1.本发明涉及植保防治技术领域，具体涉及一种防治植保青枯雷尔氏菌、青枯假单胞菌病害的噬菌体及其应用。


背景技术：

2.青枯病是农作物生产中高发的一种细菌性土传病害，该病主要由青枯雷尔氏菌（ralstonia solanacearum，简称 rs.）、青枯假单胞菌（pseudomonas solanacearum）侵染引起。该病菌在世界各地均有分布，寄主范围广泛，可侵染54个科450余种植物，主要侵染茄科作物，如烟草、番茄、辣椒，还可侵染花生、胡椒、生姜、香蕉、桑树等重要农作物。由于青枯菌寄主范围广泛、潜伏侵染能力强以及变异能力极强，青枯病的防治一直是植物病害防治方面的一大难题。青枯菌一旦侵染上植物，植株就会表现出迅速萎蔫、枯死、茎叶仍保持绿色、病茎的褐变部位用手挤压有乳白色菌液排出的症状。且植株发病达到中期后，将无药可治，对农户造成了很大的损失。
3.针对青枯菌病害，目前只能通过提前预防或者在发病出期进行治疗，但由于农药、抗生素、化学试剂对青枯病的治疗效果并不好，且还会造成农药、抗生素残留。而生物防治青枯病对环境友好，不会对人体健康带来潜在威胁的问题，因此引起了国内外广大学者的重视。噬菌体由于其高效特异裂解性与专一宿主性，可以针对某一特定的有害细菌菌株有选择性地杀灭它们，使用时不会给生态环境中其他有益菌群造成伤害。噬菌体不仅具有指数式增殖的自我复制能力，只需极少量即可杀灭相应的致病菌，达到预防或控制细菌性感染的目的，而且噬菌体环境丰度高，自然界中普遍存在细菌相应的噬菌体，易于分离且纯化周期短，还能在常温下保存，便于运输和应用。总而言之，噬菌体制剂产品是较为安全的食品安全生物防控手段，具有安全高效、特异性强、稳定性高、自我增殖快、筛选周期短以及不影响食品感官品质等优点，发展前景非常广阔。噬菌体产品代替抗生素是形势所需，因此，开发噬菌体产品具有重大意义。
4.本项目以噬菌体复合制剂高密度生产技术为核心，研究和开发一种可治理植物青枯病的微生态制剂，建立一整套从高活性一系列的噬菌体的驯化和筛选、高密度噬菌体复合制剂发酵生产工艺，实现噬菌体复合制剂的大规模工业化生产和试用。我们开发的噬菌体复合制剂与常规噬菌体制剂相比，创新性在针对一系列的有害病菌特异性的噬菌体，避免了常规的噬菌体产品的治理有害病菌谱窄、见效慢和稳定性差的缺点；与常规益生菌制剂相比，噬菌体复合制剂产品具有治理见效快、安全、无害的特点。植保噬菌体微生态制剂具有对环境友好、对非靶标生物安全以及对植保病害具有特异性杀菌效果等优点，不同于抗生素和化学制剂，其是完全源于自然的绿色环保产品，广泛应用于植保养殖领域和食品安全领域，在养殖业中替代抗生素用于防病抗病、克服过量使用抗生素带来的致病菌耐药性问题，已成为当前生物技术研究的热点。然而，噬菌体对宿主有高度专一性，因此噬菌谱窄的噬菌体一般不能解决在植保养殖过程中出现的多种细菌病害感染问题。


技术实现要素：

5.本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此本发明提供了一种防治植保青枯雷尔氏菌、青枯假单胞菌病害的噬菌体，该噬菌体噬菌谱广，能裂解青枯雷尔氏菌21株，青枯假单胞菌8株。能更有效的解决农作物种植中出现的细菌病害感染问题，具有良好的应用前景。
6.为此，在本发明的第一方面，本发明提出了一种防治植保青枯雷尔氏菌、青枯假单胞菌病害的噬菌体，所述噬菌体于2020年12月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc m 2020944，分类命名为：ralstonia solanacearumphage 10rs306a，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学。根据本发明分离筛选得到的噬菌体10rs306a具有较广的噬菌谱，其能裂解21株青枯雷尔氏菌、8株青枯假单胞菌，能更有效的解决农作物种植中出现的细菌病害感染问题，具有良好的应用前景。
7.在本发明的第二方面，本发明提出了一种微生态制剂，其包括上述的防治植保青枯雷尔氏菌、青枯假单胞菌病害的噬菌体。根据本发明的实施例，该微生态制剂可用于防治植保青枯菌青枯雷尔氏菌、青枯假单胞菌病害等青枯菌病害。
8.可选地，所述噬菌体的有效价为1.8
×
10
11
pfu/ml。
9.本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
10.图1为根据本发明实施例的噬菌体10rs306a的噬菌斑图；图2为根据本发明实施例的噬菌体10rs306a在ncbi上blast比对结果；图3为根据本发明实施例的2个特异性基因的pcr扩增产物电泳图。
11.具体实施方式
12.以下通过特定的具体实例说明本发明的技术方案。应理解，本发明提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤；还应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容的情况下，当亦视为本发明可实施的范畴。
13.为了更好的理解上述技术方案，下面更详细地描述本发明的示例性实施例。虽然显示了本发明的示例性实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。
14.下面参考具体实施例，对本发明进行描述，需要说明的是，这些实施例仅仅是描述性的，而不以任何方式限制本发明。
15.实施例 1 噬菌体10rs306a的筛选和纯化1、番茄青枯病原菌青枯雷尔氏菌的分离
取福建厦门地区患番茄青枯病病的番茄根茎于无菌研钵中，取50 ml75%酒精将根茎表面冲洗干净，置于无菌研钵中研磨碎，再用接种环蘸取研磨液，在青枯菌鉴定培养基ttc平板上划线，30℃下培养24 h，挑取红色菌落，在同样的选择培养基上划线纯化，反复纯化3次，将形态一致的菌株用接种环挑取单菌落接入lb液体培养基中，30℃培养12 h，取500 μl菌液和500 μl 40%甘油混合后置于-80℃冰箱保存。
16.2、青枯雷尔氏菌的扩大培养宿主菌的扩大培养，配置lb液体培养基1 l，121℃高压灭菌 20 min，冷却至室温，采用如下两种接种方法，第一种接种方法是单菌落接种，在无菌条件下挑取保种平板上的单菌落接种，发酵温度为30℃，转速为150 rpm，发酵时间12 h；第二种接种方法是液体接种，加入10％培养基体积的浓度为10
8 cfu/ml的青枯雷尔氏菌菌液至lb液体培养基中进行发酵，发酵温度为30℃，转速为150 rpm，发酵时间12 h。
17.3、噬菌体10rs306a的筛选从福建省厦门、泉州、南平、三明等地45个番茄种植大棚采集土样，采用菌液土样混合富集法，将上述步骤2培养好的青枯雷尔氏菌菌液1 l和土样500g分别取混合到一起，再加入1 l新鲜lb液体培养基富集培养过夜，提取富集过后的液体，先12000 rpm离心10min，再用0.22 μm过滤膜过滤两次，通过涂布点样法筛选得到噬菌体。本技术的噬菌体10rs306a是从福建省厦门市番茄土壤中筛选获得。
18.4、噬菌体10rs306a的纯化挑选单个噬菌斑（噬菌体10rs306a的噬菌斑图如图1所示），放入1ml的sm缓冲液（scientific phygene公司产品）培养过夜，然后12000 rpm离心10 min，再用0.22μm过滤膜过滤两次，进行梯度稀释，稀释至10-6
，先做一个仅加入100 μl浓度为4.2
×
108cfu/ml宿主菌的双层板进行对照，每个稀释梯度各取宿主菌和噬菌体各100 μl进行双层板混板，30℃恒温培养过夜并观察噬菌斑生长状况，挑选单个噬菌斑继续纯化3次。
19.5、噬菌体10rs306a的耐高温性测定取6个装有200ml含量为5.4
×
10
10
pfu/ml噬菌体液10rs306a的三角瓶，分别放置在30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃的水浴锅，放置12 h后通过双层板混板计算处理后的噬菌体含量来测定噬菌体10rs306a的耐高温性。结果如下表1所示：噬菌体10rs306a在70℃处理12 h后依然能够存活，且含量依然较高，而一般噬菌体在60℃处理下都会大量死亡甚至全部死亡，因此，噬菌体10rs306a具有较强的耐高温性。
20.表1：噬菌体10rs306a的耐高温性测定6、噬菌体10rs306a的耐酸碱性测定取7个装有200 ml含量为6.5
×
10
10
pfu/ml噬菌体液的三角瓶，通过滴加浓硫酸溶液和氢氧化钠溶液将噬菌体菌液的ph值分别调为4、5、6、7、8、9、10，放置12 h后通过双层板混板计算处理后的噬菌体含量来测定噬菌体10rs306a的耐酸碱性。结果如表2所示：噬菌体10rs306a在ph值为5和10的处理下依然能够存活，且含量依然较高，而一般噬菌体在ph值为5和8的处理下都会大量死亡甚至全部死亡，说明噬菌体10rs306a具有一定的耐酸性和较强
的耐碱性。
21.表2：噬菌体10rs306a的耐酸碱性测定实施例21、噬菌体10rs306a对青枯雷尔氏菌的最佳感染复数（moi）测定取8个100 ml的新鲜lb液体培养基，分别进行处理。处理1同时加入1 ml含量为10
6 cfu/ml青枯雷尔氏菌菌液和1 ml含量为10
9 pfu/ml噬菌体液，处理2同时加入1 ml含量为10
7 cfu/ml青枯雷尔氏菌菌液和1 ml含量为10
9 pfu/ml噬菌体液，处理3同时加入1 ml含量为10
8 cfu/ml青枯雷尔氏菌菌液和1 ml含量为10
9 pfu/ml噬菌体液，处理4同时加入1 ml含量为108cfu/ml青枯雷尔氏菌菌液和1ml含量为10
8 pfu/ml噬菌体液，处理5同时加入1 ml含量为10
8 cfu/ml青枯雷尔氏菌菌液和1 ml含量为10
7 pfu/ml噬菌体液，处理6同时加入1 ml含量为10
8 cfu/ml青枯雷尔氏菌菌液和1 ml含量为10
6 pfu/ml噬菌体液，处理7同时加入1 ml含量为10
8 cfu/ml青枯雷尔氏菌菌液和1 ml含量为10
5 pfu/ml噬菌体液，处理8同时加入1 ml含量为10
8 cfu/ml青枯雷尔氏菌菌液和1 ml含量为10
4 pfu/ml噬菌体液，在30℃、150 rpm条件下培养12 h后测噬菌体效价。结果如表3所示：最佳感染复数为0.01时，噬菌体效价最高。
22.表3：噬菌体10rs306a对青枯雷尔氏菌最佳感染复数（moi）测定2、噬菌体10rs306a的扩大培养对分离出来的噬菌体进行扩培：配置lb液体培养基1 l，121℃高压灭菌 20 min，冷却至室温，同时加入1 ml含量为109cfu/ml青枯雷尔氏菌菌液和1 ml含量为107pfu/ml噬菌体液，放置在温度为30℃，转速为150 rpm的摇床培养12 h后8000 rpm离心10 min，使得宿主菌沉降于底部，取上层澄清部分，所得液体即为扩大培养的噬菌体10rs306a。
23.3、噬菌体10rs306a微生态制剂的制备配置lb液体培养基1 l，121℃高压灭菌 20 min，冷却至室温，同时加入1 ml含量为10
9 cfu/ml青枯雷尔氏菌菌液和1 ml含量为10
7 pfu/ml噬菌体液，放置在温度为30℃，转速为150 rpm的摇床培养12 h做为种子液，先接种到50 l的发酵罐中，在30℃，转速为150 rpm的发酵条件下培养12 h后再接种到500 l的发酵罐中，在30℃，转速为150 rpm的发酵条
件下培养12 h，将所得的发酵液于8000 rpm离心10 min，使得宿主菌沉降于底部，取上层澄清部分，然后上清液用500 nm、200 nm陶瓷膜分级过滤即得噬菌体微生态制剂。
24.4、噬菌体10rs306a的含量测定将噬菌体进行梯度稀释，稀释至10-10
，先做一个仅加入100 μl浓度为5.8
×
108cfu/ml青枯雷尔氏菌的双层板进行对照，从10-10
浓度开始，各个浓度各取100 μl噬菌体稀释液和100 μl青枯雷尔氏菌液制作双层板混板，30℃恒温培养过夜，通过观察噬菌斑个数计算噬菌体含量。结果表明噬菌体含量为1.8
×
10
11
pfu/ml，含量高且对青枯雷尔氏菌侵染能力强。
25.表4：噬菌体10rs306a的含量测定实施例3噬菌体10rs306a的裂解能力和防治效果1、噬菌体10rs306a对青枯雷尔氏菌的裂解能力测定将噬菌体10rs306a进行计数，分别稀释至1
×
108、1
×
107、1
×
106、1
×
105、1
×
10
4 pfu/ml 5个浓度，以无菌水作为空白对照，每个浓度做三个平行。取6管培养好的青枯雷尔氏菌菌液，处理前通过稀释平板涂布法计算青枯雷尔氏菌含量后，分别加入1 ml 5个浓度噬菌体液和无菌水，然后在30℃，150 r/min条件下培养12 h后，通过稀释平板涂布法计算青枯雷尔氏菌处理后含量来测定噬菌体10rs306a对青枯雷尔氏菌的裂解能力。结果表明，噬菌体10rs306a对青枯雷尔氏菌有较好的杀菌效果，且浓度越高，效果越好。
26.表5：噬菌体10rs306a对青枯雷尔氏菌的裂解能力测定2、噬菌体10rs306a的宿主谱测定培养噬菌体宿主菌10rs306a及其他青枯菌，共62株，其中包括青枯雷尔氏菌42株，青枯假单胞菌20株。在30℃，150 r/min条件下培养12 h后，通过直接点样法，取100 μl浓度为3.5
×
108cfu/ml宿主菌液在lb平板上均匀涂布，再取20 μl浓度为2.3
×
10
10
pfu/ml噬菌体液在平板上滴4点，30℃培养过夜，观察平板是否有透明噬菌斑，测定噬菌体10rs306a对
62株病菌是否有裂解能力。
27.结果如下表所示：噬菌体10rs306a能裂解62株青枯菌中的29株，其中能裂解青枯雷尔氏菌21株，青枯假单胞菌8株。且相对于其他噬菌体，噬菌体10rs306a裂解能力更强，宿主谱更广。郑小双的“副溶血弧菌广谱裂解性噬菌体的筛选及其在海产品安全控制中的应用”中对42株副溶血弧菌做了侵染实验，发现噬菌体vppyzu68只能裂解其中的5株。张志宏的“一株金黄色葡萄球菌噬菌体的裂解谱特异性和分子分类研 究”中对37株金黄色葡萄球菌和74株其他种属菌株做了侵染实验，发现噬菌体vb_sauh_sap1只能裂解10株金黄色葡萄球菌。杨吉霞的“霍乱弧菌swbc-a为靶细菌筛选宽裂解弧菌噬菌体”中对26株弧菌(副溶血弧菌、霍乱弧菌、溶藻弧菌)做了侵染实验，发现噬菌体swbc-a-3只能裂解其中的3株弧菌。由此可知，本技术的噬菌体10rs306a裂解能力强，宿主谱广。
28.表6:噬菌体10rs306a的宿主谱3、宽谱噬菌体10rs306a与噬菌谱窄的噬菌体对青枯菌的防治效果测定培养青枯雷尔氏菌rs306菌液、青枯假单胞菌p301菌液，分别取500 ml浓度为2.6
×
108cfu/ml上清液。培养只能裂解青枯雷尔氏菌rs306的噬菌体10rs301和10rs307，分别取500 ml浓度为6.5
×
10
10
pfu/ml噬菌体液。
29.在大田里取15垄番茄种植苗做为试验田。分为5个处理组，每组3个重复，每个重复20株番茄苗。处理a组为无处理的空白对照，处理b组每株番茄苗加入制备好的青枯雷尔氏菌rs306、青枯假单胞菌p301上清液各10 ml，处理c组每株番茄苗同时加入制备好的青枯雷尔氏菌rs306、青枯假单胞菌p301上清液各10 ml和10 ml 10rs301噬菌体液，处理d组每株番茄苗同时加入制备好的青枯雷尔氏菌rs306、青枯假单胞菌p301上清液各10 ml和10 ml10rs307噬菌体液，处理e组每株番茄苗同时加入制备好的青枯雷尔氏菌rs306、青枯假单胞菌p301上清液各10 ml和10 ml 实施例2中的噬菌体10rs306a制剂，每天观察番茄苗生长情况并记录各处理组番茄苗发病率。
30.宽谱噬菌体10rs306a与噬菌谱窄的噬菌体10rs301和10rs307对青枯菌的防治效果见表7，处理a组无发病番茄苗；处理b组3d时番茄苗发病26株，平均发病率为43.33%，7d后番茄苗发病58株，平均发病率高达96.67%；处理c组3d时番茄苗发病16，平均发病率率为26.67%，7d后番茄苗发病34株，发病率率为56.67%；处理d组3d时番茄苗发病19，平均发病率为31.67%，7d后番茄苗发病率35株，发病率为58.33%；处理e组3d时番茄苗发病2株，平均发
病率率为3.33%，7d后番茄苗发病率7株，发病率率仅为11.67%。通过对比，发现处理e番茄苗发病率比处理a降低了85%，比处理c降低了45%，比处理d降低了46.66%。结果表明：在实际运用中宽谱噬菌体10rs306a微生态制剂相对于噬菌谱窄的噬菌体10rs301和05a021具有明显的优势，能显著降低番茄苗的发病率，降低农作物种植中青枯菌带来的危害。
31.表7 宽谱噬菌体10rs306a与噬菌谱窄的噬菌体对青枯菌的防治效果测定
组号处理3d平均发病率率7d平均发病率率a空白对照0%0%b2种青枯菌液各100ml43.33%96.67%c2种青枯菌液各100ml和100ml10rs301噬菌体液26.67%56.67%d2种青枯菌液各100ml和100ml10rs307噬菌体液31.67%58.33%e2种青枯菌液各100ml和100ml10rs306a噬菌体液3.33%11.67%
4、噬菌体10rs306a微生态制剂对青枯雷尔氏菌的预防防治效果测定在大田里取12垄番茄种植苗做为试验田。分为4个处理组，每组3个重复，每个重复20株番茄苗。处理a组为无处理的空白对照，处理b组每株番茄苗加入制备好的青枯雷尔氏菌rs306上清液10 ml，处理c组每株番茄苗同时加入制备好的青枯雷尔氏菌rs306上清液10 ml和10 ml10rs306a噬菌体液，处理d组每株番茄苗单独加入制备好的10 ml 实施例2中的噬菌体10rs306a制剂，每天观察番茄苗生长情况并记录各处理组番茄苗发病率。
32.噬菌体10rs306a制剂对番茄苗青枯菌病害防治效果见表8，空白a组和处理d组均无发病番茄苗；处理b组3d时番茄苗发病29株，平均发病率为48.33%，7d后番茄苗发病57株，平均发病率高达95%；处理c组3d时无发病番茄苗，7d后番茄苗发病1株，发病率仅为1.7%，发病率降低了93.3%。结果表明：噬菌体10rs306a微生态制剂对番茄苗生长未有影响，且对番茄苗青枯菌病害有明显的防治效果。
33.表8：噬菌体10rs306a微生态制剂对番茄苗青枯雷尔氏菌病害防治效果
组号处理3d平均发病率率7d平均发病率率a空白对照0%0%b100ml青枯菌菌液48.33%95%c100ml青枯菌菌液和100ml噬菌体10rs306a制剂0%1.7%d100ml噬菌体10rs306a制剂0%0%
实施例4噬菌体10rs306a全基因组测定和分析1、噬菌体10rs306a的纯化取10rs306a噬菌体液2ml，8000 rpm离心10min，取上清液用0.22μm过滤膜过滤两次后放置于4℃冰箱保存。
34.2、噬菌体10rs306a基因组dna的提取使用天根生化科技（北京）有限公司的噬菌体基因组dna/rna提取试剂盒将分离纯化的噬菌体进行噬菌体基因组dna的提取，并送至美吉生物(上海)股份有限公司进行测序。
35.3、噬菌体10rs306a全基因组序列分析经pacbio平台的第二代基因组测序，所筛选的噬菌体10rs306a全基因组序列全长为39742bp，为环状双链dna。基因组序列在ncbi官网进行blast比对，结果如图3所示，与最接近的青枯雷尔氏菌噬菌体（genebank登录号：nc047751.1）基因组序列比对覆盖率为87%，同源性为86.46%；其次，与青枯雷尔氏菌噬菌体（genebank登录号：ab597179.1）基因组序列
的比对覆盖率为70%，同源性为78.55%。由此可见，所筛选的噬菌体是一种新的噬菌体。噬菌体10rs306a已于2020年12月21日保藏于武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc m 2020944。
36.通过dnaman 7软件找出噬菌体05a034基因组与两个同源性最高的噬菌体基因组序列的差异性片段，获得特异性基因a1（seq id no.1）、a2（seq id no.2）；再通过primer premier6软件，设计特异性pcr扩增引物，并送至博尚生物技术（上海）有限公司合成引物，结果如图3所示。
37.a1f:5
’‑
cggtccttccagtgtaga-3’；a1r: 5
’‑
actcctcgtatcgcttga-3’；a2f: 5
’‑
gagatgccaatgtcaacag-3’；a2r: 5
’‑
aacgagccagcgaatatc-3’；综上，根据本发明的实施例，本发明从福建省厦门地区的番茄种植基地分离筛选出噬菌体10rs306a，其对青枯雷尔氏菌具有很高的杀菌活性，同时对其他青枯菌也有较广的噬菌谱，其能裂解青枯雷尔氏菌21株，青枯假单胞菌8株，能更有效的解决农作物种植中出现的细菌病害感染问题。
38.在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、
ꢀ“
示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不应理解为必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例进行接合和组合。
39.尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。