1.本发明属于生物技术领域，具体而言，涉及一种比酶活提高的中性玉米赤霉烯酮降解酶突变体及其编码基因，以及其在水解玉米赤霉烯酮中的应用。


背景技术：

2.玉米赤霉烯酮(zearalenone，简称zen)，又称f-2毒素，最初是从患赤霉病的玉米中分离得到的，是可以由许多镰孢属物种产生的一种非甾体雌激素霉菌毒素，作物在收获前后都会产生。玉米赤霉烯酮总是在包括玉米、大麦、小麦等许多作物和谷类副产品中被发现，尤其是在适合真菌生长的环境中。
3.zen作为世界上污染粮食最广泛的真菌毒素之一，在世界各地的谷物及其副产品中都检测到了zen。zen具有分布广、繁殖快、毒性大等特点，能够通过污染农作物进而危害人和动物的生命健康。zen的化学结构类似于天然雌激素，因此能够竞争性地结合雌激素受体，引起外部和内部生殖器改变和繁殖障碍，导致高雌性激素症和不孕症，此类毒素还会刺激乳腺癌细胞系的生长并在小鼠中致癌。
4.鉴于此类毒素的危害，大部分国家对粮食或饲料中的zen含量制定了严格标准。由于zen的稳定性较高，使用传统的物理和化学方法去除此类毒素的效率极低。为了解决该问题，酶降解成为降低此类毒素污染的一个有希望的策略。酶降解不仅可以高效地将毒素转化为无毒性产物，安全环保，而且酶催化反应专一性强、降解效率高，不会破坏谷物的营养物质。
5.迄今为止，已经有一些对于玉米赤霉烯酮降解酶的研究，得到了一些可以降解zen毒素的酶，它们能够特异性地结合zen并且降解它。本发明人曾研究获得了三种玉米赤霉烯酮降解酶，如cn107099520a公开了一种玉米赤霉烯酮降解酶zhd518，cn108085306a公开了一种玉米赤霉烯酮降解酶zhday3及其突变体，本发明人曾发表的论文(wang m,yin l,hu h,nimal s j,zhou y,&zhang g.expression,functional analysis and mutation of a novel neutral zearalenone-degrading enzyme[j].international journal of biological macromolecules,2018,118:1284-1292.)，通过结构分析获得了突变体zhd518(n156h)，简称为突变体1m，对于底物玉米赤霉烯酮的酶活是野生型的1.18倍。然而，以上所得玉米赤霉烯酮降解酶的比酶活仍然不够理想。


技术实现要素：

[0006]
鉴于现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种与中性玉米赤霉烯酮降解酶的比酶活提高显著关联的突变位点，以及一种比酶活提高的中性玉米赤霉烯酮降解酶突变体及其编码基因，以及其在水解玉米赤霉烯酮中的应用。
[0007]
为了实现本发明的目的，发明人通过大量试验研究并不懈努力，最终在玉米赤霉烯酮降解酶突变体1m的基础上，采用定点突变技术获得编码突变体的基因，随后将编码突变体的基因位点进行重组表达，获得了一种比酶活提高的中性玉米赤霉烯酮降解酶突变
体。具体地，本发明的技术方案概况如下：
[0008]
一种突变位点在提高玉米赤霉烯酮降解酶突变体1m的比酶活中的应用，所述的玉米赤霉烯酮降解酶突变体1m的氨基酸序列如有seq id no.6所示，所述突变位点位于所述玉米赤霉烯酮降解酶突变体1m的144氨基酸处，是将144位点的缬氨酸突变为甘氨酸。
[0009]
另外，本发明也可以在野生型玉米赤霉烯酮降解酶的基础上，进行n156h和v144g两处定点突变，从而获得了一种比酶活提高的中性玉米赤霉烯酮降解酶突变体。因此，本发明还保护一种突变位点在提高野生型玉米赤霉烯酮降解酶的比酶活中的应用，所述的野生型玉米赤霉烯酮降解酶的氨基酸序列如有seq id no.5所示，所述突变位点位于所述野生型玉米赤霉烯酮降解酶的144和156氨基酸处，是将144位点的缬氨酸突变为甘氨酸，156位点的天冬酰胺突变为组氨酸。
[0010]
一种比酶活提高的中性玉米赤霉烯酮降解酶突变体，该降解酶具有序列表中seq id no.1所示的氨基酸序列；或该降解酶是在seq id no.1所示的氨基酸序列基础上缺失、替换、插入或/和添加一个至几个氨基酸的保守性突变而获得的保守性变异体。
[0011]
需要说明的是，本发明所提供的中性玉米赤霉烯酮降解酶突变体是一种内酯水解酶。seq id no.1所示的氨基酸序列由266个氨基酸残基组成，主要是将中性玉米赤霉烯酮降解酶zhd518突变体1m的第144位点的缬氨酸val突变成甘氨酸gly，所得突变体是zhd518(n156h/v144g)，命名为2m。
[0012]
为了使上述降解酶突变体蛋白质便于纯化，可在上述氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
[0013]
表1标签的序列
[0014][0015][0016]
上述降解酶突变体蛋白质可以人工合成，也可通过在野生型中性玉米赤霉烯酮降解酶zhd518(cn107099520a)或突变体1m的基础上定点突变的方法获得含有编码基因的载体，再进行生物表达得到。上述中性玉米赤霉烯酮降解酶突变体的编码基因还可通过将seq id no.1所示的氨基酸序列中，缺失、置换、插入或添加一个至几个并保持原有酶活性，或者连上表1所示的标签的编码序列得到。
[0017]
另外，本发明还提供了一种比酶活提高的中性玉米赤霉烯酮降解酶突变体的编码基因，该基因编码：
[0018]
(a)具有seq id no.1所示的氨基酸序列的蛋白质；
[0019]
(b)具有衍生自缺失、置换、插入或/和添加一个至几个氨基酸的seq id no.1所示
的氨基酸序列并具有玉米赤霉烯酮降解活性的蛋白质。
[0020]
进一步，所述玉米赤霉烯酮降解酶突变体的编码基因为(i)、(ii)或(iii)的dna分子：
[0021]
(i)具有seq id no.2所示的核苷酸序列的dna分子；
[0022]
(ii)在严格条件下与(i)所述的核苷酸序列杂交且编码具有玉米赤霉烯酮降解活性的蛋白质的dna分子；
[0023]
(iii)与(i)或(ii)所述的核苷酸序列具有90％以上同源性的核苷酸序列的dna分子。
[0024]
进一步，所述严格条件为钠浓度50-300mm的溶液中，反应温度50-68℃。
[0025]
本发明还提供一种重组载体，该重组载体包含上述的玉米赤霉烯酮降解酶突变体的编码基因。具体的，所述重组载体为上述任一所述编码基因插入出发载体(例如：pet28a)的多克隆位点得到的重组表达载体。可用现有的表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。使用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，它们可单独使用或与其它的启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是atg起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。
[0026]
本发明还提供一种转化体，该转化体包含上述的重组载体。转化体可以为重组菌，例如，将上述任一所述编码基因插入出发载体(例如：pet28a载体)的多克隆位点得到的重组表达载体转化至大肠杆菌bl21(de3)，得到重组菌。
[0027]
本发明还提供一种引物对，用于在重组表达载体构建的时候，以突变体1m为模板，通过反向聚合酶链式反应扩增获得含上述中性玉米赤霉烯酮降解酶突变体的编码基因全长的重组载体。例如：引物对的序列如seq id no.3和seq id no.4所示。
[0028]
上述任一所述蛋白质、上述任一所述编码基因、上述任一所述重组表达载体、所述表达盒、转基因细胞系或在降解玉米赤霉烯酮中的应用属于本发明的保护范围。
[0029]
在具体应用的过程中，可以采用下面的方法：以玉米赤霉烯酮为底物，在最适ph8.0、最适温度40℃条件下，利用玉米赤霉烯酮降解酶突变体对玉米赤霉烯酮进行酶解。需要说明的是，本发明所述的酶解条件ph8.0和温度40℃为最适ph和最适温度，但所有的酶解条件包括：反应体系的温度30-50℃，优选为40℃，反应体系的ph值为6.0-9.0，优选为8.0，均属于本发明的保护范围。
[0030]
本发明还提供了一种生产玉米赤霉烯酮降解酶突变体的方法，该方法包括培养上述的转化体并由培养产物中收集玉米赤霉烯酮降解酶突变体。收集的玉米赤霉烯酮降解酶突变体可以进一步进行纯化。
[0031]
需要说明的是，本发明提供的蛋白具有玉米赤霉烯酮降解活性，称为玉米赤霉烯酮降解酶。本发明所提供的中性玉米赤霉烯酮降解酶突变体最适天然底物玉米赤霉烯酮，在最适ph8.0、最适温度40℃条件下表现出更高的比酶活。
[0032]
与现有技术相比，本发明所提供的中性玉米赤霉烯酮降解酶突变体具有如下优点和显著进步：
[0033]
在本发明前发表的论文中，发明人获得了突变体zhd518(n156h)，简称为突变体1m，其对于底物玉米赤霉烯酮的酶活是野生型的1.18倍。在此基础上，本发明人对野生型中性玉米赤霉烯酮降解酶zhd518的3d结构进行分析，找到了可能影响比酶活的一些位点，并通过定点突变的方法改造中性玉米赤霉烯酮降解酶基因，最终获得了突变体2m，使得所编码的中性玉米赤霉烯酮降解酶突变体2m的比酶活显著增强。因此，本发明提供的中性玉米赤霉烯酮降解酶突变体2m在玉米赤霉烯酮降解酶zhd518(cn107099520a)的基础上经过两个定点(n156h和v144g)突变，具体试验数据显示，突变体2m对于底物玉米赤霉烯酮的比酶活为481.8u/mg，是野生型酶活的3.3倍。这是一个全新的特性，说明本发明中涉及的突变具有唯一性、独特性，对于工业上的生产应用非常具有潜力。
附图说明
[0034]
图1为玉米赤霉烯酮降解酶突变体2m蛋白纯化后的sds-page电泳图。
[0035]
图2为玉米赤霉烯酮降解酶突变体2m的酶活力相对于野生型的提高结果。
[0036]
图3为玉米赤霉烯酮降解酶突变体1m-v30i、1m-y187r、1m-v207r、1m-s216y、1m-t238y的酶活力相对于野生型的对比结果。
具体实施方式
[0037]
以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0038]
实施例1、蛋白及基因的制备与纯化
[0039]
1、重组表达载体的构建
[0040]
本发明提供的中性玉米赤霉烯酮降解酶突变体2m，是在中性玉米赤霉烯酮降解酶zhd518(cn107099520a)的突变体1m的重组表达载体pet28a-zhd518(n156h)基础上通过定点突变获得的，因此本发明中的重组表达载体的构建是通过整个环状质粒pet28a-zhd518(n156h)的反向聚合酶链式反应扩增进行突变。v144g的诱变引物是：v144g-f(5'ccacgagggcgaccctgccac3')，如seq id no.3所示；v144g-r(5'gggtcgccctcgtggatatgcag3')，如seq id no.4所示。
[0041]
反向聚合酶链式反应扩增基因的pcr反应体系：
[0042][0043]
[0044]
pcr反应条件：94℃预变性5min，然后94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸7min，15个循环，最后72℃延伸10min。
[0045]
pcr产物用0.7％琼脂糖凝胶电泳检测产量和特异性，并用dna纯化试剂盒纯化。琼脂糖电泳回收纯化pcr产物，之后用dpni酶处理以除去模板链，电击转化大肠杆菌dh5α感受态细胞后涂布于含有50μg/ml卡那霉素的lb平板，37℃过夜培养，将得到的转化子进行测序验证。结果表明，144位的v被突变成g,而其他位置未发生突变，该重组载体上携带有seq id no.2所示的核苷酸序列，seq id no.2所示的核苷酸序列编码seq id no.1所示的突变体，该重组质粒被命名为pet28a-2m。
[0046]
值得说明的是，本发明人对野生型中性玉米赤霉烯酮降解酶zhd518的3d结构进行分析，找到了可能影响比酶活的几个位点，并通过定点突变的方法改造中性玉米赤霉烯酮降解酶基因，获得的最好突变体为2m。另外，本发明人找到的可能影响比酶活的实验位点还包括v30i、y187r、v207r、s216y、t238y，以上位点也均在突变体1m的基础上通过定点突变的方法分别获得的，分别被命名为1m-v30i、1m-y187r、1m-v207r、1m-s216y、1m-t238y。
[0047]
2、工程菌的制备
[0048]
将质粒pet28a-2m电击转化大肠杆菌bl21(de3)(cat.n0 cd601,全式金公司)后涂布于含有50μg/ml卡那霉素的lb平板，37℃过夜培养，得到含有质粒pet28a-2m的工程菌，记作bl21/pet28a-2m。
[0049]
用pet28a代替pet28a-2m，转化大肠杆菌bl21(de3)，步骤同上，得到含有pet28a的重组菌，作为对照菌。将转入bl21(de3)的阳性重组菌记作bl21/pet28a。
[0050]
3、目标蛋白的表达和纯化
[0051]
his60 ni superflow resin纯化柱购自takara公司，产品目录号为635660。
[0052]
ge hitrap desalting纯化柱购自ge healthcare公司，产品目录号分别为17-1408-01。
[0053]
将上述步骤2制备的阳性重组菌bl21/pet28a-2m培养于含有50μg/ml卡那霉素的lb培养基中，37℃培养3h；od
600
＝0.7时，加入iptg至其在lb培养基中的终浓度0.8mm，转至18℃继续培养16h。
[0054]
在3800rpm、15min条件下离心收集菌体，悬浮于缓冲溶液a(50mm tris-hcl缓冲液，ph8.0)中，于冰浴中超声破碎(60w，10min；超声1s，停止2s)，之后12000rpm离心10min除去细胞碎片，取上清液；将上清液过his60 ni superflow resi n纯化柱，用5ml超纯水冲洗，再用10ml溶液b(50mm tris-hcl缓冲液，ph8.0，25mm咪唑，150mm nacl)漂洗，最后用5ml溶液c(50mm tris-hcl缓冲液，ph8.0，500mm咪唑，150mm nacl)洗脱，收集洗脱液。然后将洗脱液用脱盐柱ge hitrap desalting进行脱盐处理，用溶液a(50mm tris-hcl缓冲液，ph8.0)进行洗脱，得到2m纯酶液。
[0055]
将步骤2制备的对照菌采用相同的步骤进行培养和纯化，得到的溶液作为对照酶液。
[0056]
sds-page电泳显示纯化的2m蛋白的分子量约为30kda，符合理论推断的29.3kda。结果如图1所示，图1中，泳道m表示蛋白分子量标准(250,150，100,75,50,37,25，15,10kda)；泳道1表示大肠杆菌bl21/pet28a-2m破菌后的上清液通过ni-nta柱纯化、ge desalting脱盐柱纯化后的2m蛋白，显示获得了2m蛋白。同时进行了对照组的实验，但对照
菌并没有得到目的蛋白。
[0057]
值得说明的是，根据实验位点(v30i、y187r、v207r、s216y、t238y)获得的突变体分别是1m-v30i、1m-y187r、1m-v207r、1m-s216y、1m-t238y。实施同样的重组表达载体构建、工程菌的制备、目标蛋白的表达和纯化。
[0058]
实施例2、中性玉米赤霉烯酮降解酶突变体2m与野生型中性玉米赤霉烯酮降解酶蛋白的比酶活比较
[0059]
一、玉米赤霉烯酮降解酶酶活的测定方法
[0060]
酶活单位定义为1min内降解1μg底物玉米赤霉烯酮所需要的酶量作为一个酶活单位u。
[0061]
用ph8.0的50mm tris-hcl缓冲液稀释实施例1的步骤5中的2m纯酶液，用稀释后的酶液进行酶活测定。将稀释后的酶液记作稀释酶液。
[0062]
溶液a组成：由50mm，ph8.0的50mm tris-hcl缓冲液和玉米赤霉烯酮溶液组成；底物玉米赤霉烯酮在反应体系0.5ml中的终浓度为20.0μg/ml。
[0063]
实验组：活性测定反应体系为0.5ml，由0.45ml溶液a和0.05ml稀释酶液；反应体系的ph值为8.0；反应体系在40℃温育10min后，0.5ml色谱级甲醇终止反应，冷却后使用高效液相色谱仪(hplc)测定底物降解量。
[0064]
二、蛋白浓度测定方法
[0065]
根据bio-rad quick starttm bradford protein assay kit(购自bio-rad公司，货号no.：5000201)使用说明，取纯的bsa小牛血清蛋白，根据其纯度同ph8.0的50mm tris-hcl缓冲液配制成0.5mg/ml蛋白溶液。吸取标准蛋白溶液0、1、2、4、8、12、16和20μl，用ph8.0的50mm tris-hcl缓冲液定容至20μl；样品蛋白与ph8.0的50mm tris-hcl缓冲液以一定比例混合，总体积为20μl。取5μl蛋白溶液与200μl 1x dye reagent反应5min，在595nm处测定吸光度od值，绘制蛋白浓度与od595的标准曲线。
[0066]
三、比酶活比较
[0067]
利用实验测得酶活除以蛋白浓度得到比酶活，实验结果如图2显示，图2表明，玉米赤霉烯酮降解酶突变体2m具有降解玉米赤霉烯酮的活性。在ph8.0、40℃条件下，以野生型玉米赤霉烯酮降解酶蛋白zhd518在酶反应体系的底物玉米赤霉烯酮降解量作为相对活性100％，突变体2m在酶活反应体系的底物玉米赤霉烯酮降解量与野生型蛋白在酶活反应体系的底物玉米赤霉烯酮降解量的比值作为相对活性。结果显示：在ph8.0、40℃条件下，玉米赤霉烯酮降解酶突变体2m对于底物玉米赤霉烯酮的酶活性是野生型的3.3倍(图2)。
[0068]
对照组：以对照菌bl21/pet28a获得的蛋白(记作对照酶液)进行上述实验，结果显示对照酶液没有降解玉米赤霉烯酮的活性。
[0069]
实验设3次重复，结果一致。
[0070]
实验位点(v30i、y187r、v207r、s216y、t238y)获得的玉米赤霉烯酮降解酶突变体分别是1m-v30i、1m-y187r、1m-v207r、1m-s216y、1m-t238y。对这些位点进行上述的酶活比较，结果显示与野生型或突变体1m相比，均没有显著提高的比酶活，甚至酶活降低。具体结果显示：在ph8.0、40℃条件下，玉米赤霉烯酮降解酶突变体1m-v30i、1m-y187r、1m-v207r、1m-s216y、1m-t238y对于底物玉米赤霉烯酮的比酶活是野生型的90％、63％、66％、89％、64％(图3)。
[0071]
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。