1.本发明涉及生物化工技术领域，具体为一种在非水相介质中酶催化合成富马酸海藻糖酯的方法。
背景技术：
2.海藻糖被称为生命之糖，是天然存在的非还原性二糖，能在高温、高寒、高渗透压及干燥失水等恶劣环境条件下稳定细胞膜和蛋白质的结构，有效地保护细胞膜和蛋白质分子不变性失活，从而维持生命体的生命过程和生物特征。在我国，海藻糖已经被批准为普通食品并被列为医药辅料使用。海藻糖脂肪酸酯是海藻糖与脂肪酸缩合而成的一类可食用的具有特殊功能的表面活性剂，因良好的乳化性、增稠性和膨化性而被广泛应用于食品业、洗涤业、化妆品业和生物医药行业。富马酸海藻糖酯，在保留海藻糖的结构功能性的同时，在结构上保留了富马酸的α、β-不饱和羰基结构，其结构是具有相距约 0.25nm电子容纳中心和电子供给中心组成的电子中继系统,是防霉防腐剂具有强抗菌活性的反应活性中心的必备条件。因此，富马酸海藻糖酯是有前途的抗菌剂、防腐剂产品。
3.目前已有富马酸海藻糖甲酯的研究报道，张庆等人采用有机催化的方法合成了富马酸海藻糖甲酯并研究了抑菌活性(张庆,滕俊江,周如金,等,富马酸海藻糖甲酯的合成及抑菌活性研究[j],湖北大学学报(自然科学版),2009, 31(1),68-70)。该化学合成方法将富马酸二甲酯进行单酰氯化处理获取富马酸单甲酯单酰氯，然后与海藻糖催化反应生成富马酸海藻糖单酯。该方法步骤复杂，采用有毒的有机溶剂进行催化反应，同时存在反应位点无法选择，最终产物复杂的问题。因此，利用酶的高效催化性、高选择性和特异性，开发酶催化合成工艺替代化学合成方法，具有重要的应用前景和经济价值。
[0004]
发明专利zl201010222645.1，发明名称：一种在有机相中酶催化合成海藻糖不饱和脂肪酸二酯的方法，公开了在丙酮中利用脂肪酶novo435催化合成海藻糖油酸二酯、亚油酸二酯、花生油酸二酯和芥酸二酯，确定了最佳工艺条件，但是并未涉及除上述脂肪酸外的其他长链脂肪酸，以及短链羧酸、无机酸、二元酸等，并未提及富马酸海藻糖酯，也未进行相关实验。较于作为一元酸的长链脂肪酸，仅有一处羧基可以与海藻糖形成酯键，酶法催化产物也只能局限于生成单链的海藻糖单酯或是海藻糖二酯。而短链的二元酸和海藻糖反应，产物结构推测更为复杂，因其有可能会生成单海藻糖二富马酸酯，或是环状结构的单海藻糖单富马酸二酯。迄今为止，尚未见到富马酸海藻糖酯的酶催化研究与生产的报道。
技术实现要素：
[0005]
本发明的目的是提供一种在非水相介质中酶催化合成富马酸海藻糖酯的方法，本方法反应选择性强，产物成分少易于分离纯化，反应过程步骤简单。
[0006]
技术方案
[0007]
为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：一种在非水相介质中酶催化合成富马酸海藻糖酯的方法，包括丙酮，所述丙酮中加入海藻糖和富马酸，利用
novozym435脂肪酶催化合成富马酸海藻糖酯，生产工艺条件为：
[0008]
(1)海藻糖添加量为：1-25mmol/l，优选为10mmol/l；
[0009]
(2)催化剂novozym435脂肪酶添加量为：0-50g/l，优选为37g/l；
[0010]
(3)富马酸和海藻糖添加量摩尔比为：1:1-1:5(mol：mol)，优选为1:2；
[0011]
(4)分子筛添加量：0-400g/l，优选为100g/l；
[0012]
(5)恒温：25-50℃，优选为30℃；
[0013]
(6)振荡条件：100-220rpm，优选为150rpm；
[0014]
(7)反应时间：48-120h，优选为72h。
[0015]
反应结束用薄层色谱检测并分析，分离纯化工艺为：
[0016]
(1)反应体系过滤回收novozym435脂肪酶，同时得到液体部分；
[0017]
(2)将液体用硅胶柱层析分离纯化，收集得到富马酸海藻糖酯。
[0018]
进一步的，所述生产工艺条件为：
[0019]
(1)海藻糖添加量为：10mmol/l；
[0020]
(2)恒温振荡条件：30℃；
[0021]
(3)振荡条件：150rpm；
[0022]
(4)催化剂novozym435脂肪酶添加量为：375g/l；
[0023]
(5)富马酸和海藻糖添加量摩尔比为：1：2；
[0024]
(6)反应时间：72h；
[0025]
(7)分子筛添加量：100g/l。
[0026]
分离纯化工艺条件为：
[0027]
(1)薄层层析检测展开剂为：氯仿：甲醇＝(9：1，v/v)；
[0028]
(2)硅胶柱层析条件为：氯仿：甲醇＝(9：1，v/v)。
[0029]
进一步的，所述制备的富马酸海藻糖单酯带有富马酸的α、β-不饱和羰基结构。
[0030]
本发明提供了一种在非水相介质中酶催化合成富马酸海藻糖酯的方法。
[0031]
具备以下有益效果：
[0032]
该在非水相介质中酶催化合成富马酸海藻糖酯的方法，首次实现富马酸海藻糖酯的酶促催化生产，与结构类似物富马酸海藻糖甲酯的化学合成方法相比，本方法采用酶法一步合成，采用溶剂为食品生产中可使用的丙酮，产物单一，还省去了大量基团的保护和去保护步骤，步骤简单，也更为绿色环保。
附图说明
[0033]
图1为本发明富马酸海藻酯产物和富马酸红外光谱图。
具体实施方式
[0034]
如图1所示，本发明实施例提供一种在非水相介质中酶催化合成富马酸海藻糖酯的方法，包括以下实施例：
[0035]
实施例1：富马酸海藻酯的非水相酶催化合成
[0036]
1.使用马弗炉500℃，5h活化分子筛，将分子筛加入丙酮中，静置24h 除水后，按照以下步骤加入试剂进行反应：
[0037]
(1)丙酮中海藻糖难以溶解，所以海藻糖添加量选择为10mmol/l；
[0038]
(2)恒温条件确定，在实验中选择了25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃作为反应温度，其中50℃时丙酮会在恒温培养箱中全部挥发不利于反应进行，在 30℃产率最高，故选30℃作为最优条件；
[0039]
(3)振荡条件确定，在实验中选择了100rpm、125rpm、150rpm、175rpm、 200rpm作为振荡条件，其中选择150rpm产率最高，故选150rpm作为最优条件。
[0040]
(4)催化剂novozym435脂肪酶添加量确定，在实验中选择了125g/l、250 g/l、375g/l、500g/l，其中375g/l产率最高，故选375g/l作为最优条件。
[0041]
(5)海藻糖和富马酸添加量摩尔比确定，在实验中选择了1：1、1：2、1： 3、1：4、1：5，其中1：2产率最高，故选1：2作为最优条件。
[0042]
(6)反应时间确定，在实验中选择了24h、48h、72h、96h、120h作为反应时间，其中72h产率最高，故选72h作为最优条件。
[0043]
(7)分子筛添加量，分子筛可以吸附反应中生成的水分，减少脂肪酶水解产物。在实验中选择了0g/l、100g/l、200g/l、300g/l、400g/l作为分子筛添加条件，其中选择100g/l产率最高，故选100g/l作为最优条件。
[0044]
2.反应结束用薄层色谱检测并分析：
[0045]
在1中所述最优条件组合下反应后，从反应液中过滤回收脂肪酶，滤液部分湿法上样进行硅胶柱层析，层析后将带有相同产物管合并，旋蒸除去液体得到浅黄色产物。分离纯化工艺为：
[0046]
(1)薄层层析检测展开剂：氯仿：甲醇＝(9：1，v/v)
[0047]
(2)硅胶柱层析条件为：氯仿：甲醇＝(9：1，v/v)
[0048]
结果如图1所示，在非水相酶催化作用下，底物富马酸明显的减少，合成了新的富马酸海藻糖酯产物，产物呈现出比富马酸更快的迁移速率。
[0049]
经过计算，在最佳工艺条件下富马酸海藻糖酯的海藻糖转化率达到43％。
[0050]
3.将步骤2中分离得到的产物用红外光谱法检测，结果如图1所示，与富马酸相比，合成产物出现酯基特征峰1725.22，证实了产物是富马酸海藻糖酯。较于其他酯类在1735左右出峰，富马酸海藻糖酯中保留有富马酸的不饱和双键结构，c＝o吸收因与c＝c共轭移向低波数方向，使得酯基特征峰向低场偏移出现在1720附近。
[0051]
以上结果表明，本发明在食品工业用有机溶剂丙酮中，在温和的反应温度下，非水相酶促合成了富马酸海藻糖酯。