾谷木镰刀菌检测引物组(f3、b3、fip、bip、lf、lb)；
14.(6)层出镰刀菌检测引物组(f3、b3、fip、bip、lf、lb)；
15.(7)接骨木镰刀菌检测引物组(f3、b3、fip、bip、lf)；
16.(8)茄丝核菌检测引物组(f3、b3、fip、bip、lb)；
17.(9)茄科雷尔氏菌检测引物组(f3、b3、fip、bip、lf、lb)；
18.(10)黑腐果胶杆菌检测引物组(f3、b3、fip、bip、lf、lb)；
19.(11)链霉菌检测引物组(f3、b3、fip、bip、lb)；
20.(12)粉痂菌检测引物组(f3、b3、fip、bip、lf、lb)；
21.其中，
22.(1)致病疫霉lamp分子检测引物组由五条特异性引物fip、bip、f3、b3、lb组成：
[0023][0024][0025]
(2)链格孢菌lamp分子检测引物组由五条特异性引物fip、bip、f3、b3、lf组成：
[0026][0027]
(3)尖孢镰刀菌lamp分子检测引物组由五条特异性引物fip、bip、f3、b3、lf组成：
[0028][0029]
(4)木贼镰刀菌lamp分子检测引物组由六条特异性引物fip、bip、f3、b3、lf、lb组成：
[0030][0031]
(5)禾谷木镰刀菌lamp分子检测引物组由六条特异性引物fip、bip、f3、b3、lf、lb组成：
[0032][0033][0034]
(6)层出镰刀菌lamp分子检测引物组由六条特异性引物fip、bip、f3、b3、lf、lb组成：
[0035][0036]
(7)接骨木镰刀菌lamp分子检测引物组由五条特异性引物fip、bip、f3、b3、lf组成：
[0037][0038]
(8)茄丝核菌lamp分子检测引物组由五条特异性引物fip、bip、f3、b3、lb组成：
[0039][0040]
(9)茄科雷尔氏菌lamp分子检测引物组由六条特异性引物fip、bip、f3、b3、lf、lb组成：
[0041][0042]
(10)黑腐果胶杆菌lamp分子检测引物组由六条特异性引物fip、bip、f3、b3、lf、lb组成：
[0043][0044]
(11)链霉菌lamp分子检测引物组由五条特异性引物fip、bip、f3、b3、lb组成：
[0045][0046]
(12)粉痂菌lamp分子检测引物组由六条特异性引物fip、bip、f3、b3、lf、lb组成：
[0047][0048][0049]
本发明选择致病疫霉的ypt1序列、链格孢菌的alt a1序列、尖孢镰刀菌的tef-1α序列、木贼镰刀菌的tef-1α序列、禾谷镰刀菌的tef-1α序列、层出镰刀菌的red1序列、接骨木镰刀菌的tef-1α序列、茄丝核菌的its序列、茄科雷尔氏菌的16s rrna序列、黑腐果胶杆菌的gryb序列、链霉菌的nec1序列和粉痂菌的its序列作为靶标基因设计十二种马铃薯病害病原菌的lamp分子检测引物组(十二种马铃薯病害病原菌各靶基因的序列已经公开)；
[0050]
针对致病疫霉的ypt1序列的特异性引物fip、bip、f3、b3、lb设计见图3；
[0051]
针对链格孢菌的alt a1序列的特异性引物fip、bip、f3、b3、lf设计见图4；
[0052]
针对尖孢镰刀菌的tef-1α序列的特异性引物fip、bip、f3、b3、lf设计见图5；
[0053]
针对木贼镰刀菌的tef-1α序列的特异性引物fip、bip、f3、b3、lf、lb设计见图6；
[0054]
针对禾谷镰刀菌的tef-1α序列的特异性引物fip、bip、f3、b3、lf、lb设计见图7；
[0055]
针对层出镰刀菌的red1序列的特异性引物fip、bip、f3、b3、lf、lb设计见图8；
[0056]
针对接骨木镰刀菌的tef-1α序列的特异性引物fip、bip、f3、b3、lf设计见图9；
[0057]
针对茄丝核菌的its序列的特异性引物fip、bip、f3、b3、lb设计见图10；
[0058]
针对茄科雷尔氏菌的16s rrna序列的特异性引物fip、bip、f3、b3、lf、lb设计见图11；
[0059]
针对黑腐果胶杆菌的gryb序列的特异性引物fip、bip、f3、b3、lf、lb设计见图12；
[0060]
针对链霉菌的nec1序列的特异性引物fip、bip、f3、b3、lb设计见图13；
[0061]
针对粉痂菌的its序列的特异性引物fip、bip、f3、b3、lf、lb设计见图14。
[0062]
上述的lamp引物组合物在检测十二种马铃薯病害病原菌中的应用。
[0063]
上述的lamp引物组合物在制备用于检测十二种马铃薯病害病原菌试剂盒中的应用。
[0064]
一种用于检测十二种马铃薯病害病原菌的lamp试剂盒，该试剂盒中包含上述的lamp引物组合物。
[0065]
作为一种优选技术方案，该试剂盒的反应体系为：
[0066]
1ml检测溶液包括：20μm正向内引物fip、20μm反向内引物bip、10μm正向外引物f3、10μm反向外引物b3、10μm正向环引物lf、10μm反向环引物lb、10
×
buffer、10mm dntps、50mm mgso4、5m甜菜碱、bst dna polymerase 8u/μl，加入超纯水制备成1ml检测溶液。保存期限为1年。
[0067]
上述的lamp试剂盒在检测十二种马铃薯病害病原菌中的应用。
[0068]
一种十二种马铃薯病害病原菌的lamp检测方法，采用上述的lamp试剂盒进行lamp反应，所述lamp反应的程序为：62℃70min；扩增产物的检测：在恒温扩增后的产物中加入sybr green i(荧光染料)作为反应指示剂，以荧光染料的颜色变化做为结果判定标准；黄绿色表示检测为阳性，存在目标病原菌，橙黄色表示检测结果为阴性。
[0069]
采用上述lamp检测试剂盒检测十二种马铃薯病害病原菌的方法，具体包括以下步骤：
[0070]
(1)十二种马铃薯病害病原菌的lamp检测：取4μl dna溶液，加入18μl试剂盒溶液，3μl灭菌去离子水，总体积为25μl；
[0071]
(2)反应程序为：62℃70min；
[0072]
(3)扩增产物的检测：在扩增后加入荧光染料(sybr green i)作为反应指示剂，以产物的颜色变化做为结果判定标准。黄绿色表示检测为阳性，存在该种病原菌。橙黄色表示检测结果为阴性。
[0073]
本发明基于颜色判定的环介导等温扩增(lamp)技术检测致病疫霉(phytophthora infestans)、链格孢菌(alternaria solani)、尖孢镰刀菌(fusarium oxysporum)、木贼镰刀菌(fusarium equiseti)、禾谷镰刀菌(fusarium graminearum)、层出镰刀菌(fusarium proliferatum)、接骨木镰刀菌(fusarium sambucinum)、茄丝核菌(rhizoctonia solani)、茄科雷尔氏菌(ralstonia solanacearum)、黑腐果胶杆菌(pectobacterium atrosepticum)、链霉菌(streptomyces scabies)、粉痂菌(spongospora subterranea)的检测试剂盒属于农作物防病治病及植物检疫范畴。经检测验证，本发明试剂盒具有良好的特异性灵敏度，扩增快速、高效，且鉴定简便。本发明的检测体系在62℃等温条件下，能快速、方便、高效、高特异、高灵敏地检测到致病疫霉、链格孢菌、尖孢镰刀菌、木贼镰刀菌、禾谷镰刀菌、层出镰刀菌、接骨木镰刀菌、茄丝核菌、茄科雷尔氏菌、黑腐果胶杆菌、链霉菌和粉痂菌，不需要复杂仪器，能较好满足对12种马铃薯病害病原菌的现场检测，为检疫性病害病原菌的检测提供了新的技术平台，能较好满足目前对马铃薯病害的现场检测的迫切需要，用于进出口检疫、田间检疫等的现场检测，易于大范围推广应用。
[0074]
本发明与现有技术相比，其优点和积极效果表现在：
[0075]
(1)实用性好。普通pcr反应对产物进行凝胶电泳很容易造成产物扩散，这是实验室污染的一个主要来源；而且溴化乙锭(eb)有巨毒，可累积致癌；长期观察紫外灯也会对实验人员造成一定程度的伤害。而lamp反应只需在恒温水浴锅中进行，反应结束之后通过产物颜色变化便可直接判断结果，从而增加了其在田间的应用价值。
[0076]
(2)恒温扩增。实现了恒温扩增，不像pcr法必须要热循环，这样就摆脱了对热循环仪器的依赖，只要有稳定的热源lamp反应就可以发生，极大的扩展了lamp使用的范围，lamp之所以能在恒定的热源下发生反应是因为在lamp反应液中添加了甜菜碱，使双链dna处于解链的动态平衡中，在bst dna聚合酶的作用下实现扩增。
[0077]
(3)准确性高。由于传统病原菌检测技术只是根据形态特征来确定检疫对象，无法排除人为因素的干扰，很难区分形态相近种，检测准确性只有60-80％；本发明选取了12种马铃薯病害病原菌特异或通用的靶标基因，该靶标基因不仅对于其他马铃薯常见病害病原物间表现高度特异，还在同种病原菌种内表现高度保守，因此我们最终选择致病疫霉的ypt1序列、链格孢菌的alt a1序列、尖孢镰刀菌的tef-1α序列、木贼镰刀菌的tef-1α序列、禾谷镰刀菌的tef-1α序列、层出镰刀菌的red1序列、接骨木镰刀菌的tef-1α序列、茄丝核菌的its序列、茄科雷尔氏菌的16s rrna序列、黑腐果胶杆菌的gryb序列、链霉菌的nec1序列和粉痂菌的its序列作为靶标基因。利用bioedit软件将不同病原菌的序列、其他小种和其他病原菌的序列进行比较，选取各种病原菌特有的一段序列设计特异性的lamp引物。利用primerexpiore v5软件进行lamp引物设计，并根据引物长度，gc含量，吉布斯自由能等指标筛选出一组引物，lamp反应通过4条引物特异性识别靶序列上的6个独立区域，相对于pcr引物识别靶序列的2个独立区域而言，特异性和灵敏度都比较高。
[0078]
说明书附图
[0079]
图1为lamp检测十二种马铃薯病害病原菌的特异性。
[0080]
通过对12个导致马铃薯病害病原菌共计12个菌株进行了lamp扩增。(1：阴性对照h2o；2：致病疫霉菌株pi；3：木贼镰刀菌fe；4：尖孢镰刀菌fo；5：禾谷镰刀菌fg；6：茄丝核菌rs；7：链格孢菌as；8：层出镰刀菌fp；9：黑腐果胶杆菌pba；10：茄科雷尔氏菌rs-2；11：链霉菌ss；12：粉痂菌ss-2；13：接骨木镰刀菌fsam)。检验lamp方法的特异性，反应70min后根据反应管内颜色变化进行结果判定。
[0081]
(a)颜色判定lamp检测致病疫霉的特异性显色图。阳性反应呈现黄绿色，阴性对照呈现橙黄色。
[0082]
(b)颜色判定lamp检测链格孢菌的特异性显色图。阳性反应呈现黄绿色，阴性对照呈现橙黄色。
[0083]
(c)颜色判定lamp检测尖孢镰刀菌的特异性显色图。阳性反应呈现黄绿色，阴性对照呈现橙黄色。
[0084]
(d)颜色判定lamp检测木贼镰刀菌的特异性显色图。阳性反应呈现黄绿色，阴性对照呈现橙黄色。
[0085]
(e)颜色判定lamp检测禾谷镰刀菌的特异性显色图。阳性反应呈现黄绿色，阴性对照呈现橙黄色。
[0086]
(f)颜色判定lamp检测层出镰刀菌的特异性显色图。阳性反应呈现黄绿色，阴性对
照呈现橙黄色。
[0087]
(g)颜色判定lamp检测接骨木镰刀菌的特异性显色图。阳性反应呈现黄绿色，阴性对照呈现橙黄色。
[0088]
(h)颜色判定lamp检测茄丝核菌的特异性显色图。阳性反应呈现黄绿色，阴性对照呈现橙黄色。
[0089]
(i)颜色判定lamp检测茄科雷尔氏菌的特异性显色图。阳性反应呈现黄绿色，阴性对照呈现橙黄色。
[0090]
(j)颜色判定lamp检测黑腐果胶杆菌的特异性显色图。阳性反应呈现黄绿色，阴性对照呈现橙黄色。
[0091]
(k)颜色判定lamp检测链霉菌的特异性显色图。阳性反应呈现黄绿色，阴性对照呈现橙黄色。
[0092]
(l)颜色判定lamp检测粉痂菌的特异性显色图。阳性反应呈现黄绿色，阴性对照呈现橙黄色。
[0093]
图2为lamp检测致病疫霉、链格孢菌、尖孢镰刀菌、木贼镰刀菌、禾谷镰刀菌、层出镰刀菌、接骨木镰刀菌、茄丝核菌、茄科雷尔氏菌、黑腐果胶杆菌、链霉菌和粉痂菌的灵敏度。
[0094]
其中，lamp扩增不同浓度基因组dna；从左到右分别为25μl的反应体系中分别含有1ng、100pg、10pg、1pg dna的扩增结果。
[0095]
(a)颜色判定lamp检测致病疫霉的灵敏度显色图。阳性反应呈现黄绿色，阴性对照呈现橙黄色。显色表明lamp反应的灵敏度达到1pg。
[0096]
(b)颜色判定lamp检测链格孢菌的灵敏度显色图。阳性反应呈现黄绿色，阴性对照呈现橙黄色。显色表明lamp反应的灵敏度达到1pg。
[0097]
(c)颜色判定lamp检测尖孢镰刀菌的灵敏度显色图。阳性反应呈现黄绿色，阴性对照呈现橙黄色。显色表明lamp反应的灵敏度达到1pg。
[0098]
(d)颜色判定lamp检测木贼镰刀菌的灵敏度显色图。阳性反应呈现黄绿色，阴性对照呈现橙黄色。显色表明lamp反应的灵敏度达到100pg。
[0099]
(e)颜色判定lamp检测禾谷镰刀菌的灵敏度显色图。阳性反应呈现黄绿色，阴性对照呈现橙黄色。显色表明lamp反应的灵敏度达到1pg。
[0100]
(f)颜色判定lamp检测层出镰刀菌的灵敏度显色图。阳性反应呈现黄绿色，阴性对照呈现橙黄色。显色表明lamp反应的灵敏度达到1pg。
[0101]
(g)颜色判定lamp检测接骨木镰刀菌的灵敏度显色图。阳性反应呈现黄绿色，阴性对照呈现橙黄色。显色表明lamp反应的灵敏度达到1ng。
[0102]
(h)颜色判定lamp检测茄丝核菌的灵敏度显色图。阳性反应呈现黄绿色，阴性对照呈现橙黄色。显色表明lamp反应的灵敏度达到1pg。
[0103]
(i)颜色判定lamp检测茄科雷尔氏菌的灵敏度显色图。阳性反应呈现黄绿色，阴性对照呈现橙黄色。显色表明lamp反应的灵敏度达到1pg。
[0104]
(j)颜色判定lamp检测黑腐果胶杆菌的灵敏度显色图。阳性反应呈现黄绿色，阴性对照呈现橙黄色。显色表明lamp反应的灵敏度达到100pg。
[0105]
(k)颜色判定lamp检测链霉菌的灵敏度显色图。阳性反应呈现黄绿色，阴性对照呈
现橙黄色。显色表明lamp反应的灵敏度达到100pg。
[0106]
(l)颜色判定lamp检测粉痂菌的灵敏度显色图。阳性反应呈现黄绿色，阴性对照呈现橙黄色。显色表明lamp反应的灵敏度达到10pg。
[0107]
图3为致病疫霉lamp分子检测引物组的特异性引物fip、bip、f3、b3、lb设计图。
[0108]
图4为链格孢菌lamp分子检测引物组的特异性引物fip、bip、f3、b3、lf设计图。
[0109]
图5为尖孢镰刀菌lamp分子检测引物组的特异性引物fip、bip、f3、b3、lf设计图。
[0110]
图6为木贼镰刀菌lamp分子检测引物组的特异性引物fip、bip、f3、b3、lf、lb设计图。
[0111]
图7为禾谷木镰刀菌lamp分子检测引物组的特异性引物fip、bip、f3、b3、lf、lb设计图。
[0112]
图8为层出镰刀菌lamp分子检测引物组的特异性引物fip、bip、f3、b3、lf、lb设计图。
[0113]
图9为接骨木镰刀菌lamp分子检测引物组的特异性引物fip、bip、f3、b3、lf设计图。
[0114]
图10为茄丝核菌lamp分子检测引物组的特异性引物fip、bip、f3、b3、lb设计图。
[0115]
图11为茄科雷尔氏菌lamp分子检测引物组的特异性引物fip、bip、f3、b3、lf、lb设计图。
[0116]
图12为黑腐果胶杆菌lamp分子检测引物组的特异性引物fip、bip、f3、b3、lf、lb设计图。
[0117]
图13为链霉菌lamp分子检测引物组的特异性引物fip、bip、f3、b3、lb设计图。
[0118]
图14为粉痂菌lamp分子检测引物组的特异性引物fip、bip、f3、b3、lf、lb设计图。
[0119]
图15为利用lamp体系检测贵州省都匀市田间发病马铃薯叶片中十二种病原菌存在情况-样品一。
[0120]
(1：致病疫霉菌株pi；2：链格孢菌as；3：木贼镰刀菌fe；4：禾谷镰刀菌fg；5：尖孢镰刀菌fo；6：层出镰刀菌fp；7：茄丝核菌rs；8：茄科雷尔氏菌rs-2；9：黑腐果胶杆菌pba；10：链霉菌ss；11：粉痂菌ss-2；12：接骨木镰刀菌fsam)。利用lamp体系检测田间样品，反应70min后根据反应管内颜色变化进行结果判定。
[0121]
图16为利用lamp体系检测贵州省都匀市田间发病马铃薯叶片中十二种病原菌存在情况-样品二。
[0122]
(1：致病疫霉菌株pi；2：链格孢菌as；3：木贼镰刀菌fe；4：禾谷镰刀菌fg；5：尖孢镰刀菌fo；6：层出镰刀菌fp；7：茄丝核菌rs；8：茄科雷尔氏菌rs-2；9：黑腐果胶杆菌pba；10：链霉菌ss；11：粉痂菌ss-2；12：接骨木镰刀菌fsam)。利用lamp体系检测田间样品，反应70min后根据反应管内颜色变化进行结果判定。
具体实施方式
[0123]
为了使本领域相关技术领域人员更好地理解本发明中的技术方案，下面结合优选实施例对本发明作进一步说明，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部，本发明不受下述优先实施例的限制。
[0124]
非特殊说明，本发明实施例采用的试剂均为市售商品，所使用的试验方法如无特
殊说明，均为常规方法。
[0125]
实施例1试剂盒成分
[0126]
十二种马铃薯病害病原菌检测试剂盒，包括以下成分：
[0127]
致病疫霉lamp分子检测的五条特异性引物fip、bip、f3、b3、lb：
[0128]
f3(正向外引物)：gctaagtgatggaccgctt；
[0129]
b3(反向外引物)：agccatcatcatgaatgcct；
[0130]
fip(正向内引物)(f1c+f2)：ttggccgttagatcgctcttgt-tgatttgcagatacgcctgt；
[0131]
bip(反向内引物)(b1c+b2)：ccgacgccgccaaggaattt-gttcttcgcactggtctcc；
[0132]
lb(反向环引物)：agcagcttgttcacgttctc
[0133]
链格孢菌lamp分子检测的五条特异性引物fip、bip、f3、b3、lf：
[0134]
f3(正向外引物)：gcttgaggatcacaagtggt；
[0135]
b3(反向外引物)：tgggaagagtggtggtgg；
[0136]
fip(正向内引物)(f1c+f2)：cttctgcctcaggagcaggc-actcttgcggcgagaaca；
[0137]
bip(反向内引物)(b1c+b2)：cgacgagtaagttgccctcgtg-cgacgtaggtgatgctgga；
[0138]
lf(正向环引物)：tcgaaagagaagtccatgaagc。
[0139]
尖孢镰刀菌lamp分子检测的五条特异性引物fip、bip、f3、b3、lf：
[0140]
f3(正向外引物)：gcgtttgccctcttaccatt；
[0141]
b3(反向外引物)：gcatgagcgacaacatacca；
[0142]
fip(正向内引物)(f1c+f2)：cgagctcagcggcttcctatt-cacaacctcaatgagtgcgt；
[0143]
bip(反向内引物)(b1c+b2)：ttcttgacaagctcaaggccga-aggagtctcgaacttccaga；
[0144]
lf(正向环引物)：gactgcttcacacgtgacg。
[0145]
木贼镰刀菌lamp分子检测的六条特异性引物fip、bip、f3、b3、lf、lb：
[0146]
f3(正向外引物)：tgcatagaccggtcacttga；
[0147]
b3(反向外引物)：gccccaccaaaaaattacgg；
[0148]
fip(正向内引物)(f1c+f2)：gcgtgcgatcgaggaaaatgga-taccagtgcggtggtatcg；
[0149]
bip(反向内引物)(b1c+b2)：cctctgcccatcgatccagc-tgtactcgagcggggtaac；
[0150]
lf(正向环引物)：acttctcgatggttcgcttgt；
[0151]
lb(反向环引物)：acccgaatcagtctcgacg。
[0152]
禾谷木镰刀菌lamp分子检测的六条特异性引物fip、bip、f3、b3、lf、lb：
[0153]
f3(正向外引物)：gaatcgccctcacacgac；
[0154]
b3(反向外引物)：aggaacccttaccgagct；
[0155]
fip(正向内引物)(f1c+f2)：tgagccccaccgggaaaaaaat-cgatacgcgcctgttacc；
[0156]
bip(反向内引物)(b1c+b2)：gtctgccctcttcccacaaacc-gacaggtggttagtgactgg；
[0157]
lf(正向环引物)：caaaatttttgacctcgagcgg；
[0158]
lb(反向环引物)：cgctcatcatcacgtgtcaa。
[0159]
层出镰刀菌lamp分子检测的六条特异性引物fip、bip、f3、b3、lf、lb：
[0160]
f3(正向外引物)：cgttcgagaacccgcatat；
[0161]
b3(反向外引物)：tctcaagggcatagccgatt；
[0162]
fip(正向内引物)(f1c+f2)：gtgagctggcaactccactgta-acctgggatcattgcgaca；
[0163]
bip(反向内引物)(b1c+b2)：tggcttgcatcagaggaagct-cagaagctcttgggcgtc；
[0164]
lf(正向环引物)：actgaggtcgggattgattcc；
[0165]
lb(反向环引物)：gagttcttaaagggcaagttcacc。
[0166]
接骨木镰刀菌lamp分子检测的五条特异性引物fip、bip、f3、b3、lf：
[0167]
f3(正向外引物)：accggtcacttgatctacca；
[0168]
b3(反向外引物)：gctttagaggaagggcatgt；
[0169]
fip(正向内引物)(f1c+f2)：gaaagtagggcgcgcgatcg-caagcgaaccatcgagaagt；
[0170]
bip(反向内引物)(b1c+b2)：gactcgacacacgcctgctac-gggtatgagccccaccaa；
[0171]
lf(正向环引物)：gaaaatgagaccaaccttctcga。
[0172]
茄丝核菌lamp分子检测的五条特异性引物fip、bip、f3、b3、lb：
[0173]
f3(正向外引物)：ggtattggaggtcttttgca；
[0174]
b3(反向外引物)：agatcagatcataaaggtattgtc；
[0175]
fip(正向内引物)(f1c+f2)：ttatcacgccgagtggaacc-gctcctctttgttcattagct；
[0176]
bip(反向内引物)(b1c+b2)：tctatcgctgaggacactgtaa-aagtcaatggactattagaagc；
[0177]
lb(反向环引物)：aaggtggccaaggtaaatgc。
[0178]
茄科雷尔氏菌lamp分子检测的六条特异性引物fip、bip、f3、b3、lf、lb：
[0179]
f3(正向外引物)：cgacctgagggtgaaagtg；
[0180]
b3(反向外引物)：tgtccaaaattccccactgc；
[0181]
fip(正向内引物)(f1c+f2)：ggtaggcctttaccccaccaac-cgcaaggcctcatgctat；
[0182]
bip(反向内引物)(b1c+b2)：aaggcgacgatcagtagctggt-tgcctcccgtaggagtct；
[0183]
lf(正向环引物)：atcagacatcggccgctcc；
[0184]
lb(反向环引物)：ctgagaggacgatcagcca。
[0185]
黑腐果胶杆菌lamp分子检测的六条特异性引物fip、bip、f3、b3、lf、lb：
[0186]
f3(正向外引物)：ggcggtatcaaggcattcg；
[0187]
b3(反向外引物)：gtattcagcgtacgggtcat；
[0188]
fip(正向内引物)(f1c+f2)：tccacgccgatgtcatctttca-acctgaaccgtaacaagacg；
[0189]
bip(反向内引物)(b1c+b2)：tgcagtggaacgatggtttcca-aagtgtgtaccaccatcacg；
[0190]
lf(正向环引物)：acacgttcgggtggattgg；
[0191]
lb(反向环引物)：tactgctttaccaacaatattccgc。
[0192]
链霉菌lamp分子检测的五条特异性引物fip、bip、f3、b3、lb：
[0193]
f3(正向外引物)：tgactctctcttcgctgacc；
[0194]
b3(反向外引物)：tcgaaggagatcagcacga；
[0195]
fip(正向内引物)(f1c+f2)：tcaagacgttcgctgacgcg-attcagcattgcagagggca；
[0196]
bip(反向内引物)(b1c+b2)：cgcgcagcagatcgggact-tgaccgcatccgacagtc；
[0197]
lb(反向环引物)：gaggttgtcttcggcgaggg。
[0198]
粉痂菌lamp分子检测的六条特异性引物fip、bip、f3、b3、lf、lb
[0199]
f3(正向外引物)：ggttcccacaacgatgaaga；
[0200]
b3(反向外引物)：ctttcaagccatggaccga；
[0201]
fip(正向内引物)(f1c+f2)：cgaaagcgcaacttgcgttcaa-gcagcgaaatgcgatacgt；
[0202]
bip(反向内引物)(b1c+b2)：agcatgcctctttgagtgtcgg-ccagagctcatagtcccctt；
[0203]
lf(正向环引物)：gattcactgaattctgcaattcgc；
[0204]
lb(反向环引物)：tttctattctcccggaaacgcctg。
[0205]
试剂盒反应体系
[0206]
1ml检测溶液包括：20μm正向内引物fip、20μm反向内引物bip、10μm正向外引物f3、10μm反向外引物b3、10μm正向环引物lf、10μm反向环引物lb、10
×
buffer、10mm dntps、50mm mgso4、5m甜菜碱、bst dna polymerase 8u/μl，加入超纯水制备成1ml检测溶液。保存期限为1年。
[0207]
实施例2贵州省都匀市田间发病马铃薯叶片中十二种病原菌存在情况
[0208]
上述十二种马铃薯病害病原菌检测试剂盒用于检测十二种病原菌的方法，包括：
[0209]
1)田间样品的采集：
[0210]
2021年4月本课题组从贵州省都匀市田间随机采集发病马铃薯叶片，采用五点取样法，在离田块四边4～10步远的各处，随机选择5个点取样，放入塑封袋中单独进行保存。
[0211]
2)分离发病组织上的马铃薯病害病原菌：
[0212]
将新鲜病叶用自来水冲洗干净并吸干水分，在直径为90mm的培养皿底部放入一张滤纸片，喷洒少许灭菌水，将洗净的新鲜病叶背面向上置于潮湿滤纸片上，垫枪头使病组织悬空。将发病马铃薯叶片保湿24h左右，至病斑处长出大量白色霉层，然后挑取菌丝接种于黑麦选择性培养基(含有抗生素氨苄青霉素、利福平、五氯硝基苯)平板和pda培养基平板上，分离卵菌和真菌。
[0213]
将发病的马铃薯叶片剪碎后放入含有灭菌水的50ml离心管中，利用涡旋振荡器进行震荡，得到微生物悬液，然后作一系列的稀释(如1:10、1:100、1:1000、1:10000)，以无菌操作的方式用接种环沾取少许待分离的微生物悬液，在无菌平板表面进行连续划线，微生物细胞数量将随着划线次数的增加而减少，在平板表面挑取单菌落用于分离细菌。
[0214]
3)发病马铃薯叶片的lamp检测，包括：
[0215]
(1)提取发病马铃薯叶片的dna：将有病斑的马铃薯叶片，采用新型植物基因组提取试剂盒(天根dp320-100次)进行基因组的提取，方法遵照说明书；
[0216]
(2)不同病原菌的lamp检测：取4μl田间样品dna溶液，加入18μl试剂盒溶液和3μl灭菌去离子水，总体积为25μl；
[0217]
(3)反应程序为：62℃70min；
[0218]
(4)扩增产物的检测：利用lamp体系检测发病马铃薯叶片上的十二种马铃薯病害病原菌情况，在lamp扩增后的产物中加入sybr green i(荧光染料)作为反应指示剂，以荧光染料的颜色变化作为结果判定标准。黄绿色表示检测为阳性，存在目标病原菌，橙黄色表示检测结果为阴性。通过对贵州省都匀市的两份发病马铃薯叶片进行检测，发现能够检测到致病疫霉、链格孢菌、禾谷镰刀菌、茄科雷尔氏菌和黑腐果胶杆菌(如图15和16)。
[0219]
4)分离的病原菌进行测序验证
[0220]
将形态具有差异的分离出的田间病原菌提取dna，根据真菌保守的its基因和细菌保守的16s rrna基因设计相应的引物，将测序后的序列信息在ncbi上进行blast比对，确定分离出的病原菌种类。将田间样品lamp检测结果与分离出的病原菌进行对比验证lamp引物
的准确度，通过测序比对后确定分离到致病疫霉、链格孢菌和禾谷镰刀菌。利用lamp检测体系可以检测到茄科雷尔氏菌和黑腐果胶杆菌，但后面未能分离到这两种病原菌，分析原因：分离的材料是发病的马铃薯叶片，而马铃薯黑胫病是茎部病害，马铃薯青枯病是危害马铃薯茎部和薯块的系统性病害，茄科雷尔氏菌和黑腐果胶杆菌不是发病马铃薯叶片上的主要细菌，叶片上较难分离。