1.本技术涉及长牡蛎养殖的技术领域，尤其是长牡蛎氧化应激状态评价方法。


背景技术：

2.海水贝类养殖产业在促进我国渔业产业发展和优化食物供给等方面发挥了重要作用。近年随着气候变化和人类活动对近岸海洋生态系统影响的不断加重，由高温等环境胁迫引发的死亡事件尤其是夏季大规模死亡频见报道，成为制约贝类养殖产业的世界性难题。长牡蛎是全球重要的海水养殖贝类。近年来，环境胁迫诱发的长牡蛎大规模死亡事件常见报道，严重阻碍了长牡蛎养殖业的可持续发展。由于长牡蛎通常养殖于开放水体，因此，通过水质调节等措施来控制大规模死亡的发生存在一定困难。
3.抗氧化系统是应对氧化应激状态的主要手段。抗氧化系统由一系列抗氧化酶和非酶抗氧化剂组成，包括超氧化物歧化酶(sod)、过氧化氢酶(cat)、谷胱甘肽还原酶(gr)、谷胱甘肽-s转移酶(gst)、谷胱甘肽过氧化物酶(gpx)和维生素c(vc)等。当生物体受到氧化胁迫时产生大量的活性氧自由基(ros)，机体通过调节抗氧化系统来抵御ros带来的氧化损伤，通过清除体内多余的ros维持正常的生理和生命活动。环境胁迫会引发海洋生物体内ros的产生，损害机体细胞和组织正常的生理机能和免疫防御能力，导致机体氧化应激或损伤。长牡蛎拥有较为完善的抗氧化系统来抵御ros带来的氧化损伤。氧化应激相关指标能很好的指示个体在正常和胁迫条件下的生理状态，但是，参与机体氧化应激响应的物质种类和数量较多，变化规律复杂，很难确定关键的分析目标或进行全部指标的分析。因此亟需构建系统的检测指标体系和评价技术方法。


技术实现要素：

4.本技术提供长牡蛎氧化应激状态评价方法，包括步骤：
5.对不同温度胁迫下的长牡蛎氧化应激状态相关指标进行检测；通过多元分析筛选出主成分及主成分表达式；以主成分表达式确定长牡蛎氧化应激状态评价标准。
6.优选地，所述的对不同温度胁迫下的长牡蛎氧化应激状态相关指标进行检测，其中所述的相关指标包括过氧化氢酶指标、丙二醛指标、总抗氧化能力指标。
7.优选地，所述的对不同温度胁迫下的长牡蛎氧化应激状态相关指标进行检测，具体包括实验动物准备、组织提取、指标检测。
8.优选地，所述的通过多元分析筛选出主成分及主成分表达式，包括根据测定的总蛋白浓度计算得到不同温度梯度下的种抗氧化指标，将不同温度梯度下的长牡蛎氧化应激状态指标数据，通过降维统计分析方法—因子分析研究数据间的关系。
9.优选地，所述的将不同温度梯度下的长牡蛎氧化应激状态指标数据，通过降维统计分析方法—因子分析研究数据间的关系具体的：
10.将多项指标数据通过降维、因子分析和描述分析，对多个指标数据进行因子描述，得到的因子相关矩阵；
11.利用主成分分析方法提取上一步骤中的因子，设定提取因子的固定数目为3，通过旋转矩阵对不合理的变量进行删除，直至所有变量与因子对应关系与预期基本吻合，然后提取得到的旋转成分矩阵；
12.通过碎石图的拐点变化确定提取3个因子可以较好的涵盖原本变量的所有信息，即总方差解释率为83.372％；
13.选择因子分析—得分，生成成分得分系数矩阵；
14.根据因子得分提取cat、mda、t-aoc三个因子，赋予每一因子不同的权重得到主成分表达公式：
15.f1＝0.256*t-aoc+0.462*cat-0.204*mda，
16.f2＝0.821*t-aoc+0.153*cat-0.158*mda，
17.f3＝-0.171*t-aoc-0.219*cat+0.891*mda，
18.其中的cat具体是过氧化氢酶指标对应的数据值，其中的mda具体是丙二醛指标对应的数据值，其中的t-aoc具体是总抗氧化能力指标对应的数据值；
19.保存公因子得分进行综合评价，即得到长牡蛎氧化应激状态评价公式：
20.f＝(f1*0.46752+f2*0.24661+f3*0.11959)/0.83372。
21.优选地，所述的实验动物准备包括：长牡蛎在实验室暂养7天，然后将其转移到验用水箱中，采用具有自动水温检测功能的加热棒调节海水温度，对照组温度为16℃，实验组温度分别为18℃、20℃、22℃、24℃、26℃、28℃、30℃、32℃、34℃；实验期间保持24h 充气，当长牡蛎离开水体后5秒内无法自主闭合时，视为死亡，当发现死亡个体立即移出，以免影响水质；所述的组织提取包括：在胁迫12h后提取长牡蛎的鳃组织样品，将样品存放于-80℃冰箱中保存；所述的指标检测包括：称取鳃组织样品0.1g放于磷酸盐缓冲液中，冰浴条件下用电动匀浆器研磨成组织匀浆，离心后取上清液待测；使用试剂盒测定相关的指标。
22.优选地，所述的以主成分表达式确定长牡蛎氧化应激状态评价标准，具体是：通过分析cat、mda和t-aoc在高温胁迫过程中的变化数据矩阵，通过长牡蛎氧化应激状态评价公式得到不同胁迫下的氧化应激状态评价得分，评价公式得分f≥0.62为强氧化应激状态， 0.62》f≥0.45为中等氧化应激状态，0.45》f为弱氧化应激状态，其中的cat具体是过氧化氢酶指标对应的数据值，其中的mda具体是丙二醛指标对应的数据值，其中的t-aoc具体是总抗氧化能力指标对应的数据值。
23.本技术的有益效果是，本技术提供了一种长牡蛎氧化应激状态的评价方法，通过该方法得到了能够评价长牡蛎氧化应激状态的代表性检测指标，通过评价公式得到氧化应激状态评价得分，利用评价标准评价长牡蛎氧化应激状态评价水平。利用本技术方法的分析结果能够较为准确地评价长牡蛎的氧化应激状态及等级，为长牡蛎养殖过程决策及操作提供技术支撑。
24.下面结合实施例对本技术进一步说明。
具体实施方式
25.在具体实施中，本技术长牡蛎氧化应激状态评价方法的实施例，包括步骤有：
26.对不同温度胁迫下的长牡蛎氧化应激状态相关指标进行检测；
27.通过多元分析筛选出主成分及主成分表达式；
28.以主成分表达式确定长牡蛎氧化应激状态评价标准。
29.本领域普通技术人员可以理解实现上述实施例方法中的全部或部分流程，是可以通过计算机程序来指令相关的硬件来完成，所述的计算机程序可存储于一非易失性计算机可读取存储介质中，该计算机程序在执行时，可包括如上述各方法的实施例的流程。其中，本技术所提供的各实施例中所使用的对存储器、存储、数据库或其它介质的任何引用，均可包括非易失性和易失性存储器中的至少一种。非易失性存储器可包括只读存储器(read-onlymemory，rom)、磁带、软盘、闪存或光存储器等。易失性存储器可包括随机存取存储器 (random access memory，ram)或外部高速缓冲存储器。作为说明而非局限，ram可以是多种形式，比如静态随机存取存储器(static random access memory，sram)或动态随机存取存储器(dynamic random access memory，dram)等。
30.所以本技术的一种实施例公开长牡蛎氧化应激状态的评价装置，其包括检测模块、关系构建模块和评价模块，其中的检测模块用于对不同温度胁迫下的长牡蛎氧化应激状态相关指标进行检测，关系构建模块用于通过多元分析筛选出主成分及主成分表达式，评价模块用于以主成分表达式确定长牡蛎氧化应激状态评价标准并且对长牡蛎氧化应激状态评价输出结果。
31.所以本技术的一种实施例公开一种计算机设备，包括存储器和处理器，所述存储器存储有计算机程序，所述处理器执行所述计算机程序时实现本技术长牡蛎氧化应激状态评价方法的实施例中方法的步骤。
32.本技术长牡蛎氧化应激状态评价方法的实施例中所述的对不同温度胁迫下的长牡蛎氧化应激状态相关指标进行检测，其中所述的相关指标包括过氧化氢酶指标、丙二醛指标、总抗氧化能力指标。
33.本技术长牡蛎氧化应激状态评价方法的实施例中所述的对不同温度胁迫下的长牡蛎氧化应激状态相关指标进行检测，具体包括，
34.实验动物准备、组织提取、指标检测；
35.所述的实验动物准备包括：长牡蛎在实验室暂养7天，然后将其转移到验用水箱中，采用具有自动水温检测功能的加热棒调节海水温度，对照组温度为16℃，实验组温度分别为18℃、20℃、22℃、24℃、26℃、28℃、30℃、32℃、34℃。实验期间保持24h充气，当长牡蛎离开水体后5秒内无法自主闭合时，视为死亡，当发现死亡个体立即移出，以免影响水质；所述的组织提取包括：在胁迫12h后提取长牡蛎的鳃组织样品，将样品存放于
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80℃冰箱中保存；所述的指标检测包括：称取鳃组织样品0.1g放于磷酸盐缓冲液中，冰浴条件下用电动匀浆器研磨成组织匀浆，离心后取上清液待测；使用试剂盒测定相关的指标。
36.比如在具体实施中，使用试剂盒测定相关的指标，分别使用南京建成丙二醛(mda) 测定试剂盒(a003-1-2)、南京建成总抗氧化能力(t-aoc)测试盒(a015-1-2)、南京建成总超氧化物歧化酶(sod)测定试剂盒(a001-3-2)、南京建成过氧化氢酶(cat) 测定试剂盒(a007-1-1)、南京建成还原型谷胱甘肽(gsh)测定试剂盒(a006-2-1)、南京建成过氧化物酶(pod)测定试剂盒(a084-1-1)测定mda、t-aoc、sod、cat、 gsh、pod共6项指标。
37.在具体实施中，所述的通过多元分析筛选出主成分及主成分表达式，包括根据测定的总蛋白浓度计算得到不同温度梯度下的种抗氧化指标，将不同温度梯度下的长牡蛎氧化应激状态指标数据，通过降维统计分析方法—因子分析研究数据间的关系。
38.在具体优选地实施中，所述的将不同温度梯度下的长牡蛎氧化应激状态指标数据，通过降维统计分析方法—因子分析研究数据间的关系具体的：
39.将多项指标数据(一种优选实施中以sod、cat、mda、pod、gsh、t-aoc共6 项指标)通过降维、因子分析和描述分析，对多个指标(一种优选实施中以sod、cat、 mda、pod、gsh、t-aoc共6项指标)数据进行因子描述，得到的因子相关矩阵(如下表1所示的)；
[0040][0041]
表1
[0042]
利用主成分分析方法提取上一步骤中的因子，设定提取因子的固定数目为3，通过旋转矩阵对不合理的变量进行删除，直至所有变量与因子对应关系与预期基本吻合，然后提取得到的旋转成分矩阵(如下表2所示的)；
[0043][0044]
表2
[0045]
通过碎石图的拐点变化确定提取3个因子可以较好的涵盖原本变量的所有信息，即总方差解释率为83.372％；
[0046]
选择因子分析—得分，生成成分得分系数矩阵(如下表3所示的)；
[0047][0048]
表3
[0049]
根据因子得分提取cat、mda、t-aoc三个因子，赋予每一因子不同的权重得到主成分表达公式：
[0050]
f1＝0.256*t-aoc+0.462*cat-0.204*mda，
[0051]
f2＝0.821*t-aoc+0.153*cat-0.158*mda，
[0052]
f3＝-0.171*t-aoc-0.219*cat+0.891*mda，
[0053]
其中的cat具体是过氧化氢酶指标对应的数据值，其中的mda具体是丙二醛指标对应的数据值，其中的t-aoc具体是总抗氧化能力指标对应的数据值；
[0054]
保存公因子得分进行综合评价，即得到长牡蛎氧化应激状态评价公式：
[0055]
f＝(f1*0.46752+f2*0.24661+f3*0.11959)/0.83372。
[0056]
所述的以主成分表达式确定长牡蛎氧化应激状态评价标准，具体是：通过分析cat、mda 和t-aoc在高温胁迫过程中的变化数据矩阵(其中的cat具体是过氧化氢酶指标对应的数据值，其中的mda具体是丙二醛指标对应的数据值，其中的t-aoc具体是总抗氧化能力指标对应的数据值)，通过长牡蛎氧化应激状态评价公式得到不同胁迫下的氧化应激状态评价得分，评价公式得分f≥0.62为强氧化应激状态，0.62》f≥0.45为中等氧化应激状态，0.45》f为弱氧化应激状态。
[0057]
在优选的实施中，以sod、cat、mda、ldh、ros、atp、gsh、t-aoc共8个指标的变化代表长牡蛎氧化应激状态的变化水平，根据不同指标在长牡蛎高温胁迫过程中的变化规律，得到氧化应激状态变化的数据矩阵。
[0058]
在实施中具体通过主成分分析得到数据矩阵的3个主成分，以0.85为筛选阈值，得到 cat、mda和t-aoc共3个指标代表长牡蛎80％以上的氧化应激状态水平，作为评价长牡蛎氧化应激状态的检测指标。
[0059]
本技术提供了一种长牡蛎氧化应激状态的评价方法，通过该方法得到了能够评价长牡蛎氧化应激状态的代表性检测指标，通过评价公式得到氧化应激状态评价得分，利用评价标准评价长牡蛎氧化应激状态评价水平。利用本技术方法的分析结果能够较为准确地评价长牡蛎的氧化应激状态及等级，为长牡蛎养殖过程决策及操作提供技术支撑。