1.本发明涉及一种韭菜病害防治复合菌及其制备方法，属于农作物防病治病技术领域。


背景技术：

2.韭菜（a. tuberosumrottl. ex spreng.），属百合科多年生草本植物，具特殊强烈气味，在我国南北各地均有栽培，是我国生产范围最广泛的香辛叶菜类蔬菜之一，韭菜营养丰富，含多种维生素及钙、磷、铁等无机盐，粗纤维、蛋白质含量 也较多。韭菜气味芳香，不仅适于炒食、做馅和调味，而且具有很好的医疗作用，深受人们的喜爱。
3.韭菜的病害主要有韭菜灰霉病、韭菜白菌病、韭菜白斑病等，现有技术主要防治方法为化学药物防治，化学药物带来的环境污染、抗药性等问题日渐突出，与化学防治方法相比，生物防治具有安全、有效、持久等特点，可以通过生物防治来解决韭菜病害问题。
4.cn111990402a公开了脂肽或脂肽提取物的新的应用，通过枯草芽孢杆菌和其提取物防治韭菜灰霉病，是通过单一菌种来达到防治效果，而且防治的病害类型仅为韭菜灰霉病，防治效果单一。
5.目前市面上还没有防治韭菜多种病害的复合菌，可以通过制备复合菌，来达到综合防治效果，液体复合菌较固体复合菌使用更加方便，但是防治效果不稳定，并且液体复合菌的存放时间短，导致长时间存放后有效微生物含量下降，防治效果下降。
6.cn1331534c公开了一种防治水产养殖动物疾病的复合菌苗，通过添加一定量防腐剂苯甲醇延长存放日期，限制杂菌繁殖，但同时会造成有效菌活性下降。
7.综上所述，现有复合菌存在以下缺点：（1）现有技术的液体复合菌防治效果不稳定，同时间多批次使用批与批之间效果差异大；（2）使用防腐剂来保证复合菌的存放日期，限制杂菌繁殖，但同时会造成有效菌防治效果的下降。


技术实现要素：

8.本发明所要解决的技术问题是克服现有技术存在的缺陷，通过添加枝接的羧甲基纤维素钠，链状聚乙二醇制成复合菌，实现以下发明目的：（1）液体复合菌防治效果稳定，同时间多批次使用批与批之间效果差异小；（2）不使用防腐剂来保证复合菌的存放日期，限制杂菌繁殖同时，不会造成有效菌防治效果的下降。
9.为解决上述技术问题，本发明采取以下技术方案：一种韭菜病害防治复合菌，所述复合菌按质量份计，包括以下组分：淡紫拟青霉干粉6.5-7.5份、地衣芽孢杆菌干粉3.5-4.5份、双乙烯酮枝接羧甲基纤维素钠1.8-2.2份、链状聚乙二醇0.8-1.2份、硼酸钠缓冲液1.8-2.2份、海藻酸0.8-1.2份、海藻酸钠0.8-1.2份、
蔗糖0.8-1.2份、水43-47份。
10.所述淡紫拟青霉干粉，将淡紫拟青霉用常规方法培养并制成干粉，活菌数量为4.1-4.3*10
11 cfu /g；所述地衣芽孢杆菌干粉，将地衣芽孢杆菌用常规方法培养并制成干粉，活菌数量为2.4-2.6*10
11 cfu /g。
11.所述淡紫拟青霉（paecilomyces lilacinus），菌种保藏号为accc 30636，由市场购买所得；所述地衣芽孢杆菌(bacillus licheniformis)，菌种保藏号为accc 19747，由市场购买所得。
12.以下是对上述技术方案的进一步改进：所述制备方法包括制备双乙烯酮枝接羧甲基纤维素钠、制备链状聚乙二醇、制备复合菌。
13.所述制备双乙烯酮枝接羧甲基纤维素钠，将羧甲基纤维素钠与去离子水混合，加热至70-75℃，保温状态下于900-1200r/min下搅拌3-4h,至羧甲基纤维素钠完全溶解得到羧甲基纤维素钠溶液，完全溶解后冷却至室温，用质量浓度4-6%的盐酸溶液调节ph至7.1-7.3，然后将羧甲基纤维素钠溶液放入冷凝回流器，在50-70w功率下超声25-35min，期间通入氮气保护，超声下保持温度48-52℃，然后加入高锰酸钾溶液和硫酸溶液，4-6min内缓慢加入，加入完成后在600-1000r/min下搅拌15-30min，搅拌完成后加入单体双乙烯酮，在250-350r/min下反应5-7h，期间保持温度48-52℃，反应完成后冷却至室温，用乙醇洗涤，抽滤，最后用去离子水洗涤，真空干燥至恒重，得到双乙烯酮枝接羧甲基纤维素钠。
14.所述羧甲基纤维素钠分子量为80000-90000；所述羧甲基纤维素钠溶液中羧甲基纤维素钠与水的质量比为1:75-85；所述高锰酸钾溶液浓度为0.08-0.12mol/l；所述硫酸溶液质量浓度为8-12%；所述高锰酸钾溶液、硫酸溶液、甲基纤维素钠溶液质量比为4-6:1-2：1850-2150；所述单体双乙烯酮与甲基纤维素钠溶液的质量比为1:480-520。
15.所述制备链状聚乙二醇，将四甲基哌啶氮氧化物、溴化钠与去离子水混合，在500-700r/min下搅拌至完全溶解，溶解完成后加入聚乙二醇、次氯酸钠溶液在250-350r/min下反应20-30min，再加入乙醇溶液，用盐酸溶液调节至ph至1.6-1.8，然后用二氯甲烷萃取，重复三次，取三次萃取后下层清液混合，溶解于热乙醇中，置于-5~15℃环境下保持14-20h，然后取出，于38-42℃真空干燥，得到链状聚乙二醇。
16.8. 根据权利要求7所述的一种韭菜病害防治复合菌的其制备方法，其特征在于：所述四甲基哌啶氮氧化物、溴化钠、去离子水的质量比为1:1:480-520；所述次氯酸钠溶液有效氯含量为10.2%；所述加入聚乙二醇、次氯酸钠溶液与去离子水的质量比为1:1:4.5-5.5；所述乙醇溶液质量浓度为99.5%；所述加入乙醇溶液与去离子水的质量比为1:4.5-5.5。
17.所述制备复合菌，所述复合菌制备方法，将淡紫拟青霉干粉、地衣芽孢杆菌干粉、双乙烯酮枝接羧甲基纤维素钠、链状聚乙二醇、硼酸钠缓冲液、海藻酸、海藻酸钠、蔗糖、水
混合得到复合菌。
18.所述复合菌有效微生物含量为2.9-3.1*10
10
cfu/ml。
19.与现有技术相比，本发明取得以下有益效果：本发明制备的复合菌防治效果稳定，同时间多批次使用批与批之间效果差异小，韭菜育苗，分批移栽于相同土壤环境的不同地块，共五亩，每亩为一批，分为a、b、c、d、e五批，韭菜移栽后第七天，将复合菌稀释至300倍喷施于叶片，每亩使用复合菌300倍液5kg，每隔十天喷施一次，总共喷施4次，其余正常田间施肥打理，a批韭菜发病率为：韭菜灰霉病1.89-1.99%、韭菜白菌病2.31-2.35%、韭菜白斑病2.17-2.21%，b批韭菜发病率为：韭菜灰霉病1.91-1.85%、韭菜白菌病2.22-2.30%、韭菜白斑病2.23-2.28%，c批韭菜发病率为：韭菜灰霉病1.81-1.89%、韭菜白菌病2.29-2.39%、韭菜白斑病2.25-2.33%，d批韭菜发病率为：韭菜灰霉病1.95-2.02%、韭菜白菌病2.22-2.31%、韭菜白斑病2.17-2.20%，e批韭菜发病率为：韭菜灰霉病2.06-2.11%、韭菜白菌病2.25-2.35%、韭菜白斑病2.27-2.35%；本发明制备的复合菌长时间存放，依然可以保持防治效果，常温存放6个月后，有效微生物含量为2.2-2.3*10
10
cfu/ml，有效微生物含量为原来的89.8-90.2% ，施用于韭菜，韭菜发病率为:韭菜灰霉病2.15-2.22%、韭菜白菌病2.41-2.52%、韭菜白斑病发病率为2.33-2.44%，常温存放12个月后，有效微生物含量为1.8-1.9*10
10
cfu/ml，有效微生物含量为原来的73.6-74.2%，施用于韭菜，韭菜发病率为:韭菜灰霉病3.28-3.41%、韭菜白菌病3.56-3.67%、韭菜白斑病3.37-3.42%。
具体实施方式
20.实施例1（1）制备双乙烯酮枝接羧甲基纤维素钠将羧甲基纤维素钠与去离子水混合，加热至72℃，保温状态下于1000r/min下搅拌3.5h,至羧甲基纤维素钠完全溶解得到羧甲基纤维素钠溶液，完全溶解后冷却至室温，用质量浓度5%的盐酸溶液调节ph至7.2，然后将羧甲基纤维素钠溶液放入冷凝回流器，在60w功率下超声30min，期间通入氮气保护，超声下保持温度50℃，然后加入高锰酸钾溶液和硫酸溶液，5min内缓慢加入，加入完成后在800r/min下搅拌20min，搅拌完成后加入单体双乙烯酮，在300r/min下反应6h，期间保持温度50℃，反应完成后冷却至室温，用乙醇洗涤，抽滤，最后用去离子水洗涤，真空干燥至恒重，得到双乙烯酮枝接羧甲基纤维素钠；所述羧甲基纤维素钠分子量为85000；所述羧甲基纤维素钠溶液中羧甲基纤维素钠与水的质量比为1:80；所述高锰酸钾溶液浓度为0.1mol/l；所述硫酸溶液质量浓度为10%；所述高锰酸钾溶液、硫酸溶液、甲基纤维素钠溶液质量比为5:1：2000；所述单体双乙烯酮与甲基纤维素钠溶液的质量比为1:500。
21.（2）制备链状聚乙二醇将四甲基哌啶氮氧化物、溴化钠与去离子水混合，在600r/min下搅拌至完全溶解，溶解完成后加入聚乙二醇、次氯酸钠溶液在300r/min下反应25min，再加入乙醇溶液停止氧化，用盐酸溶液调节至ph至1.7，然后用二氯甲烷萃取，重复三次，取三次萃取后下层清液混
合，溶解于热乙醇中，置于-10℃环境下保持16h，然后取出，于40℃真空干燥，得到链状聚乙二醇；所述四甲基哌啶氮氧化物、溴化钠、去离子水的质量比为1:1:500；所述次氯酸钠溶液有效氯含量为10.2%；所述加入聚乙二醇、次氯酸钠溶液与去离子水的质量比为1:1:5；所述乙醇溶液质量浓度为99.5%；所述加入乙醇溶液与去离子水的质量比为1:5。
22.（3）制备复合菌复合菌按质量份计，包括以下组分：淡紫拟青霉干粉7份、地衣芽孢杆菌干粉4份、双乙烯酮枝接羧甲基纤维素钠2份、链状聚乙二醇1份、硼酸钠缓冲液2份、海藻酸1份、海藻酸钠1份、蔗糖1份、水45份；所述复合菌制备方法，将淡紫拟青霉干粉、地衣芽孢杆菌干粉、双乙烯酮枝接羧甲基纤维素钠、链状聚乙二醇、硼酸钠缓冲液、海藻酸、海藻酸钠、蔗糖、水混合得到复合菌；所述淡紫拟青霉干粉，将淡紫拟青霉用常规方法培养并制成干粉，活菌数量为4.2*10
11 cfu /g；所述地衣芽孢杆菌干粉，将地衣芽孢杆菌用常规方法培养并制成干粉，活菌数量为2.5*10
11 cfu /g；所述淡紫拟青霉（paecilomyces lilacinus），菌种保藏号为accc 30636，由市场购买所得；所述地衣芽孢杆菌(bacillus licheniformis)，菌种保藏号为accc 19747，由市场购买所得；所述复合菌有效微生物含量为3.1*10
10
cfu/ml；实施例1制备的复合菌防治效果稳定，同时间多批次使用批与批之间效果差异小，韭菜育苗，分批移栽于相同土壤环境的不同地块，共五亩，每亩为一批，分为a、b、c、d、e五批，韭菜移栽后第七天，将复合菌稀释至300倍喷施于叶片，每亩使用复合菌300倍液5kg，每隔十天喷施一次，总共喷施4次，其余正常田间施肥打理，a批韭菜发病率为：韭菜灰霉病1.89%、韭菜白菌病2.35%、韭菜白斑病2.17%，b批韭菜发病率为：韭菜灰霉病1.92%、韭菜白菌病2.29%、韭菜白斑病2.23%，c批韭菜发病率为：韭菜灰霉病1.81%、韭菜白菌病2.39%、韭菜白斑病2.25%，d批韭菜发病率为：韭菜灰霉病1.95%、韭菜白菌病2.31%、韭菜白斑病2.19%，e批韭菜发病率为：韭菜灰霉病2.06%、韭菜白菌病2.25%、韭菜白斑病2.31%；实施例1制备的复合菌长时间存放，依然可以保持防治效果，常温存放6个月后，有效微生物含量为2.3*10*10
10
cfu/ml，有效微生物含量为原来的90.2% ，施用于韭菜，韭菜发病率为:韭菜灰霉病2.15%、韭菜白菌病2.41%、韭菜白斑病发病率为2.33%，常温存放12个月后，有效微生物含量为1.9*10
10
cfu/ml，有效微生物含量为原来的74.2%，施用于韭菜，韭菜发病率为:韭菜灰霉病3.28%、韭菜白菌病3.56%、韭菜白斑病3.37%。
23.实施例2（1）制备双乙烯酮枝接羧甲基纤维素钠将羧甲基纤维素钠与去离子水混合，加热至70℃，保温状态下于900r/min下搅拌4h,至羧甲基纤维素钠完全溶解得到羧甲基纤维素钠溶液，完全溶解后冷却至室温，用质量
浓度5%的盐酸溶液调节ph至7.1，然后将羧甲基纤维素钠溶液放入冷凝回流器，在50w功率下超声35min，期间通入氮气保护，超声下保持温度48℃，然后加入高锰酸钾溶液和硫酸溶液，4min内缓慢加入，加入完成后在600r/min下搅拌30min，搅拌完成后加入单体双乙烯酮，在250r/min下反应7h，期间保持温度48℃，反应完成后冷却至室温，用乙醇洗涤，抽滤，最后用去离子水洗涤，真空干燥至恒重，得到双乙烯酮枝接羧甲基纤维素钠；所述羧甲基纤维素钠分子量为80000；所述羧甲基纤维素钠溶液中羧甲基纤维素钠与水的质量比为1:75；所述高锰酸钾溶液浓度为0.08mol/l；所述硫酸溶液质量浓度为8%；所述高锰酸钾溶液、硫酸溶液、甲基纤维素钠溶液质量比为4:1：1850；所述单体双乙烯酮与甲基纤维素钠溶液的质量比为1:480。
24.（2）制备链状聚乙二醇将四甲基哌啶氮氧化物、溴化钠与去离子水混合，在500r/min下搅拌至完全溶解，溶解完成后加入聚乙二醇、次氯酸钠溶液在250r/min下反应30min，再加入乙醇溶液停止氧化，用盐酸溶液调节至ph至1.8，然后用二氯甲烷萃取，重复三次，取三次萃取后下层清液混合，溶解于热乙醇中，置于-15℃环境下保持14h，然后取出，于38℃真空干燥，得到链状聚乙二醇；所述四甲基哌啶氮氧化物、溴化钠、去离子水的质量比为1:1:480；所述次氯酸钠溶液有效氯含量为10.2%；所述加入聚乙二醇、次氯酸钠溶液与去离子水的质量比为1:1:4.5；所述乙醇溶液质量浓度为99.5%；所述加入乙醇溶液与去离子水的质量比为1:4.5。
25.（3）制备复合菌复合菌按质量份计，包括以下组分：淡紫拟青霉干粉6.5份、地衣芽孢杆菌干粉3.5份、双乙烯酮枝接羧甲基纤维素钠1.8份、链状聚乙二醇0.8份、硼酸钠缓冲液1.8份、海藻酸0.8份、海藻酸钠0.8份、蔗糖0.8份、水43份；所述复合菌制备方法，将淡紫拟青霉干粉、地衣芽孢杆菌干粉、双乙烯酮枝接羧甲基纤维素钠、链状聚乙二醇、硼酸钠缓冲液、海藻酸、海藻酸钠、蔗糖、水混合得到复合菌；所述淡紫拟青霉干粉，将淡紫拟青霉用常规方法培养并制成干粉，活菌数量为4.3*10
11 cfu /g；所述地衣芽孢杆菌干粉，将地衣芽孢杆菌用常规方法培养并制成干粉，活菌数量为2.6*10
11 cfu /g；所述淡紫拟青霉（paecilomyces lilacinus），菌种保藏号为accc 30636，由市场购买所得；所述地衣芽孢杆菌(bacillus licheniformis)，菌种保藏号为accc 19747，由市场购买所得；所述复合菌有效微生物含量为2.9*10
10
cfu/ml；实施例2制备的复合菌防治效果稳定，同时间多批次使用批与批之间效果差异小，韭菜育苗，分批移栽于相同土壤环境的不同地块，共五亩，每亩为一批，分为a、b、c、d、e五
批，韭菜移栽后第七天，将复合菌稀释至300倍喷施于叶片，每亩使用复合菌300倍液5kg，每隔十天喷施一次，总共喷施4次，其余正常田间施肥打理，a批韭菜发病率为：韭菜灰霉病1.92%、韭菜白菌病2.33%、韭菜白斑病2.21%，b批韭菜发病率为：韭菜灰霉病1.91%、韭菜白菌病2.22%、韭菜白斑病2.28%，c批韭菜发病率为：韭菜灰霉病1.89%、韭菜白菌病2.35%、韭菜白斑病2.33%，d批韭菜发病率为：韭菜灰霉病1.97%、韭菜白菌病2.38%、韭菜白斑病2.20%，e批韭菜发病率为：韭菜灰霉病2.08%、韭菜白菌病2.27%、韭菜白斑病2.27%；实施例2制备的复合菌长时间存放，依然可以保持防治效果，常温存放6个月后，有效微生物含量为2.2*10*10
10
cfu/ml，有效微生物含量为原来的89.8% ，施用于韭菜，韭菜发病率为:韭菜灰霉病2.22%、韭菜白菌病2.49%、韭菜白斑病发病率为2.41%，常温存放12个月后，有效微生物含量为1.8*10
10
cfu/ml，有效微生物含量为原来的73.7%，施用于韭菜，韭菜发病率为:韭菜灰霉病3.35%、韭菜白菌病3.67%、韭菜白斑病3.42%。
26.实施例3（1）制备双乙烯酮枝接羧甲基纤维素钠将羧甲基纤维素钠与去离子水混合，加热至75℃，保温状态下于1200r/min下搅拌3h,至羧甲基纤维素钠完全溶解得到羧甲基纤维素钠溶液，完全溶解后冷却至室温，用质量浓度5%的盐酸溶液调节ph至7.3，然后将羧甲基纤维素钠溶液放入冷凝回流器，在70w功率下超声25min，期间通入氮气保护，超声下保持温度52℃，然后加入高锰酸钾溶液和硫酸溶液，6min内缓慢加入，加入完成后在1000r/min下搅拌15min，搅拌完成后加入单体双乙烯酮，在350r/min下反应5h，期间保持温度52℃，反应完成后冷却至室温，用乙醇洗涤，抽滤，最后用去离子水洗涤，真空干燥至恒重，得到双乙烯酮枝接羧甲基纤维素钠；所述羧甲基纤维素钠分子量为90000；所述羧甲基纤维素钠溶液中羧甲基纤维素钠与水的质量比为1:85；所述高锰酸钾溶液浓度为0.12mol/l；所述硫酸溶液质量浓度为12%；所述高锰酸钾溶液、硫酸溶液、甲基纤维素钠溶液质量比为6:2：2150；所述单体双乙烯酮与甲基纤维素钠溶液的质量比为1:520。
27.（2）制备链状聚乙二醇将四甲基哌啶氮氧化物、溴化钠与去离子水混合，在700r/min下搅拌至完全溶解，溶解完成后加入聚乙二醇、次氯酸钠溶液在350r/min下反应20min，再加入乙醇溶液停止氧化，用盐酸溶液调节至ph至1.6，然后用二氯甲烷萃取，重复三次，取三次萃取后下层清液混合，溶解于热乙醇中，置于-5℃环境下保持20h，然后取出，于42℃真空干燥，得到链状聚乙二醇；所述四甲基哌啶氮氧化物、溴化钠、去离子水的质量比为1:1:520；所述次氯酸钠溶液有效氯含量为10.2%；所述加入聚乙二醇、次氯酸钠溶液与去离子水的质量比为1:1:5.5；所述乙醇溶液质量浓度为99.5%；所述加入乙醇溶液与去离子水的质量比为1:5.5。
28.（3）制备复合菌复合菌按质量份计，包括以下组分：淡紫拟青霉干粉7.5份、地衣芽孢杆菌干粉4.5
份、双乙烯酮枝接羧甲基纤维素钠2.2份、链状聚乙二醇1.2份、硼酸钠缓冲液2.2份、海藻酸1.2份、海藻酸钠1.2份、蔗糖1.2份、水47份；所述复合菌制备方法，将淡紫拟青霉干粉、地衣芽孢杆菌干粉、双乙烯酮枝接羧甲基纤维素钠、链状聚乙二醇、硼酸钠缓冲液、海藻酸、海藻酸钠、蔗糖、水混合得到复合菌；所述淡紫拟青霉干粉，将淡紫拟青霉用常规方法培养并制成干粉，活菌数量为4.1*10
11 cfu /g；所述地衣芽孢杆菌干粉，将地衣芽孢杆菌用常规方法培养并制成干粉，活菌数量为2.4*10
11 cfu /g；所述淡紫拟青霉（paecilomyces lilacinus），菌种保藏号为accc 30636，由市场购买所得；所述地衣芽孢杆菌(bacillus licheniformis)，菌种保藏号为accc 19747，由市场购买所得；所述复合菌有效微生物含量为3.0*10
10
cfu/ml；实施例3制备的复合菌防治效果稳定，同时间多批次使用批与批之间效果差异小，韭菜育苗，分批移栽于相同土壤环境的不同地块，共五亩，每亩为一批，分为a、b、c、d、e五批，韭菜移栽后第七天，将复合菌稀释至300倍喷施于叶片，每亩使用复合菌300倍液5kg，每隔十天喷施一次，总共喷施4次，其余正常田间施肥打理，a批韭菜发病率为：韭菜灰霉病1.99%、韭菜白菌病2.31%、韭菜白斑病2.19%，b批韭菜发病率为：韭菜灰霉病1.95%、韭菜白菌病2.30%、韭菜白斑病2.25%，c批韭菜发病率为：韭菜灰霉病1.87%、韭菜白菌病2.29%、韭菜白斑病2.29%，d批韭菜发病率为：韭菜灰霉病2.02%、韭菜白菌病2.22%、韭菜白斑病2.17%，e批韭菜发病率为：韭菜灰霉病2.11%、韭菜白菌病2.35%、韭菜白斑病2.35%；实施例3制备的复合菌长时间存放，依然可以保持防治效果，常温存放6个月后，有效微生物含量为2.3*10*10
10
cfu/ml，有效微生物含量为原来的90.1% ，施用于韭菜，韭菜发病率为:韭菜灰霉病2.19%、韭菜白菌病2.52%、韭菜白斑病发病率为2.44%，常温存放12个月后，有效微生物含量为1.9*10
10
cfu/ml，有效微生物含量为原来的73.6%，施用于韭菜，韭菜发病率为:韭菜灰霉病3.41%、韭菜白菌病3.62%、韭菜白斑病3.41%。