1.本发明涉及生物样品处理技术领域，特别涉及一种核酸提取检测系统及方法。


背景技术：

2.从各种标本/样本中分离提取可供有效检测的核酸是进行分子生物学检测的基础，核酸的分离纯化的方法一般都包括了细胞裂解、核酸与其他生物大分子物质分离、核酸纯化等几个主要步骤，待测样本在裂解反应过程中，会释放包裹杂质，吸附酶等抑制物，影响下游分子检测而抑制扩增反应。lamp反应由于应用的是bst dna聚合酶，该酶的耐受性较好，因此lamp扩增反应时对模板的要求不高，即对待测样本核酸纯化的程度要求比其他检测方法更低，粗提取的核酸样本即可参与lamp反应。
3.目前市面上常用的核酸的分离纯化主要包括离心柱法和磁珠法，离心柱法提取效率高、效果好，但需要反复离心，不利于高通量、自动化操作；磁珠法使用对核酸具有特异吸附的超顺磁性氧化硅纳米微球(简称磁珠)和对核算进行吸附，再从磁珠上洗脱下核酸。这两类方法操作较为繁琐，同时需要要配套较多仪器设备(尤其是离心或洗脱设备，无法离开实验室环境，不适用于户外环境，难以应对突发情况，不利于核酸即时检测(poct)的实现，同时该两种方法未结合lamp检测反应对核酸模板要求的特殊性，不能相互配合实现利益和效率最大化。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一种核酸提取检测系统及方法，该系统和方法从lamp反应对核酸模板的纯度要求较低这一特性作为起点，特别设计了相互配合的细胞裂解液和核酸提取装置与lamp反应(仪器)配套使用，该裂解液组分简单，该核酸提取装置体积小，便于携带，操作简便，无需配套离心机、洗脱设备等，适用于户外或室内现场核酸即时检测，充分实现了利益和效率的最大化。
5.为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
6.一种核酸提取检测系统，所述系统包括核酸提取装置和细胞裂解液，所述核酸提取装置包括主体和与所述主体可拆卸连接的出液嘴，所述主体一端封闭，另一端敞口，所述主体的敞口端与封闭端内部连通形成一容置腔，所述容置腔靠近封闭端的一端膨大形成裂解室；所述出液嘴与所述敞口端可拆卸连接，所述出液嘴内具有出液通道，所述出液通道内容置有过滤件，所述过滤件包括依次层叠连接的活性炭层、磁珠层以及过滤膜层，所述磁珠层的磁珠不吸附核酸；所述核酸提取装置提取出的核酸溶液用于lamp扩增反应，所述细胞裂解液容置在所述裂解室中，所述细胞裂解液由无菌水、tris-hcl、蛋白酶k及chelex试剂组成。
7.进一步地，所述细胞裂解液中，各组分的终浓度为：tris-hcl:100mmol/l，蛋白酶k:2mg/ml及chelex试剂:1％w/v。
8.进一步地，所述容置腔可容纳棉签，所述棉签的脱脂棉端伸入所述裂解室，所述脱
脂棉端采集有待测样本。
9.更进一步地，所述棉签为双头棉签，所述敞口端的内壁具有向内延伸的第一挡沿，所述双头棉签的另一脱脂棉端搭接所述第一挡沿，所述另一脱脂棉端未采集有待测样本。
10.进一步地，所述过滤件与所述出水嘴的内壁紧密连接。
11.进一步地，所述出液嘴包括连成一体的连接段、过滤段以及出液段，所述出液段呈锥形，所述过滤段呈圆筒形，所述过滤段的内径大于所述出液段的最大内径，所述过滤段与所述出液段的连接处形成第二挡沿，所述过滤件的一端抵接所述第二挡沿，所述过滤件与所述过滤段的内壁紧密连接。
12.进一步地，所述过滤膜层为硝酸纤维膜层，所述磁珠层的磁珠为氨基磁珠。
13.进一步地，该系统还包括便携式lamp检测仪，所述检测仪具有反应管和恒温加热装置，所述恒温加热装置可以固定及为所述反应管内的溶液恒温加热，所述出液嘴的出口与所述反应管的入口流体连通。
14.进一步地，所述核酸提取装置还包括连接件，所述连接件的一端可拆卸的连接所述敞口端，另一端可拆卸的连接所述出液嘴。
15.进一步地，所述连接件一端设有外螺纹，另一端设有内螺纹，所述外螺纹与所述出水嘴的内壁螺纹连接，所述内螺纹与所述敞口端的外壁螺纹连接。
16.进一步地，所述连接件包括连成一体的敞口端连接部和出液嘴连接部，所述敞口端连接部与所述出液嘴连接部均为圆筒状，所述敞口端连接部的直径大于所述出液嘴连接部的直径。
17.进一步地，所述双头棉签未采集有待测样本的一端搭接在所述出液嘴连接部的内壁上。
18.本发明还提供了一种核酸提取检测方法，该方法包括以下步骤：
19.s1、利用上述的核酸提取检测系统对待测样本进行核酸粗提取；
20.s2、将带有显色剂的lamp反应试剂、步骤s1中得到的待测样本核酸粗提取液、lamp反应引物加入到反应管中；
21.s3、将反应管恒温加热进行lamp反应，根据反应管内溶液的颜色变化进行结果判读。
22.进一步地，步骤s2中所述的带有显色剂的lamp反应试剂为lamp冻干珠。
23.进一步地，该核酸提取检测方法步骤s1之前，还包括步骤s0：利用双头棉签其中的一头(一脱脂棉端)采集待测样本。
24.与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
25.1、本发明提供的核酸提取系统和方法从lamp反应对核酸模板的纯度要求较低这一特性作为起点，特别设计了相互配合的细胞裂解液和核酸提取装置与lamp反应(仪器)配套使用，该裂解液组分简单，该核酸提取装置体积小，便于携带，操作简便，无需配套离心机、洗脱设备等，本发明适用于户外或室内现场核酸即时检测，充分实现了利益和效率的最大化。
26.2、本发明提供的核酸提取检测系统中，提取装置通过在将主体内的容置腔一端膨大形成裂解室，将与主体可拆卸连接的出液嘴内设置过滤件，该装置可以实现裂解液储存、样本裂解、固定排液及去除杂质等功能于一身，结构简单，操作方便，十分适宜于现场核酸
提取用；该过滤件包括依次层叠连接的活性炭层、磁珠层以及过滤膜层，所述磁珠层的磁珠不吸附核酸，活性炭层可去除样本中的大分子杂质、胶体、重金属等各种无机物，磁珠层可以吸附蛋白质与脂质，过滤膜层进一步对蛋白质进行吸附去除，三者配合使用得到适合下游检测的核酸产物；
27.3、本发明提供的提取装置主体的容置腔可以容纳棉签，所述棉签的脱脂棉端伸入裂解室中，该脱脂棉端采集有待测样本，所述裂解室内储存有细胞裂解液；从而在进行样本采集后，可以直接将棉签置于容置腔进行裂解反应，无需先溶出再转移，快速高效，减少了多次接触造成的样本污染；
28.4、本发明提供的提取装置可容纳的棉签为双头棉签，该棉签的一脱脂棉端用于采集待测样本；另一脱脂棉端用于对经细胞裂解液裂解后的样本溶液中的一些较大的杂质进行吸附，避免其进入出液嘴内，提高后续过滤件的吸附效率和吸附效果。
附图说明
29.图1：本发明提供的核酸提取装置在样本细胞裂解使用状态下的剖视图；
30.图2：本发明提供的核酸提取装置在过滤状态下的剖视图；
31.图3：图2中a区域的放大示意图；
32.图4：本发明提供的核酸提取检测系统和方法用于内参基因的核酸提取检测实验时，反应后的溶液变色情况。
33.图中：
34.1、主体，11、容置腔，111、裂解室，12、棉签，121、第一脱脂棉端，122、第二脱脂棉端；
35.2、出液嘴，21、过滤件，211、活性炭层，212、磁珠层，213、过滤膜层，22、连接段，23、过滤段，24、出液段，25、第二挡沿；
36.3、连接件，31、敞口端连接部，32、出液嘴连接部，33、第一挡沿。
具体实施方式
37.现有技术中存在核酸提取方法操作较为繁琐，同时需要配套较多仪器设备(尤其是离心或洗脱设备，无法离开实验室环境，不适用于户外环境，难以应对突发情况，不利于核酸即时检测(poct)的实现，同时现有的核酸提取方法未结合lamp反应对核酸模板要求的特殊性，不能相互配合实现利益和效率最大化的技术问题。所以本发明提出新的方案，为更加清楚的表示，下面结合附图和具体实施例对本发明做详细的说明。
38.请参阅图1-图3所示，本发明公开了一种核酸提取检测系统，所述系统包括核酸提取装置和细胞裂解液，所述核酸提取装置提取出的核酸溶液用于lamp扩增反应，该核酸提取装置包括主体1和出液嘴2，主体1和出液嘴2可以通过螺接、卡接等常见的可拆卸连接方式连接。在一具体的实施例中，主体1与出液嘴2通过一独立的连接件3连接，在其他实施例中，连接件3也可以与主体1为一体，或者与出液嘴2为一体。
39.请参阅图1和图2所示，主体1一端封闭，另一端敞口，主体1的敞口端与封闭端内部连通形成一容置腔11，容置腔11靠近所述封闭端的一端膨大形成裂解室111；容置腔11可容纳棉签12，棉签12的脱脂棉端伸入裂解室111，所述脱脂棉端采集有待测样本，所述待测样
本可以为鼻拭子样本、咽拭子样本或鼻咽拭子样本，裂解室111内储存有细胞裂解液。所述细胞裂解液由无菌水、tris-hcl、蛋白酶k及chelex试剂组成。所述细胞裂解液中，各组分的终浓度为：tris-hcl:100mmol/l，蛋白酶k:2mg/ml及chelex试剂:1％w/v。经实验，1％浓度chelex不影响bst酶活性；利用蛋白酶(蛋白酶k)将蛋白质消化成小的片段，促进核酸与蛋白质的分开。
40.棉签12可以为单头棉签或双头棉签，在一具体的实施例中，棉签12为双头棉签，其第一脱脂棉端121采集有待测样本，第一脱脂棉端121伸入或容置在裂解室111中，第二脱脂棉端122用于对经细胞裂解液裂解后的样本溶液中的一些较大的杂质(例如鼻拭子或咽拭子或鼻咽拭子采集时沾上的一些鼻腔或口腔其他分泌物或其他不溶颗粒异物等)进行吸附，避免其进入出液嘴2内，提高后续过滤件21的吸附效率和吸附效果。
41.前述一具体的实施例中，主体1与出液嘴2通过一独立的连接件3连接，连接件3的的一端可拆卸的连接所述敞口端，另一端可拆卸的连接出液嘴2。具体的，请参照图2及图3所示，连接件3一端设有外螺纹(图中未标记)，另一端设有内螺纹(图中未示出)，所述外螺纹与出水嘴2的内壁螺纹连接，所述内螺纹与所述敞口端的外壁螺纹连接。通过连接件3的两处螺纹将主体1(的敞口端)与出液嘴2连接，拆卸方便，且密封性好，不易漏液。在其他实施例中，连接件3也可以采用卡接等其他常见的方式连接主体1和出液嘴2，只要能实现拆卸方便、不易漏液的效果即可。
42.具体的，参照图2所示，连接件3包括连成一体的敞口端连接部31和出液嘴连接部32，敞口端连接部31与出液嘴连接部32均为圆筒状，敞口端连接部31的直径大于所述出液嘴连接部32的直径；所述双头棉签未采集有咽拭子样本或鼻咽拭子样本的一端(即第二脱脂棉端122)搭接在出液嘴连接部32的内壁上。由于敞口端连接部31的直径大于所述出液嘴连接部32的直径，所以两者连接处呈现出一挡沿，所述挡沿为第一挡沿33，第一挡沿33向出液嘴连接部32方向延伸即形成了出液嘴连接部32的内壁。第二脱脂棉端122搭接在第一挡沿33上，可以避免细胞裂解液裂解后的样本溶液直接流入出液嘴2内，提供一初过滤作用。在其他实施例中，第一挡沿33也可以是所述敞口端向内延伸形成。
43.出液嘴2用于将提取后的核酸排出，出液嘴2内具有出液通道，所述出液通道内容置有过滤件21。参照图2和图3所示，过滤件21包括依次层叠连接的活性炭层211、磁珠层212以及过滤膜层213，磁珠层212的磁珠不吸附核酸，活性炭层211可去除样本中的大分子杂质、胶体、重金属等各种无机物，磁珠层212可以吸附蛋白质与脂质而不吸附核酸，过滤膜层213进一步对蛋白质进行吸附去除，三者配合使用得到适合下游检测的核酸产物，与前述的第二脱脂棉端122配合，则效率更高，效果更好。具体的，过滤膜层213可以为一层或多层硝酸纤维膜层铺成，磁珠层212可以为氨基磁珠铺设在所述硝酸纤维膜层而成，氨基磁珠(purimag g-nh2)是具有-nh2表面官能团的超顺磁微球，由fe3o4核和gma涂层组成，可以将蛋白质、脂质吸附到其表面。活性炭层211可以是将活性炭铺设在所述氨基磁珠层上形成，三层结构的过滤件21可以是通过常见的压合方式制成的，可以是先压合两层，再铺设活性炭压制成最后一层。蛋白与硝酸纤维素膜层的结合原理是通过疏水作用力h键静电作用力等。
44.出液嘴2可包括连成一体的连接段22、过滤段23以及出液段24，出液段24呈锥形，过滤段23呈圆筒形，过滤段23的内径大于出液段24的最大内径，过滤段23与出液段24的连
biotech co.,ltd)提供的bst 4.0red isoamp lyophilized bead产品，产品编号为a3828-01。
57.本步骤中，待测样本核酸粗提取液的加入量只需30-40微升，多加或少加待测核酸液体都会影响lamp反应(例如，多加核酸液体，间接稀释酶和引物浓度)。而本发明的裂解室(膨大)的设计可较为精准的排液，有利于此处控制加液体积。
58.s3、将反应管恒温加热进行lamp反应，根据反应管内溶液的颜色变化进行结果判读。
59.步骤s3中，恒温加热的温度可以是65℃。
60.为了进一步验证本发明提供的核酸提取检测系统及方法的实用性，本发明还选取一组人的gapdh基因的lamp引物进行了效果验证实验，具体的实验过程包括以下步骤：
61.(1)、配制gapdh基因lamp引物混合物，制备得引物混合液lamp primer mix(10x)，各引物的核苷酸序列见表1：
62.表1实验用人的gapdh基因的lamp引物序列
63.gapdh-f3tcctgctgcccacagtcgapdh-b3ggtcttgaggcctgagctgapdh-fipgacgtaggggggaagggactctgggaaccagcaccgatgapdh-bipgtgcgtgcccagttgaaccacgtaaaaccgctagtagccggapdh-lfttggcccgatgggaggtgapdh-lbggctgcggaaaaaaaaaagc
64.引物混合液lamp primer mix(10x)中，各引物的浓度为：gapdh-f3：2μmol/l，gapdh-b3：2μmol/l，gapdh-fip：16μmol/l，gapdh-bip：16μmol/l，gapdh-lf：4μmol/l，gapdh-lb：4μmol/l；
65.(2)、待测样本的核酸提取
66.使用双头棉签沾取鼻咽分泌物，一端棉签头完全吸满待测样本；充分吸取，直至棉签头完全吸满液体；
67.轻轻打开核酸提取装置，将沾有样本的棉签头部放入细胞裂解液中，关闭核酸提取装置，使其密闭不漏液；
68.震荡核酸提取装置(可以是在一分钟内剧烈振荡5次)，使样本和裂解液充分混合；
69.将核酸提取装置颠倒，轻轻挤压裂解室的外部，至出液嘴流出30-40μl待测样本核酸粗提取液；
70.(3)、lamp扩增检测
71.在200微升的ep管(离心管)中加入1颗商品化lamp冻干珠；
72.继续加入上述步骤(2)中的30-40μl的待测样本核酸粗提取液；
73.加入3.5μl步骤(1)得到的引物混合液lamp primer mix(10x)，用移液器吹打均匀；
74.放置在65℃的金属浴或者能实现该条件的便携式lamp反应/检测仪器中，15分钟后取出，通过颜色变化进行结果判读。
75.经实验，15分钟后，反应后的ep管内溶液颜色情况见图4。图4中，从左至右共有6只ep管，其中第1-2只(自左向右数，下同)为ntc组(模板为去离子水)；第3-4只内的测试物(模
板)为鼻拭子样本溶于去离子水得到的35ul溶液；第5-6只内的测试物(模板)为与3-4只相同的鼻拭子待测样本经过本发明提供的提取装置和细胞裂解液提取得到的35ul待测样本核酸粗提取液，最后，第1-4只ep管内的溶液均为粉红色，反应前后未发生颜色变化，第5-6只ep管内溶液由粉红色变为黄色。这证明本装置可以有效检测出内参基因的核酸，适用于核酸提取检测用。
76.以上实施例仅用以解释说明本发明的技术方案而非对其限制，尽管上述实施例对本发明进行了具体的说明，相关技术人员应当理解，依然可对本发明的具体实施方式进行修改或者等同替换，而未脱离本发明精神和范围的任何修改和等同替换，其均应涵盖在本发明的权利要求范围之中。