一种dna纳米结构、构建方法及应用
技术领域
1.本发明属于纳米结构技术领域，尤其涉及一种dna纳米结构、构建方法及应用。


背景技术：

2.目前，rna自组装是广泛存在，如rna四边形、四面体、k-turn、prna-3wj，病毒ires模型，因为它们的高多样性，长rna链难于预测。相反，dna链是可编程的且可以人工折叠。基于watson-crick碱基配对，dna无疑是最具有前景的自组装能力的分子。dna可以自组装成2d和3d纳米结构(如dna三角形、dna四面体和其他合理设计下的重组dna几何形状)，这让它们在多种应用中更有潜在使用价值。一个长dna支架可以被dna订书钉链折叠成不同的纳米结构，即dna折纸。在计算的帮助下，人们发现了dna折纸技术，dna 纳米结构发展成了一个自上而下的构建方法，如dna表情、dna盒子等。程序化的dna纳米体在纳米结构、分子器械应用和纳米医学的研究中具有重要意义，被dna或rna订书钉链折叠的rna脚手架链也用于开发这些应用。
3.由于dna脚手架链和dna订书钉链形成的dna纳米结构常常伴随着纳米结构构型错误(例如高浓度时聚合)、低产率和低效率。另外，rna的成本相对较高，而在制备较大的dna纳米结构时，需要引入一段dna来参入配对，相对应的大的dna纳米结构组装效率较低。这些挑战是dna纳米结构和纳米技术应用中主要的阻碍。因此，亟需一种新型的dna纳米结构的构建方法。
4.通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：由于rna的成本相对较高，且需要引入一段dna参入配对，故制备较大dna纳米结构的组装效率较低。
5.解决以上问题及缺陷的难度为：大的dna纳米结构需要较长的dna和rna链，制备较长的dna和rna单链的成本较高且纯度相对要低，也更容易被核酸酶降解，而且较长的核酸链会更容易产生碱基的错误配对，进一步制约了大的dna纳米结构的组装效率。
6.解决以上问题及缺陷的意义为：通过引入2
’‑
ome-rna能够帮助提高 dna-rna纳米结构的稳定性，获得高纯度的大dna纳米结构能够推动其在新型材料、药物递送系统、分子传感器、细胞成像等领域的广泛应用。


技术实现要素：

7.针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种dna纳米结构、构建方法及应用，尤其涉及一种rna夹子引导dna纳米结构的形成方法。
8.本发明是这样实现的，一种dna纳米结构的构建方法，所述dna纳米结构的构建方法包括：
9.利用rna和修饰的rna通过折叠支架dna链来形成dna纳米结构。
10.进一步，所述修饰的rna为2
’‑
ome-rna。
11.进一步，所述dna纳米结构的构建方法，还包括：
12.将外链作为rna夹子，将含3～5个折叠单位的dna脚手架链分别折叠成三角形、四
边形和五边形；其中，一个rna夹子折叠形成的dna纳米结构包括两个高组装效率的寡核苷酸组分。
13.进一步，所述dna纳米结构的构建方法，还包括：
14.利用具有特殊结构的rna作为夹子来折叠dna支架链得dna纳米结构。
15.进一步，所述dna纳米结构的构建方法，还包括：
16.改变dna支架链的rna夹子结合位点数量，得到不同形状的dna纳米结构。
17.进一步，所述dna纳米结构的构建方法，还包括：
18.利用2
’‑
ome修饰的rna作为夹子折叠dna支架连得到dna纳米结构。
19.进一步，所述dna纳米结构的构建方法，还包括：
20.通过引入一段dna到rna折叠的dna纳米结构中，得到更大的dna纳米结构。
21.进一步，所述dna纳米结构的构建方法，还包括：
22.用部分dna取代rna得到的dna-rna杂合链作为夹子折叠dna，得到 dna纳米结构；和/或通过延长的dna夹子链稳定的折叠dna支架链得到dna 纳米结构。
23.本发明的另一目的在于提供一种应用所述的dna纳米结构的构建方法构建得到的新型dna纳米结构，所述新型dna纳米结构通式为：
[0024][0025]
本发明的另一目的在于提供一种所述的新型dna纳米结构在分子器械和纳米医学中的应用。
[0026]
结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：本发明提供的dna纳米结构的构建方法，即用短的rna链作为夹子来引导dna纳米结构的形成，rna和修饰的rna(2
’‑
ome-rna)可以折叠支架dna链来形成dna纳米结构，丰富了dna纳米结构的构建方法，同时相比以往的dna 折纸术得到的dna纳米结构，rna折叠得到的dna纳米结构纯度更高，为 dna纳米结构的广泛应用提供了良好的基础。
[0027]
本发明用短rna夹子(包括修饰过的rna)可以高效地将dna脚手架链组装成设计好的形状和结构，因为短rna价格低廉且2-甲基修饰后化学稳定性较好，所以短rna是dna自组装纳米材料的理想支架夹子。本发明用rna夹子折叠dna的策略为折叠多种复杂的dna纳米材料提供了一个建筑学平台，一个rna夹子折叠形成的dna纳米结构包括两个高组装效率的寡核苷酸组分，这让构建dna纳米结构变得容易。
[0028]
本发明首次利用具有特殊结构的rna作为夹子来折叠dna支架链得dna 纳米结构；改变dna支架链的rna夹子结合位点数量，可以得到不同形状的 dna纳米结构；利用2
’‑
ome修饰的rna作为夹子可以折叠dna支架连得到效率更高，稳定性更好的dna纳米结构；通过引入一段dna到rna折叠的 dna纳米结构中，可以得到更大的dna纳米结构。
[0029]
在常规rna自组装情况下，当rna链较长时容易形成难以预测的复杂结构，不利于对其进行设计改造，本发明利用短的rna链来折叠长的dna链很好的避免了这个问题；在常规的dna折纸术或dna自组装的纳米结构，往往由于dna 结构多样性不足，容易导致组装效率较低，从而导致需要更多的dna链来完成组装，较多dna链又容易导致dna的错误组装，最终还是会引起组装效率较低。本发明巧妙地利用的rna的结构多样性和dna的易编程性的特点，利用两条核酸链就能形成纯度较高的dna纳米结构。
附图说明
[0030]
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0031]
图1是本发明实施例提供的新型dna纳米结构示意图。
[0032]
图2是本发明实施例提供的dna正方形可以通过rna夹子来折叠形成示意图。
[0033]
图3是本发明实施例提供的rna夹子折叠dna的三角形、方形和五边形纳米结构示意图。
[0034]
图4是本发明实施例提供的扩大的三角形、正方形和五边形dna纳米结构的设计和电镜成像示意图。
具体实施方式
[0035]
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0036]
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种dna纳米结构、构建方法及应用，下面结合附图对本发明作详细的描述。
[0037]
本发明实施例提供的dna纳米结构的构建方法包括：利用rna和修饰的 rna通过折叠支架dna链来形成dna纳米结构。
[0038]
下面结合术语解释对本发明的技术方案作进一步描述。
[0039]
本发明中，dna纳米结构(dnananostructure)：人为的基于核酸碱基互补配对来设计的核酸结构。rna夹子(rna clamp)具有特殊结构的一段短的rna 链，可以和dna支架链配对和组装形成特定的形状。
[0040]
下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步描述。
[0041]
为了解决现有技术存在的问题，本发明用短rna夹子而非dna订书钉链，利用了rna的结构多样性和双链稳定性。实际上，有特殊结构的短rna链依然可以使rna-dna相互作用并有稳定性，不像双链dna订书钉链，短rna 夹子有更强的结合能力和更多样的构像，原则
上可以引导dna脚手架链形成多种形状。本发明用短rna夹子(包括修饰过的rna)可以高效地将dna脚手架链组装成设计好的形状和结构，因为短rna价格低廉且2-甲基修饰后化学稳定性较好，所以短rna是dna自组装纳米材料的理想支架夹子。
[0042]
本发明首先报道了rna夹子可高效地将dna脚手架链折叠成许多形状，如 dna三角形、四边形和五角形，而相应的dna无法有效完成。这种rna夹子是来自丙型肝炎病毒rna基因组的ires结构域2α，这个结构域被两个重叠序列剪切成一个角，在x-射线晶体确认下，四个角可以组装成的rna四边形。在实验设计中，本发明将外链作为rna夹子，将dna脚手架链(含3-5个折叠单位)分别折叠成三角形、四边形和五边形。这些dna纳米结构已经成功地组装成了更大的dna纳米结构，一些多边形纳米结构(dna三角形、四边形、五边形)设计成更加复杂的纳米结构的建筑基石。本发明用rna夹子折叠dna的策略为折叠多种复杂的dna纳米材料提供了一个建筑学平台，一个rna夹子折叠形成的 dna纳米结构包括两个高组装效率的寡核苷酸组分，这让构建dna纳米结构变得容易。
[0043]
本发明的结构示意图如图1所示，rna和修饰的rna(2
’‑
ome-rna)可以折叠支架dna链来形成dna纳米结构。
[0044]
本发明首次利用具有特殊结构的rna作为夹子来折叠dna支架链得dna 纳米结构；改变dna支架链的rna夹子结合位点数量，可以得到不同形状的 dna纳米结构；利用2
’‑
ome修饰的rna作为夹子可以折叠dna得到效率更高，稳定性更好的dna纳米结构；通过引入一段dna到rna折叠的dna纳米结构中，可以得到更大的dna纳米结构。
[0045]
在常规rna自组装情况下，当rna链较长时容易形成难以预测的复杂结构，不利于对其进行设计改造，本发明利用短的rna链来折叠长的dna链很好的避免了这个问题；
[0046]
在常规的dna折纸术或dna自组装的纳米结构，往往由于dna结构多样性不足，容易导致组装效率较低，从而导致需要更多的dna链来完成组装，较多 dna链又容易导致dna的错误组装，最终还是会引起组装效率较低。本发明巧妙地利用的rna的结构多样性和dna的易编程性的特点，利用两条核酸链就能的纯度较高的dna纳米结构。
[0047]
本发明的替代方案为：(1)由于rna和2
’‑
ome-rna具有较好的结构多样性，用部分dna来取代rna得到的dna-rna杂合链作为夹子同样可以折叠dna来得到dna纳米结构；(2)同样由于短的dna作为夹子时，多样性不足，无法稳定的折叠dna支架链，通过延长的dna夹子链可以稳定折叠dna的支架链得到 dna纳米结构。
[0048]
rna外链(15r)在rna四边形稳定组装中起关键性作用，本发明探索相应的dna链是否也能形成dna四边形。本发明用相应的dna(10d和15d)分别替换了rna四边形的内链(10r)和外链(15r)，让内链(10r和10d)与外链(15r 和15d)组装。正如非变形聚丙烯酰胺凝胶电泳(page；图2a)所示，rna四边形(10r+15r)成功组装，但dna四边形(10d+15d)组装情况不佳，dna四边形(10r+15d)也没有形成。但是在有15r的情况下，dna-rna四边形(10d+15r) 组装成功了。这些结果表明，相较于对应的dna，15r在纳米组装中有更好的多样性和结合亲和力。因此，本发明发现具有更好多样性的rna外链，可以做 rna夹子，能够把dna链折叠成各种纳米结构。
[0049]
图2dna正方形可以通过rna夹子来折叠形成。15r：rna正方形的外链rna(15nt)；10r：rna正方形的内链rna(10nt)；15d：15r对应的dna； 10d：10r对应的dna；20d：10d两次重复的dna；40d：10d四次重复的 dna。这些纳米结构的组装通过非变性胶进行分析。(a)内链
(10r和10d) 和外链(15r和15d)的组装；(b)用rna夹子(15r)折叠dna支架(10d、 20d和40d)。
[0050]
为了探究rna夹子是否能将dna折叠成纳米结构，本发明设计了一些 dna链，包括相应的dna内链(10d，一个折叠单元)和它有2-、4-折叠单位的重复dna链，分别是20d和40d。有意思的是，本发明发现这种rna夹子可以将10d、20d和40d折叠成dna四边形，这也提高了dna四边形组装效率(图2b)。
[0051]
为了进一步研究rna夹子是否能将dna链折叠成纳米结构，本发明设计了带3-和5-折叠单位的dna链，分别为30d和50d。本发明发现rna夹子分别用30d、40d和50d组装形成了三角形、四边形、五边形的dna纳米结构(图3a)。特别是在有2-甲基化对应rna夹子存在时，所有的纳米结构都可以高效折叠，在三角形(98.5％vs 95.1％)四边形(96.0％vs 91.2％)和五边形(84.3％vs62.1％)中，折叠dna链比15r效率更高。结果表明组装效率按照dna五边形 (理论角度：108
°
)、四边形(90
°
)、三角形(60
°
)依次增加，这证明rna夹子(15r) 更倾向于形成小角度(60
°
)的紧密结构，但对应的dna(15d)不能折叠成任何纳米结构(图3c)。和大多数带有4个寡核苷酸的rna-dna杂交纳米结构不同的是，每个rna夹子折叠形成的dna纳米结构都只包括两个寡核苷酸，这平衡了 rna夹子的多样性和双重稳定性，但是dna订书钉链不能兼顾这两者。
[0052]
图3 rna夹子折叠dna的三角形、方形和五边形纳米结构，通过变性page 和ms研究证实。15o：15r对应的的2'-甲基化rna；在三角形(98.5％vs95.1％)、正方形(96.0％vs91.2％)和五边形(84.3％vs62.1％)的纳米形状中，15o折叠 dna支架链效果优于15r；30d：具有10d三次重复的dna；50d：具有10d 五次重复的dna；p10d：5'端磷酸化的10d；p30d：5'端磷酸化的30d；p40d： 5'端磷酸化40d；p50d：5'端磷酸化50d；c30d：环化的30d；c40d：环化的 40d；c50d：环化的50d。(a)，(b)和(c)dna三角形、正方形和五边形经 15r、15o和15d折叠后的组装的非变性page分析。(d)变性page分析有无 t4 dna连接酶连接的三角形(30d+15r)、正方形(10d+15r、40d+15r)和五边形(50d+15r)，(e)三角形、正方形和五边形组装的esi-ms分析。用t4 dna连接酶将折叠的dna三角形、正方形和五边形连接起来，然后用esi-ms 检测连接的三角形、正方形和五边形。
[0053]
表1 环状dna支架链的 esi-ms数据
[0054]
因为15r可以折叠纳米材料，并形成缺口，在5-磷酸化的dna脚手架链存在时，用t4 dna连接酶将c30d、c40d和c50d连接起来，形成环化单链dna 链。可以基于这些环化的dna链的迁移率在变性page下检测出来(图3d)。对于page分析，可用ssdna环化连接酶合成环化的p30d、p40d和p50d，作为阳性marker(c30d、c40d、c50d)，这些纳米结构可以在电喷雾质谱 (esi-ms，图3e)下得到进一步证实。通过变性page分析，不管是连接还是没有连接的折叠纳米结构，结果都与esi-ms数据一致(图3d和图3e)。
[0055]
详细来说，10d、30d、40d和50d的5端磷酸化，依次得到p10d、p30d、 p40d和p50d。在
用tadna连接酶组装连接后，p10d+15r形成c30d和c40d，并同时用ms检测(图3d和3e)。因为有p10d+15r的存在，没有观察到p20d 和p30d的组装和连接现象，本发明怀疑三角形和四边形是先形成再连接形成 c30d和c40d。如图所示(图3e，表1)，3-unitdna(p30d+15r)的组装反应形成了折叠的p30d，之后t4 dna连接酶连接产生环化的30d(c30d)； 4-unitdna(p40d+15r)的组装反应形成了折叠的p40d，随之连接形成环化的 40d(c40d)(图3e，表1))；5-unitdna(p50d+15r)的组装反应得到折叠的p50d，然后连接生成环化的50d(c50d)(图3e，表1)。为了研究在没有15r夹子的情况下，环形纳米dna是否可以形成，本发明将这些磷酸化支架(p10d、p30d、 p40、p50d)进行无15r的连接，作为阴性对照。就如本发明预期的那样，没有观察到有环状dna的存在，这表示它们的形成需要rna夹子的引导。
[0056]
此外，为了证实并观察到15r夹子折叠的环状dna纳米结构，本发明采用了原子力显微镜(afm)，但因为它们尺寸太小(约4nm)，所以它们的形状难以确认。另外本发明增加了纳米结构的大小，以观察到它们并验证本发明rna夹子引导下的dna纳米结构的构建策略。因此，本发明用21-bp的双链dna(21d；图4a)插入了三角形、四边形和五边形的每一条边，组装了更大尺寸的多边形。扩展的dna三角形包括93-nt的dna(93d)，并有三个相同结合单元21d和15r。扩大的dna四边形包含124-nt的dna(124d)，并带有四个相同的21d和15r 结合单元，扩大的dna五边形包含155-nt的dna(155d)，带五个相同的21d 和15r结合单元(图4a)。正如在非变性page上所示(图4b)，15r夹子成功地引导形成了纳米结构(扩大的dna三角形、四边形和五边形)，而在非变性page 显示，扩大的四边形有更详细的组装过程，最后，通过负染色em成像并确认了扩大的三角形、四边形和五边形(图4c)。本发明的方法为利用特异性和多样性的rna单元和rna夹子构建dna纳米结构提供了一种可行的策略。
[0057]
图4扩大的三角形、正方形和五边形dna纳米结构的设计和电镜成像。21d：插入纳米结构两侧的dna(21nt)；93d、124d和155d是dna(分别含有93、 124和155个nt)，分别具有21d的三、四和五个配对序列。(a)通过环扩张设计新的三角形、正方形和五边形纳米结构。三角形、正方形和五边形的每边为 31bp。(b)和(c)dna纳米结构的非变性page分析和电镜图像。
[0058]
总而言之，rna夹子可以成功折叠形成dna三角形、四边形和五边形，rna 夹子也可以用一个、两个或者四个折叠单元将dna脚手架链折叠成相同的四边形形状。相反，对应的dna无法做到，这说明结构单链rna可以提供充足的结构多样性、稳定性和高组装效率，以形成稳定的dna纳米结构。在本发明的这种策略下，rna夹子可以折叠形成扩大的dna纳米形状并在em成像在得到确认，这为使用简单的dna纳米结构作为构建单元，组装成复杂的dna纳米结构提供了一个平台。为了稳定rna引导的dna纳米结构，2-甲基化的rna链可以提高折叠效率和化学稳定性，是理想的替代品。本发明的实验结果证明了一个新的策略：有结构多样性的短rna夹子可以通过稳定的双链和rna夹子的二级结构，引导dna脚手架链形成多种形状。
[0059]
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。