1.本发明属于蛋白酶解技术领域，具体涉及一种多级酶解工艺制备 鱼皮鱼鳞胶原蛋白肽粉的方法。
背景技术：
2.罗非鱼(oreochromissp)，罗非鱼含有多种矿物质，比如钙、钠、 磷、铁等，含有多种维生素，其蛋白质含量丰富、脂肪含量较少，拥 有种类丰富的氨基酸，其氨基酸组成较为平衡，属于高蛋白的优质鱼 类。罗非鱼不但产量巨大、经济效益显著，而且营养丰富、种类齐全， 具有良好的开发潜能。虽然罗非鱼产量及加工量在我国得到迅速的发 展，主要加工形式为冷冻活鱼或者是去除副产物的冷冻鱼片，但是其 单一的加工形式已成为行业发展的瓶颈，同时精深加工产品如胶原蛋 白肽等很少，造成其深加工的比重极其小，导致附加值偏低。由于罗 非鱼的采肉率低，从罗非鱼中获取鱼片之后会有许多副产物的产生， 包括鱼内脏、鱼头、鱼皮、鱼骨、鱼尾、鱼鳞等可以高达原材料的5 0～80％，这些副产物通常作为废物丢弃，这可能会导致严重的健康和 环境问题，因此需要对副产物进行综合利用。
3.胶原蛋白经常被用来作为功能食品和保健品的添加成分，但由于 胶原蛋白其分子量高导致口服之后难以消化吸收。而解决这个问题的 一个方法是用适当的蛋白酶水解胶原蛋白，使之变成胶原蛋白肽，酶 水解过程可以产生众多小片段的胶原蛋白肽。此外，在水解后它的一 些生物活性增加及抗原性降低。低分子量的胶原蛋白肽具有更高的几 率穿过肠屏障和发挥其生物学效应。
4.胶原蛋白肽的制备方法常见的有酶水解法、化学法、微生物发酵 法和人工合成法。微生物发酵法发酵时间比较长，发酵产物的活性成 分多且杂。人工合成法有化学合成和基因工程两种方法。化学合成法 但是成本高，主要停留在实验室的小试研究。基因工程法基因的表达 效率低甚至表达错误造成安全性降低、产品获取难度很大。而酶水解 法具有众多优点：(1)不同的蛋白酶其水解作用位点不同，使酶解 具有一定的特异性，可定位制备特定的胶原蛋白肽；(2)酶解能脱 除多肽的苦味，改良口感；(3)人工及资金成本都比较低、条件温 和利于制备高活性物质、食源性材料使其制备的产品安全性高、时间 短且不产生污染环境的物质。但单次酶解效率低，酶解不充分，制备 的胶原蛋白肽气味不佳。
5.中国发明专利(申请号cn202110155480.9)公开了一种鱼鳞酶 解提取大分子胶原蛋白肽的方法，通过酶解，可获得大分子的胶原蛋 白肽，同时，通过活性炭吸附的方式，可取出酶解时产生的苦味肽， 使得胶原蛋白肽制成的食用产品口味更佳，但酶解效率不高，产量不 高。
6.中国发明专利(申请号cn201110007964.5)公开了一种小分子 鱼鳞胶原蛋白肽的制备工艺，提取产率高，减少杂质对酶活性的影响， 降低酶解反应的用酶量，但酶本身活性不高，气味不佳。
技术实现要素：
7.本发明的目的在于提供一多级酶解工艺制备鱼皮鱼鳞胶原蛋白 肽粉的方法，采用多级酶解工艺，以解决酶活性不高、酶解不彻底， 胶原蛋白肽粉产量低，生产出的胶原蛋白肽粉气味不佳的问题。
8.一种多级酶解工艺制备鱼皮鱼鳞胶原蛋白肽粉的方法，包括以下 步骤：
9.1)将鱼皮鱼鳞原料依次进行清水清洗、微酸洗、微碱洗、破碎至 1～6mm碎块，再加入4～6.5倍纯净水，混合成原料浆料；
10.2)将所述原料浆料加入食品级氢氧化钠溶液搅拌均匀，调节ph 值至8.0-9.0，加热至90～95℃，恒温水解2～4h，超声波处理，得到 初级水解料液；
11.3)对所述初级水解料液进行温度调节，使温度调节至55～59℃， 调节ph值为6.5～7.5，加入碱性蛋白酶，搅拌，恒温反应60～70min， 得到一级生化降解料液；所述碱性蛋白酶的质量为所述原料质量的0. 05～0.06％；
12.4)将所述一级生化降解料液的ph值调节为7～8，在温度为54～5 7℃下加入碱性蛋白酶，搅拌，恒温反应30～60min，得到二级生化降 解料液；所述碱性蛋白酶的质量为原料质量的0.05～0.06％；
13.5)将所述二级生化降解料液的ph值调为为6.0～7.0，在温度为5 3～55℃下加入胶原蛋白酶，搅拌，恒温反应50～60min，得到三级生 化降解料液；所述胶原蛋白酶的质量为原料质量的0.08～0.12％；
14.6)将所述三级生化降解料液的ph值调为6.0～7.2，在温度为55～ 60℃下加入中性蛋白酶和风味酶，搅拌，恒温反应25～30min，得到 四级生化降解料液；所述中性的质量为所述原料质量的0.08～0.10％， 所述风味酶的质量为所述原料质量的0.15～0.25％；
15.7)将所述四级生化降解料液的ph值调为6.0～6.8，在温度为40～ 50℃下，加入木瓜蛋白酶、胱氨酸、氯化钙溶液；葡萄糖酸钙搅拌， 恒温反应1-3h；得到五级生化降解料液；所述木瓜蛋白酶的质量为所 述原料质量的0.10～0.12％；
16.8)将所述五级生化降解浆料的ph值调为4.0～7.0，过滤除去鱼鳞 渣和色素渣后，得到胶原蛋白肽胶液；
17.9)将所述胶液中加入活性炭粉，搅拌均匀40～50min，温度保持 在40～45℃进行脱色；
18.10)离心、冷冻干燥即得胶原蛋白肽粉。
19.进一步，步骤1)中所述的微酸洗为在ph值4.0的醋酸溶液水 漂洗。
20.进一步，步骤1)中，所述的微碱洗为在ph值9.5的氢氧化钠 溶液水漂洗。
21.进一步，步骤2)中，氢氧化钠的浓度为40％。
22.进一步，步骤2)中，所述超声功率为250-300w，时间为20-30 min。
23.进一步，步骤7)中，胱氨酸浓度为0.1mol/l。
24.进一步，步骤7)中，所述氯化钙溶液离子浓度为0.2％。
25.进一步，步骤8)中，所述的过滤方式为布袋过滤或板框压滤。
26.进一步，步骤9)中，活性炭加入量为胶液质量的0.02％。
27.进一步，所述的鱼皮鱼鳞原料来自于罗非鱼。
28.本发明与现有技术相比有益效果为：
29.1.本发明采用多级酶解工艺，每一步都针对性的改变工艺参数和 所用的酶，能够提高胶原蛋白肽粉得率，并缩短处理时间；解决现有 技术中，单步酶解产生的酶利用率低、酶解不彻底、收率不高的问题。
30.2.本发明通过微酸洗和微碱洗对原料进行脱脂处理，微酸洗和微 碱洗后，鱼皮鱼鳞中的蛋白质会展开，原本与蛋白质结合的腥味成分， 就会与蛋白质分离，在漂洗的过程中会被冲洗掉。且酸和碱能够溶解 脂质和色素等，减少了因脂肪氧化分解产生腥味；并且可脱除组胺等 呈腥物质，能使鱼皮鱼鳞中醛类、酯类化合物含量显著降低，使提取 出的胶原蛋白肽无腥臭味，风味更佳。
31.3.本发明使用超声波对原料进行处理，超声波可以使原料细胞打 开，使原料易于溶解，从而能够提高胶原蛋白的提取率，还能使原料 胶原蛋白自由基清除率增大，有利于鱼鳞鱼皮胶原的水解和酶解反应 的进行。
32.4.本发明步骤7)中，采用木瓜蛋白酶进行酶解，加入胱氨酸能 够使木瓜蛋白酶活性中心的疏基不被氧化形成二硫键，防止酶失活； 氯化钙可通过与木瓜蛋白酶的配体配位结合，形成具有活性的区域， 使酶的结构发生改变，增加酶的活性；葡萄糖酸钙不仅能起到激活酶 的作用，且还能够起到保护作用，能够使酶保持活力；酶、胱氨酸、 葡萄糖酸钙、氯化钙协同反应，能够使酶解利用率提高，酶解更充分。
具体实施方式
33.在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护 范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例 中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发 明的保护范围。
34.实施例1
35.一种多级酶解工艺制备鱼皮鱼鳞胶原蛋白肽粉的方法，包括以下 步骤：
36.1)将罗非鱼鱼皮鱼鳞原料依次进行清水清洗、在ph值4.0的醋 酸溶液水漂洗、所述的微碱洗为在ph值9.5的氢氧化钠溶液水漂洗、 破碎至4mm碎块，再加入6.5倍纯净水，混合成原料浆料；
37.2)将所述原料浆料加入浓度为40％的食品级氢氧化钠溶液搅拌 均匀，调节ph值至9，加热至95℃，恒温水解4h，超声波处理，功 率为250w，时间为25min，得到初级水解料液；
38.3)对所述初级水解料液进行温度调节，使温度调节至55℃，调节 ph值为6.5，加入碱性蛋白酶，搅拌，恒温反应60min，得到一级生 化降解料液；所述碱性蛋白酶的质量为所述原料质量的0.06％；
39.4)将所述一级生化降解料液的ph值调节为7.5，在温度为56℃ 下加入碱性蛋白酶，搅拌，恒温反应30min，得到二级生化降解料液； 所述碱性蛋白酶的质量为原料质量的0.06％；
40.5)将所述二级生化降解料液的ph值调为为6.5，在温度为55℃ 下加入胶原蛋白酶，搅拌，恒温反应50min，得到三级生化降解料液； 所述胶原蛋白酶的质量为原料质量的0.08％；
41.6)将所述三级生化降解料液的ph值调为7，在温度为60℃下加 入中性蛋白酶和风
味酶，搅拌，恒温反应27min，得到四级生化降解 料液；所述中性的质量为所述原料质量的0.10％，所述风味酶的质量 为所述原料质量的0.15％；
42.7)将所述四级生化降解料液的ph值调为6.5，在温度为48℃下， 加入木瓜蛋白酶、0.1mol/l的胱氨酸、离子浓度为0.2％的氯化钙溶 液；葡萄糖酸钙搅拌，恒温反应2min；得到五级生化降解料液；所 述木瓜蛋白酶的质量为所述原料质量的0.10％
43.8)将所述五级生化降解浆料的ph值调为6，布袋过滤或板框过 滤，过滤除去鱼鳞渣和色素渣后，得到胶原蛋白肽胶液；
44.9)将所述胶液中加入胶液质量0.02％的活性炭粉，搅拌均匀40m in，温度保持在40℃进行脱色；
45.10)离心、冷冻干燥即得胶原蛋白肽粉。
46.实施例2
47.一种多级酶解工艺制备鱼皮鱼鳞胶原蛋白肽粉的方法，包括以下 步骤：
48.1)将罗非鱼鱼皮鱼鳞原料依次进行清水清洗、在ph值4.0的醋 酸溶液水漂洗、所述的微碱洗为在ph值9.5的氢氧化钠溶液水漂洗、 破碎至11mm碎块，再加入5倍纯净水，混合成原料浆料；
49.2)将所述原料浆料加入浓度为40％的食品级氢氧化钠溶液搅拌 均匀，调节ph值至8，加热至92℃，恒温水解3h，超声波处理，功 率为280w，时间为20min，得到初级水解料液；
50.3)对所述初级水解料液进行温度调节，使温度调节至56℃，调节ph值为7，加入碱性蛋白酶，搅拌，恒温反应65min，得到一级生化 降解料液；所述碱性蛋白酶的质量为所述原料质量的0.05％；
51.4)将所述一级生化降解料液的ph值调节为7，在温度为57℃下 加入碱性蛋白酶，搅拌，恒温反应55min，得到二级生化降解料液； 所述碱性蛋白酶的质量为原料质量的0.05％；
52.5)将所述二级生化降解料液的ph值调为为6，在温度为53℃下 加入胶原蛋白酶，搅拌，恒温反应55min，得到三级生化降解料液； 所述胶原蛋白酶的质量为原料质量的0.12％；
53.6)将所述三级生化降解料液的ph值调为6.8，在温度为55℃下 加入中性蛋白酶和风味酶，搅拌，恒温反应25min，得到四级生化降 解料液；所述中性的质量为所述原料质量的0.09％，所述风味酶的质 量为所述原料质量的0.2％；
54.7)将所述四级生化降解料液的ph值调为6.8，在温度为50℃下， 加入木瓜蛋白酶、0.1mol/l的胱氨酸、离子浓度为0.2％的氯化钙溶 液；葡萄糖酸钙搅拌，恒温反应1h；得到五级生化降解料液；所述 木瓜蛋白酶的质量为所述原料质量的0.1％
55.8)将所述五级生化降解浆料的ph值调为5，布袋过滤或板框过 滤，过滤除去鱼鳞渣和色素渣后，得到胶原蛋白肽胶液；
56.9)将所述胶液中加入胶液质量0.02％的活性炭粉，搅拌均匀50m in，温度保持在42℃进行脱色；
57.10)离心、冷冻干燥即得胶原蛋白肽粉。
58.实施例3：
59.一种多级酶解工艺制备鱼皮鱼鳞胶原蛋白肽粉的方法，包括以下 步骤：
60.1)将罗非鱼鱼皮鱼鳞原料依次进行清水清洗、在ph值4.0的醋 酸溶液水漂洗、所述的微碱洗为在ph值9.5的氢氧化钠溶液水漂洗、 破碎至6mm碎块，再加入4倍纯净水，混合成原料浆料；
61.2)将所述原料浆料加入浓度为40％的食品级氢氧化钠溶液搅拌 均匀，调节ph值至8.5，加热至93℃，恒温水解2h，超声波处理， 功率为300w，时间为30min，得到初级水解料液；
62.3)对所述初级水解料液进行温度调节，使温度调节至57℃，调节 ph值为7.5，加入碱性蛋白酶，搅拌，恒温反应70min，得到一级生 化降解料液；所述碱性蛋白酶的质量为所述原料质量的0.06％；
63.4)将所述一级生化降解料液的ph值调节为8，在温度为55℃下 加入碱性蛋白酶，搅拌，恒温反应40min，得到二级生化降解料液； 所述碱性蛋白酶的质量为原料质量的0.05％；
64.5)将所述二级生化降解料液的ph值调为为7.0，在温度为54℃ 下加入胶原蛋白酶，搅拌，恒温反应58min，得到三级生化降解料液； 所述胶原蛋白酶的质量为原料质量的0.10％；
65.6)将所述三级生化降解料液的ph值调为6.0，在温度为58℃下 加入中性蛋白酶和风味酶，搅拌，恒温反应25min，得到四级生化降 解料液；所述中性的质量为所述原料质量的0.08％，所述风味酶的质 量为所述原料质量的0.25％；
66.7)将所述四级生化降解料液的ph值调为6.6，在温度为45℃下， 加入木瓜蛋白酶、0.1mol/l的胱氨酸、离子浓度为0.2％的氯化钙溶 液，葡萄糖酸钙搅拌，恒温反应1.5h；得到五级生化降解料液；所述 木瓜蛋白酶的质量为所述原料质量的0.12％
67.8)将所述五级生化降解浆料的ph值调为4.0，布袋过滤或板框过 滤，过滤除去鱼鳞渣和色素渣后，得到胶原蛋白肽胶液；
68.9)将所述胶液中加入胶液质量0.02％的活性炭粉，搅拌均匀45m in，温度保持在45℃进行脱色；
69.10)离心、冷冻干燥即得胶原蛋白肽粉。
70.实施例4
71.一种多级酶解工艺制备鱼皮鱼鳞胶原蛋白肽粉的方法，包括以下 步骤：
72.1)将罗非鱼鱼皮鱼鳞原料依次进行清水清洗、在ph值4.0的醋 酸溶液水漂洗、所述的微碱洗为在ph值9.5的氢氧化钠溶液水漂洗、 破碎至5mm碎块，再加入6倍纯净水，混合成原料浆料；
73.2)将所述原料浆料加入浓度为40％的食品级氢氧化钠溶液搅拌 均匀，调节ph值至8.8，加热至90℃，恒温水解3h，超声波处理， 功率为260w，时间为27min，得到初级水解料液；
74.3)对所述初级水解料液进行温度调节，使温度调节至59℃，调节 ph值为6.8，加入碱性蛋白酶，搅拌，恒温反应68min，得到一级生 化降解料液；所述碱性蛋白酶的质量为所述原料质量的0.05％；
75.4)将所述一级生化降解料液的ph值调节为7.6，在温度为54℃ 下加入碱性蛋白
酶，搅拌，恒温反应60min，得到二级生化降解料液； 所述碱性蛋白酶的质量为原料质量的0.06％；
76.5)将所述二级生化降解料液的ph值调为为6.8，在温度为55℃ 下加入胶原蛋白酶，搅拌，恒温反应60min，得到三级生化降解料液； 所述胶原蛋白酶的质量为原料质量的0.09％；
77.6)将所述三级生化降解料液的ph值调为7.2，在温度为56℃下 加入中性蛋白酶和风味酶，搅拌，恒温反应260min，得到四级生化 降解料液；所述中性的质量为所述原料质量的0.08％，所述风味酶的 质量为所述原料质量的0.10％；
78.7)将所述四级生化降解料液的ph值调为6.0，在温度为40℃下， 加入木瓜蛋白酶、0.1mol/l的胱氨酸、离子浓度为0.2％的氯化钙溶 液；葡萄糖酸钙搅拌，恒温反应1.2h；得到五级生化降解料液；所述 木瓜蛋白酶的质量为所述原料质量的0.12％
79.8)将所述五级生化降解浆料的ph值调为5，布袋过滤或板框过 滤，过滤除去鱼鳞渣和色素渣后，得到胶原蛋白肽胶液；
80.9)将所述胶液中加入胶液质量0.02％的活性炭粉，搅拌均匀48m in，温度保持在44℃进行脱色；
81.10)离心、冷冻干燥即得胶原蛋白肽粉。
82.对比例1
83.与实施例3基本相同，唯有不同的是，步骤1)中未进行微酸洗、 微碱洗。
84.对比例2
85.与实施例3基本相同，唯有不同的是，步骤2)中，未进行超声 处理。
86.对比例3
87.与实施例3基本相同，唯有不同的是，步骤7)中，未加入胱氨 酸、葡萄糖酸钙、氯化钙溶液，替换为同等质量的水，其余原料配比 不变。
88.对比例4
89.与实施例3基本相同，唯有不同的是，步骤7)中，未加入胱氨 酸，替换为同等质量的水，其余原料配比不变。
90.对比例5
91.与实施例3基本相同，唯有不同的是，步骤7)中，未加入葡萄 糖酸钙，替换为同等质量的水，其余原料配比不变。
92.对比例6
93.与实施例3基本相同，唯有不同的是，步骤7)中，未加入氯化 钙溶液，替换为同等质量的水，其余原料配比不变。
94.对比试验
95.1.鱼皮鱼鳞脱腥试验：
96.将实施例3与对比例1中步骤1)的原浆原料利用固相微萃取结 合气质联用技术，对鱼皮鱼鳞中主要产生腥气的醛类、酮类、醇类成 分进行含量检测，检测结果如表1所示。
97.表1检测结果
[0098][0099][0100]
鱼类的腥味主要是由于挥发性炭基化合物和醇类引起，如己醛具 有明显的青草味，一般被认为是鱼腥味的代表物质，壬醛具有鱼腥味； 酮类物质是由不饱和脂肪酸氧化产生的，酮类阈值比醛类高些，由于 存在相互作用，会产生其他不良气味，并且对腥味有一定的增强作用； 醇类对腥味也有一定增强作用。
[0101]
由表1可以看出，经微酸洗、微碱洗处理后的实施例3，醛类物 质脱腥处理后，其中对比例1中己醛百分含量为7.69％，而实施例3 为3.56％，其他醛类成分均显著下降；酮类物质中，对比例1的6
‑ꢀ
甲基-5-庚烯2-酮的百分比含量3.42，实施例3为1.12，其他醛类物 质含量也均显著降低，醇类物中，对比文件1中的苯乙醛百分比含量 为2.58，实施例3为0.79，其他醇类物质含量也均显著降低。
[0102]
由此可见，经过本发明的微酸洗、微碱洗后，能够显著脱去鱼皮 鱼鳞的腥气，从而使制得的胶原蛋白肽气味良好。
[0103]
这是由于微酸洗和微碱洗后，鱼皮鱼鳞中的蛋白质会展开，原本 与蛋白质结合的腥味成分，就会与蛋白质分离，在漂洗的过程中会被 冲洗掉。且酸和碱能够溶解脂质和色
素等，减少了因脂肪氧化分解产 生腥味；此外，醋酸属于有机酸，具有抑菌的效果，能够抑制微生物 分解脂肪产生腥味，并且可脱除组胺等呈腥物质，能使鱼中醛类、酯 类、醇类化合物含量显著降低。
[0104]
2.酶水解效果试验
[0105]
采用opa法对实施例1-3与对比例2-6测定2h时步骤7)中 木瓜蛋白酶的水解度；采用三氯乙酸可溶性氮法测定实施例1-3 与对比例2-6的产品得率，结果如表2所示。
[0106]
表2水解度、产品得率试验
[0107][0108][0109]
由表2可以看出，未使用超声波处理的对比例2，酶水解度和产 品得率相对于实施例1-4均有所下降，这是由于超声波可以使原料细 胞打开，使原料易于溶解，从而能够提高胶原蛋白的提取率，还能使 原料胶原蛋白自由基清除率增大，有利于鱼鳞鱼皮胶原的水解和酶解 反应的进行。
[0110]
实施例3相较于对比例3，酶水解度上升了10.7％，产品得率上 升了14.13％；
[0111]
对比例4相较于对比例3，酶水解度上升了2.8％，产品得率上升 了4.51％；
[0112]
对比例5相较于对比例3，酶水解度上升了2.3％，产品得率上升 了3.63％；
[0113]
对比例6相较于对比例3，酶水解度上升了3.1％，产品得率上升 了3.39％；
[0114]
则，使用胱氨酸、葡萄糖酸钙、氯化钙溶液共同叠加产生的效果 为，酶水解度：10.7％，产品得率14.13％；而使用胱氨酸、葡萄糖酸 钙、氯化钙溶液分别产生的效果为，酶水解度：2.8+2.3+3.1＝8.2％＜1 0.7％，产品得率：4.51+3.36+3.39＝11.26＜14.12，且(10.7-8.2)
÷
8. 2
×
100％＝30％；(14.13-11.26)
÷
11.26
×
100％＝25.5％。由此可见， 胱氨酸、葡萄糖酸钙、氯化钙溶液产生了协同作用，能够使酶水解度 增加，提高酶解能力，从而使产率提升，增加经济效益。
[0115]
这是由于加入胱氨酸能够使木瓜蛋白酶活性中心的疏基不被氧 化形成二硫键，防止酶失活；氯化钙可通过与木瓜蛋白酶的配体配位 结合，形成具有活性的区域，使酶的结构发生改变，增加酶的活性； 葡萄糖酸钙不仅能起到激活酶的作用，且还能够起到保护作用，能够 使酶保持活力；酶、胱氨酸、葡萄糖酸钙、氯化钙协同反应，能够使 酶解利用率提高，酶解更充分。
[0116]
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制 本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴 下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有 通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一 切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。