1.本发明属于微生物技术领域，涉及噬菌体的培养基及方法。


背景技术：

2.随着抗生素的广泛应用，耐药细菌菌株（包括多耐药菌株）大量出现与流行，抗生素治疗效果受到严峻的挑战。近年来出现一些“超级细菌”，它们几乎对所有的抗生素都不敏感，导致人类对此类细菌的感染几乎无药可用，非常迫切需要新的抗感染武器来替代抗生素。在此背景下，人类再次把目光投向了噬菌体治疗。科学界对噬菌体治疗的研究进入了一个新的阶段。各个国家的科学家开始寻找各种病原菌的噬菌体，大量的噬菌体被发现。随着测序技术的不断更新换代，噬菌体更容易被识别，新的噬菌体基因组序列不断增加，新的噬菌体家族不断壮大。
3.噬菌体是细菌、真菌、放线菌等微生物的天敌，广泛存在于自然界中，数量巨大，种类繁多，是目前理想的天然抗菌剂和抗生素替代品。
4.目前，关于噬菌体的基础和应用研究范围很广，涉及各种类型的体外感染控制模型和多种感染性疾病。不仅针对人类疾病的预防与治疗，而且涉及到食品及饲料中病原细菌的清除、细菌生物膜的防控。总体研究结果显示，只要所使用的噬菌体对于感染菌株是敏感的，其治疗的效果一般都是肯定的。近年来噬菌体治疗研究开始得到各个国家政策的支持和鼓励，一系列产品已经进入各国市场随着噬菌体治疗的优势被认识，噬菌体治疗被人们广泛地认同，越来越多的研究也集中到了噬菌体的产品开发中，噬菌体的产业化无疑是噬菌体治疗的助推器。随着国内外不断的有噬菌体产品陆续上市，越来越多的噬菌体制成产品应用于食品、药品等行业。
5.噬菌体产品在食品药品行业中发挥着越来越重要的作用，随着噬菌体产业化的推进，噬菌体的需求量也越来越高，噬菌体增殖是噬菌体产业化的关键。摸索高效的噬菌体发酵工艺也是降低噬菌体产品成本的重要措施。目前对噬菌体的研究主要集中在生物学特性、基因组学及蛋白质组学方面，对噬菌体增殖生产发酵参数和规模化生产的制备条件等研究较少。


技术实现要素：

6.本发明的目的是提供一种噬菌体培养基，通过对培养基成分的优化，获得更高效价的噬菌体培养物，利于噬菌体的工业化应用。
7.本发明采用的技术方案是：一种提高噬菌体效价的培养基，每1000ml液体培养基中包含：蛋白胨5.0g、牛肉膏3.0g、酵母浸粉2.0g、氯化钠5.0g、低聚糖1.5g
±
0.12g、柠檬酸铁0.18g
±
0.015g、硫酸镁0.39g
±
0.02g、氯化钙0.55g
±
0.05g、葡萄糖酸锌2.9g
±
0.23g、山梨醇0.54g
±
0.03g、磷酸氢二钠0.018g
±
0.002g、磷酸二氢钾0.0036g
±
0.0004g。
8.所述液体培养基以水为溶剂，ph为7.5。
9.本发明还提供一种提高噬菌体效价的方法，包括：
将噬菌体与其对应的宿主菌接种于上述培养基中，37℃，摇床培养。
10.本发明通过向普通培养基发酵液中添加不同浓度的低聚糖、山梨醇、氯化钙（cacl2）、硫酸镁（mgso4）、葡萄糖酸锌（c
12h22o14
zn）、柠檬酸铁等，优化噬菌体培养条件。ca
2+
、mg
2+
等二价阳离子不仅具有稳定噬菌体dna螺旋结构、提高噬菌体对宿主菌吸附率的作用，增强噬菌体裂解酶、受体结合蛋白活性，提高噬菌体对宿主菌的裂解力。低聚糖、山梨醇作用：提高微生物对碳源利用率，促进宿主菌与噬菌体代谢。山梨醇还可以络合金属阳离子，提高噬菌体对阳离子的利用率。
11.本发明提供的提高噬菌体效价的培养基，不仅能够提高噬菌体的效价，并且利用该培养基发酵生产的噬菌体，具有常温或低温易保存，保存期长，效价降低慢等优点，极大降低了噬菌体的保存和运输成本，有利于噬菌体的工业化生产和应用。
具体实施方式
12.为了便于理解本发明，下面结合具体实施例，对本发明进行更详细的说明。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本说明书所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。
13.本发明所用宿主菌为大肠杆菌标准株ec-atcc 25922、肠炎沙门氏菌标准株sa-atcc 14028、肺炎克雷伯菌kp-atcc 10031。标准菌株购自广东省微生物菌种保藏中心。分别对应的噬菌体为rdp-ec-20123（保藏编号：cgmcc no.22486，专利申请号：202110894071.0）、rdp-sa-20032（保藏编号：cgmcc no.21994，专利申请号：202110540869.5）、rdp-kp-20004（保藏编号：cgmcc no.21407，专利申请号：202011599621.8）。以上三株噬菌体为瑞科盟（青岛）生物工程有限公司赠与。
14.实施例1 本实施例提供的一种提高噬菌体效价的培养基，其中每1000ml水溶液中，含有蛋白胨5.0g、牛肉膏3.0g、酵母浸粉2.0g、氯化钠5.0g、低聚糖1.5g、柠檬酸铁0.18g、硫酸镁0.39g、氯化钙0.55g、葡萄糖酸锌2.9g、山梨醇0.54g、磷酸氢二钠0.018g、磷酸二氢钾0.0036g。
15.将上述组分溶于水中搅拌均匀，调节ph7.5，高压灭菌后，即制备出本发明的培养基。该培养基可以是液体培养基，或添加琼脂粉，制备成固体平板培养基。
16.为了研究本发明提供的培养基对噬菌体及其宿主生长的影响，本发明提供了实施例2-5所述的验证、对比实验。
17.实施例2 本发明提供的培养基对宿主生长的影响分别称取蛋白胨5.0g、牛肉膏3.0g、酵母浸粉2.0g、氯化钠5.0g、低聚糖1.5g、柠檬酸铁0.18g、硫酸镁0.39g、氯化钙0.55g、葡萄糖酸锌2.9g、山梨醇0.54g、磷酸氢二钠0.018g、磷酸二氢钾0.0036g，溶解于1l水中，调节ph7.5，除菌制备成液体培养基。同时另外制作1l液体培养基，加入琼脂粉15g，高压蒸汽灭菌20min，降温至50℃后，倾注平板，制备本发明培养基固体板备用。
18.分别将1株大肠杆菌ec-atcc 25922、1株沙门氏菌sa-atcc 14028、1株克雷伯菌kp-atcc 10031接种于100ml上述培养基，每组同时接种于100ml市面常见普通lb培养基，于37℃，180r/min条件下培养12h。
19.用不同的固体培养基分别对不同发酵液培养的病原菌进行计数。结果见表1。
20.表1不同培养基对不同发酵液培养的病原菌的计数由以上结果可以看出，本发明液体培养基与lb液体培养基培养的病原菌菌落数差异不大，同时以本发明固体培养基与lb固体培养基对同一份发酵液进行菌落计数，结果差异也不大，说明本发明培养基对宿主菌的生长繁殖既没有促进作用也没有抑制作用。
21.实施例3.本发明液体、固体培养基对噬菌体效价的影响实验分组进行，将1株大肠杆菌噬菌体、1株沙门氏菌噬菌体和1株克雷伯菌噬菌体rdp-ec-20123、rdp-sa-20032、rdp-kp-20004。与其对应的宿主ec-atcc25922、sa-atcc14028、kp-atcc10031接种于100ml本发明提供的液体培养基中，每组同时接种于市面常见普通lb培养基，于37℃，180r/min条件下培养8h。
22.每组分别以不同固体培养基做下层，半固体培养基做上层，采用双层平板法测定噬菌体效价。结果见表2。
23.表2不同培养基对噬菌体效价的影响由以上结果可以看出，本发明的液体培养基发酵液的噬菌体效价显著高于lb培养基发酵液，说明本发明培养基做为发酵液可以显著提升噬菌体效价。
24.实施例4本发明的培养基对扩大培养发酵的影响制备本发明培养基300l于500l发酵罐内，蛋白胨1500.0g、牛肉膏900.0g、酵母浸粉600.0g、氯化钠1500.0g、低聚糖450.0g、柠檬酸铁54.0g、硫酸镁117.0g、氯化钙165.0g、葡萄糖酸锌870.g、山梨醇162.0g、磷酸氢二钠5.5g、磷酸二氢钾1.08g，水30l，调节ph7.5，120℃高压灭菌。
25.噬菌体rdp-ec-20123、rdp-sa-20032、rdp-kp-20004与其对应的宿主ec-atcc
25922、sa-atcc14028、kp-atcc10031按照最佳感染复数0.1分别接种500l本发明培养基发酵罐和lb培养基发酵罐。
26.表3不同培养基对噬菌体扩大培养发酵的影响由以上结果可以看出，本发明培养基与lb培养基进行比较，本发明培养基噬菌体效价显著高于lb培养基，说明本发明培养基做发酵液扩大培养时可以显著提升噬菌体效价，说明本发明培养基适用于噬菌体的扩大培养。
27.实施例54℃条件下长期保存对本发明培养基培养的噬菌体效价的影响按照上述培养基制备方法，将噬菌体rdp-ec-20123、rdp-sa-20032、rdp-kp-20004与其对应的宿主ec-atcc25922、sa-atcc14028、kp-atcc10031按照一定比例接种于100ml上述培养基，每组同时接种于市面常见普通lb培养基，于37℃，180r/min条件下培养8h。
28.双平板法测定噬菌体发酵液效价。将噬菌体发酵液离心过滤除菌后保存于4℃冰箱。于60d后再次测定噬菌体效价，验证不同培养基发酵液对噬菌体保存效价影响。结果见表4。
29.表44℃条件下保存60天后噬菌体发酵液的效价对比由以上结果可以看出，在4℃条件下保存60天后，由本发明培养基制备的噬菌体发酵液与普通lb培养基制备的噬菌体发酵液相比，效价更高；经过60天的保存，lb培养基制备的噬菌体效价降低的更快。这说明本发明培养基制备的噬菌体更适用于噬菌体的长期保存。
30.实施例6常温环境下长期保存对本发明培养基培养的噬菌体效价的影响按照上述培养基制备方法，将噬菌体rdp-ec-20123、rdp-sa-20032、rdp-kp-20004与其对应的宿主ec-atcc25922、sa-atcc14028、kp-atcc10031按照一定比例接种于100ml本发明的培养基，每组同时接种于市面常见普通lb培养基，于37℃，180r/min条件下培养8h。
31.双平板法测定噬菌体发酵液效价。将噬菌体发酵液离心过滤除菌后保存于室温阴凉干燥处。于60d后再次测定噬菌体效价，验证不同培养基发酵液对噬菌体保存效价影响。结果见表5。
32.表5 室温条件下保存60天后噬菌体发酵液的效价对比由以上结果可以看出，由本发明培养基制备的噬菌体发酵液在常温条件下保存60天后效价更高，lb培养基制备的噬菌体发酵液效价降低的更快。这说明本发明培养基制备的噬菌体更适用于噬菌体的长期保存。并且，对保存条件要求不高，低温或常规均能长期保存。
33.本本发明通过在培养基中添加不同的介质，以提高噬菌体的效价，对噬菌体工业化生产具有重要意义。