重组长牡蛎焦孔素蛋白rcggsdme-n、制备方法及其应用
技术领域
1.本发明属于分子生物学技术领域，尤其涉及一种重组长牡蛎焦孔素蛋白rcggsdme-n、制备方法及其应用。


背景技术：

2.gasdermin（gsdm）家族是一大类含有保守的gasdermin-n结构域的焦孔素蛋白，主要成员包括gsdme、gsdma、gsdmb、gsdmc、gsdmd和pejvakin（pjvk）等。目前研究发现，gasdermin 家族成员在介导细胞焦亡、炎症反应等过程中发挥重要作用。gsdmd、gsdma3和 gsdma的gasdermin-n结构域具有结合膜脂、磷酸肌醇和心磷脂以及破坏磷脂膜等功能。gasdermin-n还含有裂解的磷酸肌醇/心磷脂的脂质体，并能在人造或天然的磷脂膜上打孔，所造成的孔内径为10-14 nm。gsdme的gasdermin-n结构域介导的程序性细胞死亡具有明显的形态学特征，并影响质膜通透性和水的流入，导致细胞肿胀，出现典型的气泡和渗透性裂解。高等动物的gsdm主要在治疗恶性肿瘤、神经系统疾病及激活抗菌免疫反应中具有潜在的应用价值。在无脊椎动物中，目前仅在珊瑚中发现了gsdme，但未发现其具有抗菌免疫功能。迄今为止未见关于重组长牡蛎焦孔素蛋白rcggsdme-n、制备方法及其应用的相关报道。


技术实现要素：

3.本发明是为了解决现有技术所存在的上述问题，提供一种重组长牡蛎焦孔素蛋白rcggsdme-n、制备方法及其应用本发明的技术解决方案是：一种重组长牡蛎焦孔素蛋白rcggsdme-n，氨基酸序列特征如seq id no. 1所示。
4.一种上述重组长牡蛎焦孔素蛋白rcggsdme-n的制备方法，依次按照如下步骤进行：a. 用引物p1和p2对长牡蛎cggsdme-n编码区片段进行pcr扩增，所述引物p1的dna序列如seq id no. 2所示，所述引物p2的dna序列如seq id no.3所示；b. 将pcr扩增产物与pet30a载体分别经ecori和xhol i酶切后通过t4连接酶连接，转化，构建重组子；c. 将所述重组子转入大肠杆菌transetta（de3）表达菌株中进行诱导培养，而后纯化、复性，得到重组长牡蛎焦孔素蛋白rcggsdme-n。
5.一种上述重组长牡蛎焦孔素蛋白rcggsdme-n在制备抗灿烂弧菌和金黄色葡萄球菌药物中的应用。
6.本发明采用特定引物对长牡蛎cggsdme-n编码区片段进行pcr扩增，分别将pcr扩增产物与pet30a载体经ecori和xhol i酶切后通过t4连接酶连接，转化，构建重组子；并将重组子转入大肠杆菌transetta（de3）中进行诱导培养，而后纯化、复性后获得。所制备的重组长牡蛎焦孔素蛋白rcggsdme-n可以结合多种细菌（金黄色葡萄球菌、灿烂弧菌、大肠杆
菌、嗜水气单胞菌和鳗弧菌），并可以直接杀死灿烂弧菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌且可抑制灿烂弧菌和金黄色葡萄球菌的生长，可应用于制备抗灿烂弧菌和金黄色葡萄球菌的药物。
附图说明
7.图1是本发明实施例重组长牡蛎焦孔素蛋白rcggsdme-n与细菌结合活性检测效果图。
8.图2是本发明实施例重组长牡蛎焦孔素蛋白rcggsdme-n杀菌活性检测效果图。
9.图3是本发明实施例重组长牡蛎焦孔素蛋白rcggsdme-n抑制细菌生长检测效果图。
具体实施方式
10.本发明的重组长牡蛎焦孔素蛋白rcggsdme-n的制备方法，依次按照如下步骤进行：1. 重组载体的构建本发明实施例采用重组载体为novagen公司pet-30a(+)原核表达载体。通过pcr技术，采用5’末端分别添加了ecori和xhol i限制性酶切位点引物p1和p2，对长牡蛎cggsdme-n mrna编码区进行扩增，所述引物p1的dna序列如seq id no. 2所示，所述引物p2的dna序列如seq id no. 3所示。
11.pcr反应条件为：首先94℃预变性5 min，然后进入下列循环：94℃变性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸2 min，共进行30个循环，最后72℃延伸10 min；利用琼脂糖胶电泳将扩增片段纯化回收，与pmd19-t载体连接；转化后筛选阳性克隆，提取质粒，并使用ecori和xhol i对质粒进行双酶切；回收目的片段与经ecori和xhol i酶切的表达载体pet-30a(+)连接，完成重组质粒的构建。
12.2. 重组长牡蛎焦孔素蛋白rcggsdme-n的表达将构建好的重组质粒转化表达大肠杆菌transetta（de3）中，挑取单克隆，接种于200 ml lb液体培养基中，220 rpm，37℃培养至od
600
=0.4~0.8；加入iptg（终浓度1 mmol/l），继续培养4 h后于4℃，10,000 rpm离心5 min，收集菌体，于-80℃冻存备用；同时取1 ml菌液离心，弃去上清后，加入80 μl水和20 μl 5
×
蛋白上样缓冲液，99℃煮沸10 min，稍离心，sds-page检测表达产物。
13.3. 重组长牡蛎焦孔素蛋白rcggsdme-n的纯化与复性将表达产物采用镍琼脂糖凝胶ff柱纯化，获得了变性重组蛋白，用透析缓冲液透析复性。具体操作步骤如下：（1）镍琼脂糖凝胶ff装柱，1.6
×
20 cm，柱床体积为10 ml；（2）用缓冲液i（50 mmol/l tris-hcl缓冲液，ph 9.0，50 mmol/lnacl，8 mol/l尿素）平衡2~5个床体积，流速为2 ml/min；（3）取经iptg诱导表达细胞，用缓冲液i重悬，150 w超声破碎30 min，12,000 rpm，4℃离心30 min，上清液用0.45 μm滤膜过滤后，过柱，流速为1 ml/min；（4）用缓冲液i再洗2~5个床体积，流速为2 ml/min；
（5）用含50 mmol/l咪唑缓冲液i再洗2~5个柱床体积，流速为2 ml/min；（6）用含400 mmol/l咪唑缓冲液i洗脱目的蛋白，收集；（7）用sds-page检测融合蛋白表达；（8）用纯水流洗5个柱床体积，再用20%乙醇流洗3个柱床体积，流速为2 ml/min，柱子置于4℃环境中保存变性状态下提纯重组蛋白需要在复性缓冲液中通过透析除去尿素，使蛋白重新正确折叠，恢复正确构象。变性纯化产物经2 mm还原谷胱甘肽、0.4 mm氧化谷胱甘肽、1 mm edta、50 mm tris-hcl、100 mm nacl、10%甘油、1%甘氨酸及梯度降低的尿素透析复性，尿素浓度起始6 m逐渐替换到4 m、3 m、2 m、1 m、0 m，最后一次透析至无尿素透析液时不加甘油，每次在4℃透析12 h，即得到重组长牡蛎焦孔素蛋白rcggsdme-n，所得到的重组长牡蛎焦孔素蛋白r-cggsdme-n氨基酸序列如seq id no. 1所示。
14.长度：254个氨基酸类型：氨基酸链型：单链特性：分子量为28.4 kda，等电点为6.53，具有一个gasdermin-n结构域。
15.实验例1：本发明实施例的重组长牡蛎焦孔素蛋白rcggsdme-n与菌结合活性检测本实验所用菌种来源如下：灿烂弧菌（vibrio splendidus）购自北京微生物菌种保藏中心，大肠杆菌（escherichia coli）购自北京全式金公司，鳗弧菌（vibrio anguillarum）、嗜水气单胞菌（aeromonas hydrophila）、金黄色葡萄球菌（staphylococcus aureus）、藤黄微球菌（micrococcus luteus）、枯草芽孢杆菌（bacillus subtilis）均购自北京微生物菌种保藏中心。
16.基于western blotting方法检测本发明的重组长牡蛎焦孔素蛋白rcggsdme-n对四种革兰氏阴性菌（灿烂弧菌、大肠杆菌、鳗弧菌和嗜水气单胞菌），两种革兰氏阳性菌（藤黄微球菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌）的结合活性。
17.具体操作如下：（1）对上述6种微生物进行过夜培养，培养方法：藤黄微球菌和大肠杆菌于lb培养基37℃培养20 h，金黄色葡萄球菌、嗜水气单胞菌和枯草芽孢杆菌于lb培养基28℃培养20 h，灿烂弧菌和鳗弧菌于2216e培养基中28℃培养20 h；（2）离心收集菌体，使用tbs缓冲液重悬，调整菌浓度为1
×
10
8 cfu/ml；（3）吸取100 μl微生物悬液与等体积本发明实施例所得重组长牡蛎焦孔素蛋白rcggsdme-n混合，于室温旋转孵育30 min；（4）10,000 rpm离心2 min收集菌体，tbs缓冲液清洗菌体四次；（5）洗涤完成后收集菌体，使用40 μl无菌水重悬；（6）加入10 μl 5
×
蛋白电泳缓冲液，于99℃加热10 min，sds-page电泳分离蛋白样品；（7）电泳完成后，取下凝胶，并裁取相同大小nc膜和滤纸共同浸入电转缓冲液中静置10 min；（8）按照从上到下顺序依次将滤纸、nc膜、凝胶和滤纸放入电转仪中，根据凝胶块面积大小设定对应电流，转膜25 min；（9）取出nc膜，使用tbs缓冲液洗涤三次，每次5 min；
（10）使用缓冲液tbst洗涤三次，每次5 min；（11）将nc膜放入5%脱脂奶粉（溶解于tbst）中，室温封闭2 h；（12）取出nc膜，使用tbst缓冲液洗涤三次，每次5 min；（13）将nc膜浸入按比例稀释的his标签单抗（购于上海生工）溶液（5%脱脂奶粉，tbst缓冲液），于室温条件下孵育1 h；（14）取出nc膜，使用tbst缓冲液洗涤三次，每次5 min；（15）将nc膜放入按比例稀释的羊抗小鼠hrp二抗（购自于上海生工）溶液中（5%脱脂奶粉tbst缓冲液），于室温孵育1 h；（16）取出nc膜，使用tbst缓冲液洗涤三次，每次10 min；（17）ecl方法显影，成像仪记录western blotting结果，如图1所示。
18.结果显示，本发明实施例重组长牡蛎焦孔素蛋白rcggsdme-n对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、鳗弧菌、灿烂弧菌、嗜水气单胞菌均具有不同程度的结合活性，但对枯草芽孢杆菌未检测到结合活性。rtrx阴性对照组中则无明显条带。
19.实验例2：本发明实施例的重组长牡蛎焦孔素蛋白rcggsdme-n的杀菌活性检测长牡蛎焦孔素蛋白rcggsdme-n与灿烂弧菌、大肠杆菌、藤黄微球菌和金黄色葡萄球菌孵育，之后通过计算平板上菌落生长数目评价重组长牡蛎焦孔素蛋白rcggsdme-n的杀菌活性。
20.所述菌种来源如上。
21.具体操作如下：（1）实验细菌用无tbs溶液配成浓度约为4
×
10
4 cell/ml的菌悬液；（2）分别取菌悬液500 μl与500 μl重组焦孔素蛋白cggsdme-n（0.20 mg/ml），混合于1.5 ml eppendorf 管中，然后置于室温孵育；（3）在孵育5 h后，分别取适量该混悬液，用tbs缓冲液将其稀释10,000倍，进行营养琼脂平板涂布，置37℃恒温培养24 h，计数菌落形成单位（colony
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forming units, cfu），设3个平行试验，以rtrx蛋白为对照组。结果如图2所示。
22.结果显示，本发明实施例重组长牡蛎焦孔素蛋白rcggsdme-n对灿烂弧菌、大肠杆菌、藤黄微球菌和金黄色葡萄球菌均有明显的杀菌活性。
23.实验例3：本发明实施例的重组长牡蛎焦孔素蛋白rcggsdme-n抑菌活性检测重组长牡蛎焦孔素蛋白rcggsdme-n与两种微生物（灿烂弧菌和金黄色葡萄球菌）分别孵育，然后使用酶标仪（tecan infinite m1000 pro）检测菌液的吸光值，分析长重组牡蛎焦孔素蛋白rcggsdme-n的抑菌活性。
24.所述菌种来源如上。
25.具体操作如下：（1）实验细菌用无tbs溶液配成浓度约为4
×
10
4 cell/ml的菌悬液；（2）取50 μl重组长牡蛎焦孔素蛋白rcggsdme-n（最终浓度为0.2 mg
·
ml-1
）加入到96孔酶标板中，之后每孔再加入50 μl测试菌液，同时设置阴性对照孔(rtrx)和tbs空白对照孔，每孔体积共100 μl。
26.（3）置于酶标仪中适温培养12-16 h至到达平台期，每半小时读一次od
600
。
27.（4）绘制各检测细菌的生长曲线，并进行比较。结果如图3所示。
结果显示，本发明实施例重组长牡蛎焦孔素蛋白rcggsdme-n对灿烂弧菌和金黄色葡萄球菌具有明显的抑菌活性。