1.本发明属于地方病防治领域，具体涉及耶尔森氏菌调查鉴定方法及对小肠结肠炎预防控制的应用。


背景技术：

2.耶尔森氏菌包含18个菌种，其中有三种对人有致病性，即鼠疫耶尔森氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、假结核耶尔森氏菌；小肠结肠炎耶尔森氏菌和假结核耶尔森氏菌作为肠道致病菌危害着人类的健康，主要经粪口传播，主要症状为腹泻，除了能引起肠道疾病外，还可引起全身多个系统器官的症状，例如呼吸道、心血管系统、骨骼结缔组织患疾；
3.对某一地区的耶尔森氏菌调查和鉴定一方面可以掌握该地鼠疫等致病性耶尔森氏菌的分布情况，另一方面可以为致病性耶尔森氏菌的防控提供依据，最后还可掌握该地区小肠结肠炎耶尔森氏菌分布传播情况，为该地区的耶尔森氏菌致小肠结肠炎预防控制提供临床实施依据；
4.目前针对小肠结肠炎耶尔森氏菌的鉴定普遍采用的是普通pcr检测相关基因，细菌培养和生化鉴定等几种传统方法，细菌培养和生化鉴定周期较长，而pcr法检测成本太高，不利于快速检测和诊断处理；所以本发明提出小肠耶尔森氏菌的调查及鉴定方法，其中鉴定方法采用环介导等温扩增法(lamp)。


技术实现要素：

5.为了解决上述技术问题，且实现上述技术效果，本发明是通过以下技术方案实现的：耶尔森氏菌调查鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：
6.s1：标本采集：从梁河县5个乡镇(遮岛镇、芒东镇、九保乡、曩宋乡、河西乡)采集鼠盲肠标本及时放入10ml改良pbs增菌液中低温保存运输到实验室备检；
7.s2：分离培养：取鼠盲肠放入盛有10ml改良pbs增菌液中，4℃冷增菌后分别于第10、21天接种在耶尔森氏菌选择性培养基cin琼脂平板上，在25-28℃温度环境下培养24-48小时后观察并挑选可疑菌落作进一步鉴定；
8.s3：细菌初筛：挑取s2中适量可疑菌落进行caf1、foxa、ail及inv基因的菌落pcr初筛；扩增结束后1.5％琼脂糖凝胶(加入goldview染料，浓度是5ul/100ml)电泳，在紫外灯下获取结果；
9.s4：lamp法鉴定：利用s3中针对ail基因设计的引物，配置lamp反应体系，在配置好的体系中加入2ul现场标本提取的dna(来自肠培养物)，置于61℃水浴锅中恒温60min，在置于80℃水浴锅中恒温5min，使酶灭活以终止反应，荧光目视检测结果；
10.s5：生化鉴定验证：菌株于25℃培养24小时，再接种于新的cin平板25℃培养17小时，参照api20e肠杆菌鉴定系统说明书接种，置于37℃培养18-24小时判读结果；
11.优选的，所述s3中pcr反应体系配制为：premix12.5ul，上、下游引物各0.5ul，纯水10.5ul；
12.优选的，所述s3中扩增参数为95℃预变性5min，94℃变性15s，57℃退火15s，72℃延伸30s，扩增25个循环，72℃延伸5min；结果判定caf1基因阳性初步判定为鼠疫耶尔森氏菌，单独foxa阳性初步判定为小肠结肠炎耶尔森氏菌，foxa与ail皆阳性初步判定为致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌，而inv阳性则判定为假结核耶尔森氏菌；
13.优选的，所述s4中荧光反应结果与阳性对照(绿色)作比较，若一致，为阳性反应；与阴性对照(淡红色)作比较，若一致，为阴性反应；
14.优选的，所述s2中增菌液dna提取方法为：
15.(1)将对应样本号的增菌液挑至含200ul的缓冲液ga的ep管中，研磨混匀至溶液呈乳白色；
16.(2)加入20ulproteinasek溶液，混匀。加入20ul缓冲液gb，充分颠倒混匀，70℃放置十分钟，溶液变清亮拿出(若管盖内壁有水珠应简单离心)；
17.(3)加入200ul无水乙醇，此时可能出现絮状沉淀；
18.(4)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱cb3中(吸附柱放入收集管中)，12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱cb3放回收集管中；
19.(5)向吸附柱cb3中加入500ul缓冲液gd(使用前先检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm离心30s，倒掉废液将吸附柱cb3放回收集管。向吸附柱cb3中加入600ul漂洗液pw(使用前先检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm离心30s，倒掉废液将吸附柱cb3放回收集管；
20.(6)重复一次上一步操作；
21.(7)将吸附柱cb3放回收集管中，12000rpm离心2min，倒掉废液将吸附柱cb3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液(pw中的乙醇的残留会影响后续的酶反应实验)；
22.(8)将吸附柱cb3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100ul洗脱缓冲液te，室温放置2-5min，12000rpm离心2min，溶液收集到离心管中，放于-20℃保存备用。
23.本发明的有益效果：通过本发明的lamp检测方法可以鉴定出致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌，与生化鉴定结果相互印证；与pcr鉴定结果相同的情况下，通过lamp方法对致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌进行鉴定出结果时间快；通过本发明对地区致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌调查鉴定方法，可以为临床耶尔森氏菌导致的小肠结肠炎预防控制提供重要依据。
附图说明
24.图1为本发明步骤流程框图。
25.图2是携带毒力基因ail的10株菌dna电泳结果；
26.图3是lamp实验结果。
具体实施方式
27.为了清楚完整的说明本发明的技术方案，通过以下实施例进行详细说明。
28.实施例1
29.s1：从丽江市各县采集鼠盲肠标本及时放入10ml改良pbs增菌液中低温保存运输到实验室备检；
30.s2：取鼠盲肠放入盛有10ml改良pbs增菌液中，4℃冷增菌后分别于第10、21天接种在耶尔森氏菌选择性培养基cin琼脂平板上，在25-28℃温度环境下培养24-48小时后观察并挑选可疑菌落作进一步鉴定；
31.s3：挑取s2中适量可疑菌落进行caf1、foxa、ail及inv基因的菌落pcr初筛；扩增结束后1.5％琼脂糖凝胶(加入goldview染料，浓度是5ul/100ml)电泳，在紫外灯下获取结果；引物及扩增条件如表1；
32.表1毒力基因pcr扩增引物序列
[0033][0034]
s4：利用s3中针对ail基因设计的引物，配置lamp反应体系，具体反应体系见表2；在配置好的体系中加入2ul现场标本提取的dna(来自肠培养物)，置于61℃水浴锅中恒温60min，在置于80℃水浴锅中恒温5min，使酶灭活以终止反应，荧光目视检测结果；
[0035]
表2 lamp扩增反应体系
[0036][0037]
s5：菌株于25℃培养24小时，再接种于新的cin平板25℃培养17小时，参照api20e肠杆菌鉴定系统说明书接种，置于37℃培养18-24小时判读结果；
[0038]
优选的，所述s3中pcr反应体系配制为：premix12.5ul，上、下游引物各0.5ul，纯水10.5ul；
[0039]
优选的，所述s3中扩增参数为95℃预变性5min，94℃变性15s，57℃退火15s，72℃延伸30s，扩增25个循环，72℃延伸5min；结果判定caf1基因阳性初步判定为鼠疫耶尔森氏菌，单独foxa阳性初步判定为小肠结肠炎耶尔森氏菌，foxa与ail皆阳性初步判定为致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌，而inv阳性则判定为假结核耶尔森氏菌；
[0040]
优选的，所述s4中荧光反应结果与阳性对照(绿色)作比较，若一致，为阳性反应；与阴性对照(淡红色)作比较，若一致，为阴性反应；
[0041]
优选的，所述s2中增菌液dna提取方法为：
[0042]
(1)将对应样本号的增菌液挑至含200ul的缓冲液ga的ep管中，研磨混匀至溶液呈
乳白色；
[0043]
(2)加入20ulproteinasek溶液，混匀。加入20ul缓冲液gb，充分颠倒混匀，70℃放置十分钟，溶液变清亮拿出(若管盖内壁有水珠应简单离心)；
[0044]
(3)加入200ul无水乙醇，此时可能出现絮状沉淀；
[0045]
(4)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱cb3中(吸附柱放入收集管中)，12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱cb3放回收集管中；
[0046]
(5)向吸附柱cb3中加入500ul缓冲液gd(使用前先检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm离心30s，倒掉废液将吸附柱cb3放回收集管。向吸附柱cb3中加入600ul漂洗液pw(使用前先检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm离心30s，倒掉废液将吸附柱cb3放回收集管；
[0047]
(6)重复一次上一步操作；
[0048]
(7)将吸附柱cb3放回收集管中，12000rpm离心2min，倒掉废液将吸附柱cb3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液(pw中的乙醇的残留会影响后续的酶反应实验)；
[0049]
(8)将吸附柱cb3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100ul洗脱缓冲液te，室温放置2-5min，12000rpm离心2min，溶液收集到离心管中，放于-20℃保存备用。
[0050]
实施例2
[0051]
按照实施例1的鉴定方法，pcr法共检测出10株携带有毒力基因ail的致病菌株，104株未携带ail毒力基因菌株；鉴定结果如图2所示；
[0052]
lamp鉴定方法共鉴定出10株菌结果为阳性，为致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌；其余104株菌阴性，为非致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌，见图3及表3，阳性对照与阴性对照加入的样本均为试剂盒提供，空白对照组加入的是ddh2o。
[0053]
表3 10株致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌检测结果
[0054][0055]
实施例3
[0056]
1)样本采集
[0057]
依照本发明的实施方案，选择共采集云南省金沙江中下游流域5个县1631份样本，其中昭通绥江县153份；昭通水富县229份；昭通永善县407份；昆明禄劝县381份；楚雄元谋县461份；
[0058]
各县采集标本情况如下：
[0059]
表4云南省金沙江中下游流域5个县样本采集情况
[0060][0061]
按照实施例1的技术方案得到以下结果：
[0062]
2)特异基因初筛结果
[0063]
5个县1631份样本中，初筛foxa阳性样本菌株共38份，且38份foxa阳性样本均未携带毒力基因，属于非致病性小肠结肠炎耶尔森菌。初筛inv阳性样本1份，无初筛0392阳性样本；结果如表5。
[0064]
表5各个地区三种致病耶尔森氏菌特异基因初筛结果
[0065][0066]
3)菌株分离结果
[0067]
共分离到foxa阳性菌株38份，foxa阳性菌株分离率为2.33％；分离到inv阳性菌株1份，inv阳性菌株分离率为0.06％；未分离到0392阳性菌株。其中昭通绥江县共153份样本，分离到foxa阳性菌株0份，分离率为0％；昭通水富县样本共229份，分离到foxa阳性菌株8份，阳性率为3.49％；昭通永善县共407份样本，其中分离到foxa阳性菌株17份，阳性率为4.18％；分离到inv阳性菌株1份,分离率为0.25％；昆明禄劝县样本共381份，分离到foxa阳性菌株8份，阳性率为2.10％；楚雄州元谋县461份样本，分离到foxa阳性菌株5份，阳性率为1.08％；结果见表6。
[0068]
表6各个地区三种致病耶尔森氏菌特异基因菌株分离情况
[0069][0070]
4)各地区小肠结肠炎耶尔森菌的分离情况
[0071]
表7各地区小肠结肠炎耶尔森菌的分离情况
[0072][0073]
经spss17.0统计分析，云南省金沙江中下游流域5个县中，除昭通绥江县未分离到小肠结肠炎耶尔森菌外，其余4个地区的小肠结肠炎耶尔森菌分离率也不完全相同(x2＝9.447，p《0.05)，具有统计学意义，表示4个县小肠结肠炎耶尔森菌分离率不全相同，且昭通永善县的小肠结肠炎耶尔森氏菌分离率大于其余地区；
[0074]
5)鼠类和犬类小肠结肠炎耶尔森菌分布情况
[0075]
表8鼠类和犬类样本中小肠结肠炎耶尔森菌分离情况
[0076][0077]
共采集样本1631份，鼠回盲段样本985份、犬类肛拭子646份。其中鼠回盲段样本中分离到小肠结肠炎耶尔森菌24份，分离率为2.44％。犬类肛拭子样本中分离到小肠结肠炎耶尔森菌14份，分离率为2.17％。经spss17.0统计分析，两宿主中小肠结肠炎耶尔森菌分离率差别无统计学意义(x2＝0.124，p》0.05)，即不能认为鼠类与犬类小肠结肠炎耶尔森菌分离率不同。