一种用于特禽性别鉴定的pcr引物、试剂盒及其方法
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于特禽性别鉴定的pcr引物、试剂盒及其方法。


背景技术：

2.特禽是特种经济禽类的简称，同鸡、鸭、鹅等家禽相比，特禽一般驯化时间较短，有的甚至处于半野生状态，如：火鸡、珍珠鸡、七彩山鸡、鹧鸪等。特禽一般具有较高的经济价值，养殖效益高，养殖前景好。在特禽生产中，需要的母禽的数量要远远大于公禽的数量，比如：在自然交配时，公母配比一般为1:10，人工授精，比例则可达1:20。因此，需要进行早期性别鉴定，提前淘汰公禽。
3.雏特禽公母在外形上非常相似，无法从体型外貌进行鉴别，也没有发现类似家禽的金银色羽、横斑羽、快慢羽等伴性遗传性状。目前特禽早期的性别鉴定主要通过翻肛观察生殖突起进行鉴别，一般泄殖腔下部有两个浅红色椭圆形球状突起的为公特禽，有浅粉红色八字状皱襞的为母特禽。但翻肛鉴别须在雏禽出壳一天内进行，雏禽肛门难以翻开，生殖突起萎缩甚至陷入泄殖腔深处，不便观察。翻肛鉴别劳动强度大、工作环境差、专业性高，误鉴率也较高。通过分子生物学手段，快速、准确的进行特禽早期性别鉴定具有重要意义。
4.随着我国特禽产业的快速发展，亟需开发一种简单方便，能够快速、准确鉴别特禽性别的方法。


技术实现要素：

5.本发明目的在于解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种设计合理，可用于特禽早期性别快速鉴定的pcr引物。
6.本发明通过以下技术方案实现本发明的目的：
7.本发明目的之一在于提供一种性别鉴定用pcr引物，所述引物序列如seq id no.1/seq id no.2所示。即所述引物的核苷酸序列为：
8.正向引物(seq id no.1)：5'-tatggactagagctgcacaaa-3'；
9.反向引物(seq id no.2)：5'-gagccatcttctgtctcaa-3'。
10.本发明目的之二在于提供包含本发明所述的性别鉴定用pcr引物的试剂盒。
11.在本发明的一种实施例中，本发明所述的试剂盒包含本发明所述的pcr引物、pcr 反应液，在一些实施例中，还可以包含dna提取液。
12.本发明目的之三在于提供本发明所述的pcr引物或本发明所述的试剂盒在养殖业中的应用。
13.本发明目的之四在于提供本发明所述的pcr引物或本发明所述的试剂盒在火鸡性别鉴定中的应用。
14.本发明所述的在火鸡性别鉴定中的应用，通过本发明所述的引物进行pcr扩增，电泳结果呈现1083bp一条带的为公火鸡，呈现1083bp和766bp的两条带时为母火鸡。
15.本发明目的之五在于提供本发明所述的pcr引物或本发明所述的试剂盒在珍珠鸡性别鉴定中的应用。
16.本发明所述的在珍珠鸡性别鉴定中的应用，通过本发明所述的引物进行pcr扩增，电泳结果呈现960bp一条带的为公珍珠鸡，呈现960bp和771bp的两条带时为母珍珠鸡。
17.本发明目的之六在于提供本发明所述的pcr引物或本发明所述的试剂盒在七彩山鸡性别鉴定中的应用。
18.本发明所述的在七彩山鸡性别鉴定中的应用，通过本发明所述的引物进行pcr扩增，电泳结果呈现1118bp一条带的为公七彩山鸡，呈现1118bp和774bp的两条带时为母七彩山鸡。
19.本发明目的之七在于提供本发明所述的pcr引物或本发明所述的试剂盒在鹧鸪性别鉴定中的应用。
20.本发明所述的在鹧鸪性别鉴定中的应用，通过本发明所述的引物进行pcr扩增，电泳结果呈现945bp一条带的为公鹧鸪，呈现945bp和815bp的两条带时为母鹧鸪。
21.本发明还提供一种火鸡、珍珠鸡、七彩山鸡或鹧鸪性别快速鉴定方法，包括以下步骤：
22.1)提取待测火鸡、珍珠鸡、七彩山鸡或鹧鸪的基因组dna；
23.2)以步骤1)中提取的dna为模板，利用本发明所述引物对，进行pcr扩增反应；
24.3)pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，
25.当待测特禽为火鸡时，电泳结果呈现1083bp一条带的为公火鸡，呈现1083bp和766 bp的两条带时为母火鸡；
26.当待测特禽为珍珠鸡时，电泳结果呈现960bp一条带的为公珍珠鸡，呈现960bp和 771bp的两条带时为母珍珠鸡；
27.当待测特禽为七彩山鸡时，电泳结果呈现1118bp一条带的为公七彩山鸡，呈现1118 bp和774bp的两条带时为母七彩山鸡。
28.当待测特禽为鹧鸪时，电泳结果呈现945bp一条带的为公鹧鸪，呈现945bp和815bp 的两条带时为母鹧鸪。
29.本发明所述的方法，步骤1)提取待测特禽的基因组dna可以按照本领域常规方法提取，例如可以选用包括但不限于羽毛、血液、组织、器官等进行待测特禽的基因组dna 的提取。
30.本发明所述的方法，步骤2)中pcr反应体系可以为本领域的常规体系，在本发明的一种具体的实施方式中，为：2
×
pcr mix(上海生工生物有限公司)12.5μl，10μ mol/l正向和反向引物各0.5μl，50-100μg/ml模板dna 1μl，超纯水10.5μl。
31.本发明所述的方法，步骤2)中pcr反应程序可以为本领域的常规体系，在本发明的一种具体的实施方式中，为：95℃3min，(95℃30s，59℃30s，72℃30s)33循环， 72℃7min。
32.本发明与现有技术相比具有以下优点：本发明通过设计的pcr引物，进行pcr扩增和琼脂糖凝胶电泳，利用电泳结果的条带数来确定特禽的性别，具有操作简单方便，鉴别结果快速准确，便于基层推广和使用，具有广阔的市场应用前景，此外，基于本发明方法开发的检测试剂盒，可产生可观的经济效益和良好的社会价值。
33.本发明的引物对特禽品种限制性小，因此对于所述的本发明所述的火鸡、珍珠鸡、
七彩山鸡和鹧鸪没有具体品种的限制。
附图说明
34.图1为本发明实施例1火鸡的pcr扩增产物的电泳图谱。
35.图2为本发明实施例2火鸡的pcr扩增产物的电泳图谱。
36.图3为本发明实施例3珍珠鸡的pcr扩增产物的电泳图谱。
37.图4为本发明实施例4珍珠鸡的pcr扩增产物的电泳图谱。
38.图5为本发明实施例5七彩山鸡的pcr扩增产物的电泳图谱。
39.图6为本发明实施例6七彩山鸡的pcr扩增产物的电泳图谱。
40.图7为本发明实施例7鹧鸪的pcr扩增产物的电泳图谱。
41.图8为本发明实施例8鹧鸪的pcr扩增产物的电泳图谱。
具体实施方式
42.以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
43.实施例1
44.1已知性别火鸡鉴定
45.1.1样品采集
46.采集10只已知性别的成年青铜火鸡，编号1-5为公火鸡，6-10为母火鸡，使用本发明设计引物扩增火鸡基因组。
47.正向引物(seq id no.1)：5'-tatggactagagctgcacaaa-3'；
48.反向引物(seq id no.2)：5'-gagccatcttctgtctcaa-3'。
49.1.2 pcr扩增
50.pcr反应体系为：
[0051]2×
pcr mix(上海生工生物有限公司)12.5μl，10μmol/l正向和反向引物各0.5 μl，50-100μg/ml模板dna1μl，超纯水10.5μl。
[0052]
pcr反应程序为：95℃3min，(95℃30s，59℃30s，72℃30s)33循环，72℃7min。
[0053]
1.3电泳检测
[0054]
反应结束后，用1.2％琼脂糖凝胶电泳检测。公火鸡电泳检测只有一条1083bp的条带，母火鸡电泳检测时有1083bp和766bp的两条带，见结果如图1(其中1～5为公火鸡，6～10为母火鸡)。
[0055]
以上结果表明本发明能够快速准确对火鸡进行性别鉴定，并且简单易于操作。
[0056]
实施例2
[0057]
2未知性别火鸡鉴定
[0058]
2.1样品采集
[0059]
采集16只未知性别的贝蒂纳火鸡雏火鸡，使用本发明设计引物(seq id no.1)和 (seq id no.2)扩增火鸡基因组。
[0060]
2.2 pcr扩增
[0061]
pcr反应体系为：
[0062]2×
pcr mix(上海生工生物有限公司)12.5μl，10μmol/l正向和反向引物各0.5 μl，50-100μg/ml模板dna 1μl，超纯水10.5μl。
[0063]
pcr反应程序为：95℃3min，(95℃30s，59℃30s，72℃30s)33循环，72℃7min。
[0064]
2.3电泳检测
[0065]
反应结束后，用1.2％琼脂糖凝胶电泳检测。公火鸡电泳检测只有一条1083bp的条带，母火鸡电泳检测时有1083bp和766bp的两条带，见结果如图2(其中2、4、5、7、 9、10、14、15、17为公火鸡，1、3、6、8、11、12、13、16为母火鸡)。
[0066]
供试样本经过解剖，进行性器官观察，以上鉴定结果完全正确。
[0067]
实施例3
[0068]
1已知性别珍珠鸡鉴定
[0069]
1.1样品采集
[0070]
采集12只已知性别的成年珍珠鸡，编号1-6为公珍珠鸡，7-12为母珍珠鸡，使用本发明设计引物扩增珍珠鸡基因组。
[0071]
正向引物(seq id no.1)：5'-tatggactagagctgcacaaa-3'；
[0072]
反向引物(seq id no.2)：5'-gagccatcttctgtctcaa-3'。
[0073]
1.2 pcr扩增
[0074]
pcr反应体系为：
[0075]2×
pcr mix(上海生工生物有限公司)12.5μl，10μmol/l正向和反向引物各0.5 μl，50-100μg/ml模板dna 1μl，超纯水10.5μl。
[0076]
pcr反应程序为：95℃3min，(95℃30s，59℃30s，72℃30s)33循环，72℃7min。
[0077]
1.3电泳检测
[0078]
反应结束后，用1.2％琼脂糖凝胶电泳检测。公珍珠鸡电泳检测只有一条960bp的条带，母珍珠鸡电泳检测时有960bp和771bp的两条带，见结果如图3(其中1～6为公珍珠鸡，7～12为母珍珠鸡)。
[0079]
以上结果表明本发明能够快速准确对珍珠鸡进行性别鉴定，并且简单易于操作。
[0080]
实施例4
[0081]
2未知性别珍珠鸡鉴定
[0082]
2.1样品采集
[0083]
采集17只未知性别的雏珍珠鸡，使用本发明设计引物(seq id no.1)和(seq id no.2)扩增珍珠鸡基因组。
[0084]
2.2 pcr扩增
[0085]
pcr反应体系为：
[0086]2×
pcr mix(上海生工生物有限公司)12.5μl，10μmol/l正向和反向引物各0.5 μl，50-100μg/ml模板dna 1μl，超纯水10.5μl。
[0087]
pcr反应程序为：95℃3min，(95℃30s，59℃30s，72℃30s)33循环，72℃7min。
[0088]
2.3电泳检测
[0089]
反应结束后，用1.2％琼脂糖凝胶电泳检测。公珍珠鸡电泳检测只有一条960bp的条带，母珍珠鸡电泳检测时有960bp和771bp的两条带，见结果如图4(其中1、4、5、6、 8、11、
13、14为公珍珠鸡，2、3、7、9、10、12、15、16、17为母珍珠鸡)。
[0090]
供试样本经过解剖，进行性器官观察，以上鉴定结果完全正确。
[0091]
实施例5
[0092]
1已知性别七彩山鸡鉴定
[0093]
1.1样品采集
[0094]
采集10只已知性别的成年美国七彩山鸡，编号1-5为公七彩山鸡，6-10为母七彩山鸡，使用本发明设计引物扩增七彩山鸡基因组。
[0095]
正向引物(seq id no.1)：5'-tatggactagagctgcacaaa-3'；
[0096]
反向引物(seq id no.2)：5'-gagccatcttctgtctcaa-3'。
[0097]
1.2 pcr扩增
[0098]
pcr反应体系为：
[0099]2×
pcr mix(上海生工生物有限公司)12.5μl，10μmol/l正向和反向引物各0.5 μl，50-100μg/ml模板dna 1μl，超纯水10.5μl。
[0100]
pcr反应程序为：95℃3min，(95℃30s，59℃30s，72℃30s)33循环，72℃7min。
[0101]
1.3电泳检测
[0102]
反应结束后，用1.2％琼脂糖凝胶电泳检测。公七彩山鸡电泳检测只有一条1118bp 的条带，母七彩山鸡电泳检测时有1118bp和774bp的两条带，见结果如图5(其中1～5 为公七彩山鸡，6～10为母七彩山鸡)。
[0103]
以上结果表明本发明能够快速准确对七彩山鸡进行性别鉴定，并且简单易于操作。
[0104]
实施例6
[0105]
2未知性别七彩山鸡鉴定
[0106]
2.1样品采集
[0107]
采集17只未知性别的中国七彩山鸡雏鸡，使用本发明设计引物(seq id no.1)和 (seq id no.2)扩增七彩山鸡基因组。
[0108]
2.2 pcr扩增
[0109]
pcr反应体系为：
[0110]2×
pcr mix(上海生工生物有限公司)12.5μl，10μmol/l正向和反向引物各0.5 μl，50-100μg/ml模板dna 1μl，超纯水10.5μl。
[0111]
pcr反应程序为：95℃3min，(95℃30s，59℃30s，72℃30s)33循环，72℃7min。
[0112]
2.3电泳检测
[0113]
反应结束后，用1.2％琼脂糖凝胶电泳检测。公七彩山鸡电泳检测只有一条1118bp 的条带，母七彩山鸡电泳检测时有1118bp和774bp的两条带，见结果如图6(其中1、2、 4、6、10、11、14、15、16、17为公七彩山鸡，3、5、7、8、9、12、13为母七彩山鸡)。
[0114]
供试样本经过解剖，进行性器官观察，以上鉴定结果完全正确。
[0115]
实施例7
[0116]
1已知性别鹧鸪鉴定
[0117]
1.1样品采集
[0118]
采集10只已知性别的成年鹧鸪，编号1-5为公鹧鸪，6-10为母鹧鸪，使用本发明设
计引物扩增鹧鸪基因组。
[0119]
正向引物(seq id no.1)：5'-tatggactagagctgcacaaa-3'；
[0120]
反向引物(seq id no.2)：5'-gagccatcttctgtctcaa-3'。
[0121]
1.2 pcr扩增
[0122]
pcr反应体系为：
[0123]2×
pcr mix(上海生工生物有限公司)12.5μl，10μmol/l正向和反向引物各0.5 μl，50-100μg/ml模板dna 1μl，超纯水10.5μl。
[0124]
pcr反应程序为：95℃3min，(95℃30s，59℃30s，72℃30s)33循环，72℃7min。
[0125]
1.3电泳检测
[0126]
反应结束后，用1.2％琼脂糖凝胶电泳检测。公鹧鸪电泳检测只有一条945bp的条带，母鹧鸪电泳检测时有945bp和815bp的两条带，见结果如图7(其中1～5为公鹧鸪，6～ 10为母鹧鸪)。
[0127]
以上结果表明本发明能够快速准确对鹧鸪进行性别鉴定，并且简单易于操作。
[0128]
实施例8
[0129]
2未知性别鹧鸪鉴定
[0130]
2.1样品采集
[0131]
采集17只未知性别的雏鹧鸪，使用本发明设计引物(seq id no.1)和(seq id no.2) 扩增鹧鸪基因组。
[0132]
2.2 pcr扩增
[0133]
pcr反应体系为：
[0134]2×
pcr mix(上海生工生物有限公司)12.5μl，10μmol/l正向和反向引物各0.5 μl，50-100μg/ml模板dna 1μl，超纯水10.5μl。
[0135]
pcr反应程序为：95℃3min，(95℃30s，59℃30s，72℃30s)33循环，72℃7min。
[0136]
2.3电泳检测
[0137]
反应结束后，用1.2％琼脂糖凝胶电泳检测。公鹧鸪电泳检测只有一条945bp的条带，母鹧鸪电泳检测时有945bp和815bp的两条带，见结果如图8(其中1、2、6、7、10、12、15、16、17为公鹧鸪，3、4、5、8、9、11、13、14为母鹧鸪)。
[0138]
供试样本经过解剖，进行性器官观察，以上鉴定结果完全正确。