1.本发明涉及分子生物学领域，更具体地说，它涉及一种神经胶质瘤标志物及核酸适配体的筛选方法。


背景技术：

2.神经胶质瘤是最常见的原发性中枢神经系统肿瘤，约占所有颅内原发肿瘤的一半。在临床中神经胶质瘤的诊断主要依赖影像学和病理学诊断，由于缺乏神经胶质瘤的特征性分子标志物，对其早期诊断与治疗仍存在较多困难与挑战。利用传统的筛查技术去寻找分子标志物尤如大海捞针，待测样本数量庞大且生物大分子信息繁杂，而且目前也缺少高效的筛选策略及工具。
3.核酸适配体，是一种单链寡核苷酸，由人工合成的随机核苷酸文库中，利用配体指数富集系统进化技术获得的，具有高亲和力，能够特异性识别靶标分子并与之紧密地结合在一起，具有靶标范围广、高亲和力和高特异性、制备和修饰方便、分子量小且肿瘤穿透能力强、免疫原性小和无毒性、批次间差异小，稳定性好等优点。
4.基于细胞筛选的selex技术，以完整的细胞为靶标，无需对靶细胞的分子特征有先验认识，能筛选出与靶细胞相结合的高亲和力、高特异性核酸适配体，该核酸适配体能够区分细胞所处的某种状态，如分化与否、是正常细胞还是癌细胞等，在神经胶质瘤诊断、治疗和其标志物发现方面具有极大潜能。传统的cell-selex筛选技术流程仍相当复杂，文库的构建、pcr检测及纯化、细胞的分离及靶标分子的捕获，均需要相当熟练的实验技巧及精密昂贵的仪器支持，利用cell-selex技术进行肿瘤标志物的筛选依然费时费力，且实验过程极易受到污染而无效。


技术实现要素：

5.针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种神经胶质瘤标志物及核酸适配体的筛选方法，具有实验操作简便、筛选高效快速等优点，在神经胶质瘤的早期诊断、精准的个性化治疗、药物靶向递送，并获得良好的预后等方面发挥重要的作用。
6.本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：构造一种神经胶质瘤标志物及核酸适配体的筛选方法，包括以下步骤：
7.第一步，cell-selex文库的构建，通过mflod软件设计dna文库，包含18～20个碱基的前、后引物区以及含45～50个碱基的随机核苷酸区；
8.第二步，用于分离捕获的功能化磁性纳米颗粒的制备，首先通过软模板法和stober法合成粒径分别为100～200nm和500～600nm磁性纳米颗粒，然后在磁性纳米颗粒表面修饰羧基，与链霉亲和素进行结合，最后与生物素标记的抗体或者核酸适配体孵育，制备得到不同的功能化磁性纳米颗粒；
9.第三步，神经胶质瘤特异性标志物及其核酸适配体的筛选，首先以抗体修饰的免疫磁性纳米颗粒捕获悬浮的神经胶质瘤细胞作为靶标，以捕获的正常神经细胞作为阴性筛
选靶标，加入生物素和荧光基团标记的dna文库进行捕获、富集和筛选，通过检测荧光信号实时评估核酸适配体的富集效率，然后对筛选出来的核酸适配体文库进行测序、二级结构模拟分析，最后用流式细胞仪筛选出亲和力和特异性最强的核酸适配体；
10.第四步，肿瘤标志物的分离与鉴定，将筛选得到的核酸适配体修饰磁性纳米颗粒后与细胞裂解液孵育捕获肿瘤标志物即神经胶质瘤细胞膜蛋白，通过磁场分离得到纯化的神经胶质瘤细胞膜蛋白，最后通过质谱技术鉴定。
11.通过采用上述技术方案，简化了传统的cell-selex筛选技术流程，实验操作简便，能够高效针对神经胶质瘤细胞筛选出特异性识别的核酸适配体，从而分离出神经胶质瘤标志物，在神经胶质瘤的早期诊断、精准的个性化治疗、药物靶向递送，并获得良好的预后等方面发挥重要的作用。
12.作为优选，本发明所述的功能化磁性纳米颗粒，粒径为100～200nm的磁性纳米颗粒用于修饰抗体或者核酸适配体后捕获神经胶质瘤细胞及其膜蛋白，粒径为500～600nm的磁性纳米颗粒用于修饰链霉亲和素后与生物素标记的dna文库结合，富集筛选核酸适配体。
13.通过采用上述技术方案，利用不用粒径的功能化磁性纳米颗粒，快速分离dna、蛋白质和细胞，优化cell-selex筛选技术流程，实现神经胶质瘤标志物的高效快速筛选。
14.作为优选，本发明所述的第一步cell-selex文库的构建步骤，以神经胶质瘤细胞作为靶细胞，以正常神经胶质瘤细胞作为对照细胞，经过施加不同的筛选条件，使dna文库不断富集；对筛选文库扩增的退火温度进行优化，选择最佳退火温度。将dna初始库及引物序列通过利用梯度pcr，共设置了12～15个温度梯度，然后将pcr扩增产物在3％～5％琼脂糖凝胶中进行电泳，通过凝胶成像系统分析产物条带，从而选择本实验所使用的最佳退火温度。
15.通过采用上述技术方案，优化pcr扩增步骤得到最佳褪火温度，提高pcr的扩增效率，进一步优化dna文库，获得可稳定使用的文库试剂盒，提高核酸适配体筛选的成功率。
16.作为优选，本发明所述的第三步，具体步骤包括：利用体外配体指数富集系统进化(selex)技术对特异性结合胶质瘤细胞蛋白的核酸适配体进行多轮阳性筛选，采用正常神经细胞进行阴性筛选，利用磁分离对结合胶质瘤细胞蛋白的核酸适配体和未结合的游离核酸进行分离，采用不对称pcr扩增的方法得到单一的ssdna，对筛选得到的产物进行克隆测序，并将测序所得的适体除去上下游引物后进行和首轮ssdna文库对比的亲和性检测，最后进行二级结构分析。
17.作为优选，本发明所述的阴性筛选，具体步骤包括：首先将1.5ml离心管用1％～5％的bsa于4～10℃封闭过夜，设为空白反筛管；首轮取0.5～2od的ssdna文库于95℃热变性5～10min，4℃下迅速冷却10～15min，与空白反筛管于37℃孵育1～2h。
18.作为优选，本发明所述的阳性筛选，具体步骤包括：取结合胶质瘤细胞蛋白的磁珠150～200μl，磁分离后去除上清液，与dna文库和结合缓冲液混合，37℃温和振动反应1～2h；磁分离，用缓冲液洗涂5～10次，洗去未结合的ssdna；加入去离子水150～200μl，100℃水浴加热10～20min，洗脱与靶蛋白结合的ssdna，磁分离后吸取上清液，测定dna含量，-20℃保存。
19.采用上述技术方案，结合功能化磁性纳米颗粒快速分离特异性结合神经胶质瘤细胞的核酸适配体和游离核酸，同时加入阴性筛选进一步提高了筛选效率。
20.作为优选，本发明第三步筛选得到核酸适配体文库后，以平衡解离常数kd值来衡量核酸适配体对细胞的亲和力，将所合成的序列与正筛细胞神经胶质瘤细胞结合，采用流式细胞技术分析其与神经胶质瘤细胞结合的差异，从中选出最优化的dna序列；将一系列浓度梯度的带荧光基团标记的适配体分别与3
×
105～4
×
105个神经胶质瘤细胞在4～10℃下孵育30～50min，然后用洗涤缓冲液充分洗涤3～6次后，用细胞刮将细胞-dna复合物刮下并重悬在250～300μl结合缓冲液中进行流式细胞分析，使用未经筛选的初始库作为背景对照。调节细胞大小参数以及激光电压，使背景细胞平均荧光值为双位数。分别记录10000～20000个细胞，记录平均荧光值，然后计算每条序列的kd值。最后进行核酸适配体的特异性分析，将浓度为250～300nm标记有荧光基团的适配体分别与正筛及反筛细胞，以及其他多种人类正常细胞、肿瘤细胞在4～10℃下孵育30～50min，然后用洗涤缓冲液充分洗涤3～6次后，用细胞刮将细胞-dna复合物刮下并重悬在250～300μl结合缓冲液中进行流式细胞术分析，使用未经筛选的初始库作为背景对照。
21.通过采用上述技术方案，通过检测荧光信号实时评估核酸适配体的富集效率以及特异性结合神经胶质瘤细胞的能力，确保每一步筛选流程的正常进行，最终得到单一的、特异性强的神经胶质瘤细胞核酸适配体。
22.作为优选，本发明筛选得到的核酸适配体通过在胶质瘤细胞适体上修饰荧光基团，在其互补序列上修饰荧光淬灭基团，构建的荧光适配体传感器可用于检测神经胶质瘤细胞。
23.通过采用上述技术方案，实现了对神经胶质瘤细胞快速检测的目的。
24.综上所述，本发明具有以下有益效果：
25.其一，通过制备功能化磁性纳米颗粒，简化了传统的cell-selex筛选技术流程，实验操作简便；
26.其二，不同粒径大小的功能化磁性纳米颗粒有针对性地快速分离dna、蛋白质和细胞，优化了cell-selex筛选技术流程，实现神经胶质瘤标志物的高效快速筛选；
27.其三，本筛选方法得到核酸适配体对神经胶质瘤有强的特异性识别作用，能够实现对胶质瘤细胞蛋白快速检测，在神经胶质瘤的早期诊断、精准的个性化治疗、药物靶向递送，并获得良好的预后等方面发挥重要的作用。
附图说明
28.图1是根据本发明的优选实施例的一种神经胶质瘤标志物及核酸适配体的筛选方法的流程图；
29.图2是根据本发明的优选实施例的一种神经胶质瘤标志物筛选实验流程图；
30.图3是根据本发明的优选实施例的一种神经胶质瘤标志物筛选实验的每轮阳性筛选与阴性筛选的保留率变化图；
31.图4是是根据本发明的优选实施例的一种神经胶质瘤标志物筛选得到的核酸适配体与不同浓度神经胶质瘤细胞结合的荧光光谱图；
32.图5是是根据本发明的优选实施例的一种神经胶质瘤标志物筛选得到的核酸适配体与不同浓度神经胶质瘤细胞结合的线性关系图。
具体实施方式
33.下面结合附图和实施例，对本发明进行详细描述。
34.本发明的一种神经胶质瘤标志物及核酸适配体的筛选方法,如图1所示，具体包括以下步骤：
35.第一步，cell-selex文库的构建，通过mflod软件设计dna文库，包含18个碱基的前、后引物区以及含45个碱基的随机核苷酸区；
36.第二步，用于分离捕获的功能化磁性纳米颗粒的制备，首先通过软模板法和stober法合成粒径分别为100nm和500nm磁性纳米颗粒，然后在磁性纳米颗粒表面修饰羧基，与链霉亲和素进行结合，最后与生物素标记的抗体或者核酸适配体孵育，制备得到不同的功能化磁性纳米颗粒；
37.第三步，神经胶质瘤特异性标志物及其核酸适配体的筛选，首先以抗体修饰的免疫磁性纳米颗粒捕获悬浮的神经胶质瘤细胞作为靶标，以捕获的正常神经细胞作为反筛靶标，加入生物素和荧光基团标记的dna文库进行捕获、富集和筛选，通过检测荧光信号实时评估核酸适配体的富集效率，然后对筛选出来的核酸适配体文库进行测序、二级结构模拟分析，最后用流式细胞仪筛选出亲和力和特异性最强的核酸适配体；
38.第四步，肿瘤标志物的分离与鉴定，将筛选得到的核酸适配体修饰磁性纳米颗粒后与细胞裂解液孵育捕获肿瘤标志物即神经胶质瘤细胞膜蛋白，通过磁场分离得到纯化的神经胶质瘤细胞膜蛋白，最后通过质谱技术鉴定。
39.本发明的第三步神经胶质瘤特异性标志物及其核酸适配体的筛选流程如图2所示，具体包括以下步骤：
40.利用体外配体指数富集系统进化(selex)技术对特异性结合胶质瘤细胞蛋白的核酸适配体进行多轮阳性筛选，采用正常神经细胞蛋白进行阴性筛选，利用磁分离对结合神经胶质瘤细胞蛋白的核酸适配体和未结合的游离核酸进行分离，采用不对称pcr扩增的方法得到单一的ssdna，对筛选得到的产物进行克隆测序，并将测序所得的适体除去上下游引物后进行和首轮ssdna文库对比的亲和性检测，最后进行二级结构分析。
41.阴性筛选的具体步骤包括：首先将1.5ml离心管用1％的bsa于4℃封闭过夜，设为空白反筛管；首轮取2od的ssdna文库于95℃热变性10min，4℃下迅速冷却15min，与空白反筛管于37℃孵育2h。
42.阳性筛选的具体步骤包括：取结合神经胶质瘤细胞蛋白的磁珠200μl，磁分离后去除上清液，与dna文库和结合缓冲液混合，37℃温和振动反应1h；磁分离，用洗涂缓冲液洗涂5次，洗去未结合的ssdna；加入去离子水200μl，100℃水浴加热10min，洗脱与靶蛋白结合的ssdna，磁分离后吸取上清液，测定dna含量，-20℃保存。
43.本发明共进行8轮筛选，阳性筛选步骤的神经胶质瘤细胞浓度从初始的100μm降低至10μm，每两轮降低一次浓度。从第三轮开始引入阴性筛选步骤，正常神经细胞的浓度从10μm升高至50μm。每轮阳性筛选与阴性筛选的保留率变化如图3所示，对神经胶质瘤细胞具有亲和力的dna序列逐渐富集，而对正常神经细胞具有亲和力的序列逐渐减少，以提高dna文库中核酸适配体的特异性。
44.本发明筛选得到的核酸适配体修饰荧光基团，在其互补序列上修饰荧光淬灭基团，构建的荧光适配体传感器可用于检测神经胶质瘤细胞。
45.图4和图5为不同浓度神经胶质瘤细胞与核酸适配体结合的荧光光谱图和线性关系图。将制备的荧光适配体传感器分别与不同浓度的神经胶质瘤细胞(0.1～50μm)进行洗脱，记录所发生的荧光强度变化，并根据公式进行非线性拟合，公式为：f＝n
max
*x/(kd+x)。依据拟合结果，得出该核酸适配体kd值为2.02
±
0.48μm。观察各荧光点分布，线性关系在0.1～2.0μm间线性相关度最高，r2＝0.989。
46.以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。