专利名称：肽化合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及对细胞增殖具有促进作用的肽的应用，还涉及具有特殊和/或一般细胞促进作用的新型肽化合物。
哺乳动物体的细胞在结构和功能方面有很大的差异，并且细胞分化的发育机制已成为许多研究工作的集中点。人们知道，对于具有连续更新的细胞体系，其机制通常涉及多能干细胞的储主，该干细胞分裂并持续向该体系提供新细胞。来自“储主”的干细胞，尽管在开始时是同源的，但很快变成一种或另一种形态，并接着发育成所要求的功能细胞。
骨髓中的造血系统和上皮层和表皮系统是这种干细胞系统的实例。
干细胞分裂的操作或控制在治疗上具有很大潜力，并且许多研究工作继续致力于解释所涉及的机制和起作用的化学信使。到目前为止，通过在细胞产生与分化过程中进行一段刺激或抑制可鉴定出在该过程中具有作用的几种生物分子。在这方面曾特别好地研究过骨髓细胞生成，在其控制中涉及的分子包括菌落刺激因子(CSF)，如粒细胞菌落刺激因子(G-CSF)，巨噬细胞菌落刺激因子(M-CSF)，粒细胞-巨噬细胞菌落刺激因子(GM-CSF)，多谱系菌落刺激因子(多-CSF;IL-3)[参见Metcalf，Science 22916(1985)]，内白细胞素(IL-11)[参见Paul等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA877521(1990)]，乳铁蛋白[参见Broxmeyer等人，Blood Cells11429(1986)]，前列腺素[参见Pelens等人，Immunol.140479(1988)]，酸性(H-亚单位)铁蛋白[参见Broxmeyer等人，Blood 681257(1986)]，干扰素(α、β和γ)[参见Pelus等人，同前，和Broxmeyer等人，J.Immunol.1311300(1983)]，肿瘤致死因子(α和β)[参见Broxmeyer等人，J.Immunol.1364487(1986)]，转化生长因子-β[参见Ottman等人，J.Immunol.1402661(1988)]和苯丙酸诺龙和抑制素[参见Broxmeyer等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86779(1989)]。
还发现，血调节五肽(PEEDCK)选择性地抑制骨髓生成细胞的增殖(参见Paukovits等人，Z.Naturforsch 371297(1982)]，人们还发现具有很窄的化学通式的其他肽在造血中具有类似的抑制作用(参见EP-A-112656和WO 90/02753)。该肽单体的氧化导致了由半胱氨酸桥连接的二聚体分子，人们发现这些二聚体分子刺激骨髓生成[参见Laerum等人，Exp.Hematol 16274(1988)]。WO-A-88/03535公开了(pEEDCK)2二聚体和其他类似化合物。EP-A-408371公开了其他二聚体肽化合物，其中二硫键被连接所选择的肽链的碳或碳/硫桥取代。因此，这种桥对水解是相当稳定的，但它本身是惰性的，不能参与受体-二聚体的相互作用。
尽管我们不希望受到理论的束缚，但现在我们认为这种肽化合物与体内基质细胞相互作用，并且通过其他可溶因子，该基质细胞负责刺激或抑制细胞的分裂。当单体肽可以抑制分裂过程或导致产生防止或阻止细胞分裂的因子时，则可认为二聚体诱导或促进刺激性细胞调节因子的基质产生。因此，按照目前的见解，基质细胞可以分别起着增强二聚体和单体肽的刺激或抑制作用。
能在体内刺激细胞增生至有效水平的二聚肽化合物仍是人们持续需要的。在这方面，应该指出，刺激的不同程度对某些临床情况比对其它情况可能更合适，尤其是，对个别细胞类型的选择性刺激是尤为重要的。
本发明提供了一种肽化合物，它含有两个单链血调节(例如抑制造血的)肽，该肽由一种桥基团连接起来，而该桥基团在末端与每个所述肽中位于等效位置处的非端部氨基酸中的Cα原子相连，在每个肽中无原来的α-侧链存在，所述的桥基团是一种二价基团-A-，其中A是式中每个y独立地是0、1或2;
每个z独立地是0或1;
每个Y独立地是O、S或NR，其中，R代表氢或与C连续的有机基团(如烷基、芳烷基或芳基);
B代表碳环或杂环(如5或6元芳环)，其杂环随意地含有一或二个杂原子(例如氧、氮或硫)和随意地由-ORA、-NRARA、-COORA或诸如碘、氯、氟或溴原子之类的卤原子进行一次、二次或三次取代的杂环;
每个RA独立地代表氢原子、烷基、链烷酰基、烷氧基烷基，其中每个基团还可羟基化。
基团B是由上述任一基团二次或三次取代的，此时每种取代基与另外的不必相同或不必具有相同的类型。
基团R是与碳连接的有机基团时，它最好含1-10个碳原子，尤其是1-6个碳原子。烷基可以是直链或支链的，并且可由6-10个碳原子的芳基(即生成芳烷基)、烷氧基、羟基、酰氧基、氨基、酰氨基或羧基取代。芳基包括具有一个或多个杂原子的五或六元杂环芳基，杂原子选自于O、N或S，如呋喃基、咪唑基、吡咯基、吡啶基和噻吩基。在芳基上的取代基包括C1-6烷基、羟基和羧基。实例包括甲基、乙基、丙基、叔丁基、戊基、羧乙基和苯甲基。
RA基最好含1-6个碳原子，尤其是1-4个碳原子，此时RA代表烷基、、链烷酰基或烷氧基烷基。
在一个较好的实施方案中，二价桥基团-A-是-CH2CH2BzCH2CH2-，其中Bz代表苯环，它任选地由-ORA、-NRARA、-COORA基团或诸如碘、氯、氟或溴原子进行一次取代或二、三次取代，RA如上所限定。
任何具有血调节作用的单链肽都适于作本发明的桥连的肽。
换句话说，本发明提供这样一些化合物，在该化合物中所述的血调节肽链包括具有下述化学式的肽链
其中Ra代表
式中n和m独立地代表0或1;
p、q、r独立地代表1或2;
s代表3或4;
R1和R2两者都是氢原子或者一起代表oxo基团;
R3和R4两者都是氢原子或者一起代表碳-碳键;
R5是氢或酰基;
R6和R7分别独立地代表羟基或氨基，而最好是羟基;
R8代表氢;C2-6烷基;C7-20芳烷基，它可携带一个或多个羟基、氨基或甲氧基取代基;或在代谢上不稳定的S-保护基;
R9代表氢或甲基;
R10代表羟基或氨基，氨基酸谷氨酰胺的残基或具N-端谷氨酰胺单元的肽。
所有所述氨基酸残基可以是D型或L型的。然而L型氨基酸更可取。
有N-端保护基存在时，正如前面所指出的，该基可能是具有1-20碳原子的酰基，例如具有1-5个碳原子的低级链烷酰基，如乙酰基，或具有7-20个碳原子的芳酰基或芳烷酰基，如苯甲酰基或苯乙酰基。
R5也可以是由氨基酸或肽链衍生出来的酰基，特别是，R5可以是由丝氨酸衍生的酰基，或者是通过除去连续N-端氨基酸由下述氨基酸序列所产生的任何肽而得到的酰基Lys-Ile-Ile-His-Glu-Asp-Gly-Tyr-Ser化学式(Ⅰ)的整个肽的末端氨基最好通过用链烷酰基、芳烷酰基或芳酰基进行酰化而加以保护。
R8是C2-6烷基时，它可以是例如乙基、丁基或己基。当R8是芳烷基时，方便地它可以是芳甲基，如苯甲基、二苯甲基或三苯甲基。当R8是代谢上不稳定的基团时，它可以是例如具有5-10个碳原子的芳硫基，如吡啶硫基，或如前面限定的酰基。
本发明的化合物在每个链中最好是五肽，即n最好是O。
R9残基中的环基最好是五元的，即m最好是O。
在由上述化学式Ⅰ限定的任何肽的血调节活性低或微不足道的情况下，在本发明所述的桥形式下它们无论如何均能有效地激发细胞增殖。
在由如化学式Ⅰ描述的肽衍生成的二聚肽中，适宜的链的桥连点在Rd处。
本发明特别可取的肽化合物是具有化学式Ⅱ的那些化合物。
式中Ra、Rb、Rc、Re、Rf、A和n都如前面所定义，-NH-CH-CO-基是Rd的衍生形式，该Rd以这样一种形式连接到桥基-A-上以致其原来的侧链不存在了。
化学式Ⅱ的一种特别可取的肽化合物是
其中-A-是如前面讨论的二价桥基团。
本发明尤其应用于在患骨髓细胞生成活性降低的病人身上刺激骨髓细胞生成，其中包括骨髓损伤，粒性白血球缺乏症和再生障碍性贫血。这包括对由于对抑制组织反应进行免疫抑制治疗(如在骨髓移植外科手术中)而具有较低骨髓功能的病人进行治疗。
这些化合物还可用于对肿瘤和病毒疾病进行抑制细胞的化学治疗和放射治疗之后促进骨髓更快的再生。
另外，对于由于骨髓故障而缺少免疫反应，从而导致严重感染的病人，这些新型化合物可以具有特别的价值。
另一个临床应用是与EP-A-112656或WO-A-90/02753中所公开的相应单体或类似的骨髓细胞生成抑制试剂相结合来诱导骨髓细胞中高活性与低活性峰交替出现，从而增加造血过程的自然生理节奏。以这种方式，可以在低骨髓活性期间作细胞抑制治疗，因此减少了骨髓损伤的危险，同时再生过程由于持续的活性峰而受到激发。
一般地，为了施加刺激作用，本发明的肽可以由病人口服或向其注射，其剂量为每70Kg体重每天0.001-100mg，如1-5mg。如果是静脉注射或皮下注射用药，则剂量可以是每70Kg体重每天1-10mg，例如约6mg，最多十天。鼻、局部(透过皮肤)或直肠用药当然也是可行的。原则上合适地是在病人细胞外体液中达到肽浓度为约10-13m-10-15m。
根据本发明进一步的特征，它提供了药物组合物，该组合物包括作为活性组分的本发明的一种或多种肽化合物，特别是具有上述化学式(Ⅰ)的那些化合物，或其在生理上相容的盐，并配以药物载体或赋形剂。本发明的组合物可以是适宜如口服、鼻用药、非肠道或直肠用药的形式。
这里使用的术语“药物的”包括本发明在兽医方面的应用。
本发明化合物可以是通常的药物形式，如片剂、涂层片剂、鼻喷雾剂、溶液、乳化液、粉末、胶囊或缓释形式。制备这些形式的药物时可以使用常见的药物赋形剂以及通常的生产方法。例如通过将一种活性组分或多种活性组分与下述已知赋形剂混合可以生产片剂例如稀释剂，如碳酸钙，磷酸钙或乳酸钙，崩解剂如玉米淀粉或藻酸，还可以在其中加入粘结剂，如淀粉或明胶，润滑剂，如硬脂酸镁或滑石粉，和/或缓释剂，如羧基聚甲烯、羧甲基纤维素，乙酸磷苯二甲酸纤维素或聚乙烯乙酸酯。
若需要的话，片剂可由几层组成。通过对以与片剂类似的方法得到的核采用片剂涂层常用的制剂，如聚乙烯吡咯烷酮或紫胶片、阿拉伯胶、滑石粉、二氧化钛或糖进行涂复生产涂层片剂。为得到缓释或避免不相容，其核也可由几层组成。片剂涂层也可由几层组成，以便得到缓释，在这种情况下，可以使用前面就片剂所说到的赋形剂。
也可使用器官特定载体系统。
例如可以以常规方式生产注射液，例如加入防腐剂，如P-羟基苯甲酸盐，或稳定剂，如EDTA，然后将溶液装入注射小玻璃瓶或安瓿中。
鼻喷雾剂可类似地于水溶液中配制，并且装进有气溶胶喷射剂或配备手动加压装置的喷射容器里。可以生产装有一种或几种活性组分的胶囊，例如将活性组分与惰性载体(如乳酸型或山梨糖醇)混合，再将混合物装入明胶胶囊里。
可以生产合适的栓剂，如将活性组合或活性组分组合物与常用于此目的的载体混合，如与天然脂肪或聚乙二醇或其衍生物混合。
含本发明化合物的剂量单位最好是0.1-10mg，如1-5mg化学式(Ⅰ)肽或其盐。
根据本发明另外一个特征，它提供了一种刺激细胞分裂的方法，尤其是刺激骨髓细胞生成的方法，该方法包括向用药者施用有效量的前面限定的药物组合物。
然而，该新型肽化合物的另外一个重要应用是生产供免疫试验技术用的物质。该肽可以与适宜的高分子载体(如白蛋白、聚赖氨酸或聚脯氨酸)共价结合，以便能注入产生抗体的动物(例如兔、几内亚酯或山羊)。也可使用体外免疫技术。使用高分子载体，应用熟知的吸收技术可以得到高特异性的抗血清。通过将放射性(3H、125I，14C，35S)引入该肽分子中，可以设计出放射免疫试验，并且用来测定不同生物体液，如血清(血浆)、尿和脑脊髓液中的肽。
本发明的肽可用任何方便的方法合成。例如“Synthesis of optically Active α-Amino Acids”(Robert M.Williams，Pergamon Press，1989)中叙述了形成氨基酸单元的适宜方法。一般地，在总合成中的偶合反应期间，存在于肽中的反应侧链基团(氨基、硫基和/或羧基)将受到保护，但可能在整个合成期间留下一些侧链基团未受到保护(羟基、咪唑基、伯酰胺基、在类似pyroGlu的环氨基酸中的酰胺基团)。
因此，最后步骤将是对完全保护或部分保护的通式Ⅰ的肽衍生物除去保护，这种过程均构成本发明的另一方面。
Schoellkopf等人曾描述了通过将双内酰亚胺醚进行金属取代和接着进行烷基化而制备各种各样的氨基酸(参见，如Tetrahedron 392085(1983)和Topics Curr.Chem.10965(1983))。已经证明采用这种方法对制备构成本发明基础的桥氨基酸来说是特别有用的。特别是，由缬氨酸甘氨酸二肽衍生出的双-内酰亚胺醚形成了对桥连反应有用的起始化合物，该桥连反应可概述如下
(其中X是留下的基团，例如卤原子，如溴)。
如果开始时使用D-缬氨酸生成双-内酰亚胺醚，则由这种方法可以制备桥连的(S，S)-α，α′-二氨基酸。同样地，使用L-缬氨酸可以生成桥连的(R，R)-α，α′-二氨基酸。
我们还发现，可以由相应的二-(卤羰基甲基)芳基化合物制备芳基(包括杂芳基)二甘氨酸衍生物。所述的二(卤羰基甲基)芳基化合物可与手性噁唑烷酮反应生成烯醇酸羧亚胺(carboximide enolate)，然后与叠氮形成试剂，如2，4，6-三异丙基苯磺酰叠氮化物反应以引入叠氮基，接着用如10%钯/焦碳进行氢解以生成所需要的二甘氨酸。
我们的方法是采用Evans等人在J.Am.Chem.Soc.109，6881(1987)和J.Am.Chem.Soc.111，1063(1987)中的描述的工艺方法。另外，在偶氮二羧酸酯中可以发现适宜的亲电子氨基氮，在这种情况下，相应的双肼酸是氢解成氨基酸的中间体。
该工艺方法由下列反应图予以说明。
因此，本发明还提供生产肽化合物的方法，该方法包括使部分或完全被保护的肽化合物的衍生物去保护。
此外，本发明还提供生产肽化合物的方法，所述方法包括a)将双-内酰亚胺醚进行金属取代而后烷基化从而生成双-内酰亚胺二肽醚;
b)将步骤(a)的双-内酰亚胺二胺醚水解生成桥连的α，α′-二氨基酸;
c)在肽链中引入余下的氨基酸;
d)将任何受保护的基团去除保护。
由该技术制成的双-内酰亚胺二肽醚和桥连的酸α，α′二氨基酸构成本发明的另一方面。
一旦桥连的二肽已生成，那么可用常规技术将其余氨基酸加入肽链中。
在建立肽链时，人们在原则上可以在C-端或N-端开始，尽管仅有C-端起始步骤是通常采用的。
因此，人们可以在C-端由适当保护的(如甘氨酸)衍生物与适当保护的半胱氨酸衍生物反应开始。甘氨酸衍生物具有游离的α-氨基，而其他反应物具有游离的或活化的羧基和受保护的氨基。偶合之后，可以用例如色谱法纯化其中间体，然后，选择性地对其中间体进行N-去保护，以便能加入其他N-保护的和游离或活化的氨基酸残基。这种步骤一直持续到所要求的氨基酸顺序完成为止。
可以使用的羧酸活化取代基包括对称或混合的酸酐，或活性酯，例如P-硝基苯基酯，2，4，5三氯苯基酯，N-羟基苯并三唑酯(OBt)，N-羟基琥珀酰亚胺基酯(OSu)或五氟苯基酯(oPTF)。
例如，可采用二环己基碳化二亚胺(DCC)进行游离氨基与羧基的偶合。另一种可以使用的偶合剂是N-乙氧基羰基-2-乙氧基-1，2-二氢喹啉(EEDQ)。
一般，在低温，如-20℃至最高为室温，方便地是在适宜溶剂体系中，如四氢呋喃、二噁烷、二甲基甲酰胺、二氯甲烷或这些溶剂的混合物中进行偶合反应。
在固相树脂载体上进行合成可能更方便。氯甲基化的聚苯乙烯(用1%二乙烯苯交联)是一种有用的载体类型，在这种情况下，其合成可以通过将N-保护的甘氨酸偶合到载体上而在C-端处开始。
下述文献描述了许多适宜的固相技术Eric Atherton，Christopher J.Logem，和Robert C.Sheppard，J.Chem.Soc.Perkin I，538-46(1981);James P.Tam，Foe S.Tjoeng，和R.B，Merrifield J.Am.Chem.Soc.102，6117-27(1980);James P.Tam，Richard D.Dimarchi和R.B.Merrifield Int.J.Peptide Protein Res.16 412-25(1980);Manfred Mutler和Dieter Bellof，Helvetca Chimica Acta 672009-16(1984)。
在溶液中进行偶合反应也是可能的。
已经知道氨基保护基具有广泛选择，并在下述参考文献予以说明Schroeder，E.，和Lübke，K.，The Peptides，Vol.1和2，Academic Press，New York and London，1965和1966;Pettit，G.R.，Synthetic Peptides，Vols 1-4，Van Nostrand，Reinhold，New York 1970，1971，1975和1976;Houben-Weyl，Methodender Organischen Chemie，Synthese Von Peptiden，Band 15，Georg Thieme Verlag Stuttgart，NY，1983;The Peptides Analysis，Synthesis，biology 1-7，EdErhard Gross，Johannes Meienhofer，Academic Press，NY，San Fransisco，London，Solid phase peptide synthesis 2nd ed.，John M.Stewart，Janis D.Young，Pierce Chemical Company.
因此，例如可以使用的胺保护基包括诸如苄酯基(Z-)、叔丁氧基羰基(Boc-)、4-甲氧基-2，3，6-三甲基苯磺酰基(Mtr-)，和9-芴基甲氧基羰基(Fmoc-)之类的保护基。应当看到，当从C-末端构建肽时，氨保护基存在于每个所加入的新残基的α-氨基上，并且在进行进一步偶合步骤之前需要选择性地将其除去。对于固相系统，对这种临时胺保护的一种特别有效的基团是Fmoc基团，该基团可以通过在有机溶剂用哌啶处理而选择性地除去。对于在溶液中合成，Boc-是一种较可取的保护基团，它可以常规方法引入或除去。
在例如通过加入Fmoc进行保护之前，为改善氨基酸或肽在有机溶液中的溶解度而常常需要对其进行硅烷化。
硅烷化和Fmoc保护反应概述如下
例如可以使用的羧基保护基包括很容易分裂的酯基，如苄基(-OBZI)、p-硝基苄基(-ONB)、或叔-丁基(-tobu)以及固体载体上偶合剂，如聚苯乙烯连接的甲基。
硫保护基包括p-甲氧基苄基(Mob)、三苯甲基(Trt)和乙酰氨基甲基(Acm)。
人们将看到，正如在上述参考文献中详细叙述的，还有大量其他这类基团存在，在本文前面描述的方法中使用所有这些基团都在本发明的范围之内。
除去胺和羧基保护基的方法有很多。然而这些方法应该与所使用的合成方案相一致。侧链保护基必须对于在下一步偶合步骤之前除去临时α-氨基保护基所使用的条件来说是稳定的。
如Boc的胺保护基和如toBu的羧基保护基可以用如三氟乙酸之类的酸处理同时予以除去。用诸如碘之类的氧化剂，可以选择性地除去如Trt的硫保护剂。
在除去包括硫保护基在内的所有保护基之后可以在最后合成步骤采用本文描述的方法合成含有半胱氨酸的肽。
仅以说明方式列出下述实施例。
HoBt＝羟基苯并三唑pfp＝五氟苯基Fmoc＝9芴基甲氧基羰基Boc＝叔-丁氧基羰基Dcc＝二环己基碳化二亚胺(E)-DHS＝(S，S)-β，β′-二氨基-1，3-二乙基苯-β，β′-二羧酸实施例1(S，S)-α，α′-二氨基-1，3-苯二丙酸a)α，α′-双[(2R，5S)-2，5-二氢-3，6-二甲氧基-2-异丙基-5-吡嗪基]-m-二甲苯将n-丁基钾在己烷中的溶液(1.6M，9.4ml，15mmol)加到冷却到-78℃的(2R)-(-)-2，5-二氢-3，6-二甲氧基-2-异丙基吡嗪(2.8g，15mmol)在无水THF(5ml)中的溶液中。该混合物搅拌15分钟。加入α，α′-二溴-m-二甲苯(2.0g，7.5mmol)在无水THF(5ml)中的溶液。将反应混合物升至室温过夜。蒸去溶剂，将残余物放入二乙醚中，用水洗涤该醚溶剂，干燥(MgSO4)和蒸发。用闪蒸色谱法纯化其产品(二氧化硅凝胶，己烷/EtOAc3∶1)。产量2.8g(80%)，黄白色，半固体。
1H NMR(200 MHz，CDCl3)δ0.60(6H，d)，0.94(6H，d，CH3)，2.1(2H，m)，3.0(4H，m)，3.3(2H，m)，3.66(6H，s)3.71(6H，s)，4.3(2H，dd)，6.8-7.1(4H，m);13C NMR(50 MHz，CDCl3);δ18.0，20.6，32.6，41.5，53.2，53.4，57.9，61.3，127.5，128.1，131.9，137.1，162.5，163.7.
MS(IP 70 eV)m/z 470(0.2)，288(50)，183(47)，182(20)，141(100)，105(40).
C26H38N4O4CalcC 66.34;H 8.14;N 11.91;
FoundC 66.48;H 8.07;N 11.85.
b)二甲基(S，S)-α，α′-二氨基-1，3-苯-二丙酸酯将α，α′-双[(2R，5S)-2，5-二氢-3，6-二甲氧基-2-异丙基-5-吡嗪基]-m-二甲苯(2.00g，4.25mmol)溶于甲醇(10ml)中，再加入0.25M盐酸(68ml，17mmol)，其混合物在室温下搅拌过夜，用乙醚提取该水/甲醇溶液，然后加氨将pH调节到10。将该产品提取到醚中，干燥醚溶液(MgSO4)，过滤蒸发。在Kygelrohr装置中蒸去D-缬氨酸甲基酯(50-60℃/0.1毫巴)。其残余物无需再纯化便可在下一步中使用。
产率1.10g(92%)1H NMR(200MHz，CDCl3)δ1.4(4H，br s)，2.83(2H，dd，2J 13.5Hz，3J 7.9Hz)，3.05(2H，dd，2J 13.5Hz，3J 5.1Hz)，3.7(2H，dd)，3.71(6H，s)，7.0-7.3(4H，m).
c)(S，S)-α，α′-二氨基-1，3-苯-二丙酸·2HCl将二甲基(S，S)-α，α′-二氨基-1，3-苯-二丙酸酯(1.0g，3.6mmol)在6M盐酸(10ml)中的溶液在50℃搅拌过夜。在旋转蒸汽(rotavapor)上除去盐酸，并且得到的白色固体在真空炉中于40℃进行干燥。
产率1.1g(95%)1H NMR(200MHz，H2O)δ3.18(2H，dd，2J 14.5Hz，3J 7.4Hz)，3.29(2H，dd，2J 14.5Hz，3J 5.7Hz)，4.28(2H，dd，3J 5.7，7.4Hz)，7.1-7.4(4H，m);13C，NMR(50MHz，H2O)δ39.2)，57.7，131.8，132.8，133.0，137.7，173.7.
C12H18Cl2N2O4计算值C 44.32;H 5.58;N 8.61;
测定值C 44.78;H 5.81;N 8.73.
d)(S，S)-α，α′-双(9-芴基甲氧基羰基氨基)-1，3-苯-二丙酸将(S，S)-α，α′-二氨基-1，3-苯二丙酸二盐酸(1.05g，3.23mmol)在六甲基二硅氮烷(15ml)和三甲基氯硅烷(1.5ml)的混合物中的悬浮液，在氮气下于100℃搅拌过夜。其清沏的反应混合物经冷却后，在真空下除去过量的硅烷化试剂。残余物溶于无水的二氯甲烷(10ml)，在冰/水浴中冷却。加入9-芴基甲氧基羰基氯(0.75g，6.76mmol)在无水二氯甲烷(5ml)中的溶液，其反应混合物在氮气下搅拌3小时。在旋转蒸汽(rotavapor)上除去二氯甲烷，残余物溶于THF(8ml)和水(1ml)的混合物中。该混合物搅拌30分钟，然后蒸发。取出残余物放入乙酸乙酯中，并用水洗涤几次。对有机相进行干燥(MgSO4)过滤和浓缩。添加己烷使产品结晶。晶体用己烷洗涤，并用柱色谱法(二氧化硅，己烷/乙酸乙酯/乙酸3∶6∶1)纯化其产品，白色固体，mpt143-144℃产率1.85g(82%)1H NMR(200 MHz，CDCl3)δ2.8-3.1(4H，m)，4.0-4.4(8H，m)，7.0-8.0(22H，m);13C NMR(50 MHz，CDCl3);δ37.5，47.6，55.3，66.4，120.2，125.3，127.1，127.3，127.7，128.1，129.9，137.8，140.6，143.6，155.7，172.9.
FAB-MS信号在at m/z 719.1(2)，539.1(6)，271.0(6)和179.1(100).
实施例2(S，S)-α，α′-双(9-芴基甲氧基羰基氨基)-1，4-苯二丙酸a)α，α′-双[(2R，5S)-2，5·二氢-3，6-二甲氧基-2-异丙基-5-吡嗪基]-P-二甲苯如前面所述由(2R)-(-)-(2，5-二氢-3，6-二甲氧基-2-异丙基吡嗪(18mmol)和α，α′-二溴-P-二甲苯(9mmol)制备出标题化合物。在二氧化硅凝胶上利用闪蒸色谱法纯化粗产品(CHCl3)。产率76%。
1H NMR(CDCl3)δ0.6-0.9(2d，12H)，2.05-2.20(m，2H);3.05(d，4H)，3.25(s，2H)，3.60(s，6H)，3.70(s，6H)，6.9(s，4H).
TLC(己烷EtOAc;12∶1)，Rf 0.32.
HPLC(50-100% MeOH，10分钟)，RT 7.87分钟
b)二甲基(S，S)-α，α′-二氨基-1，4-苯二丙酸酯如前面对m-异构物所述的那样，用0.25MHCl在室温下将前面步骤的产物(3.4mmol)分解成标题化合物。
TLC(MeCNMeOHH2O，4∶1∶1)，Rf 0.36c)(S，S)-α，α′-二氨基-1，4-苯二丙酸二氢氯化物如前面对m-异构物所述，用浓HCl加热使前述产物中的甲基酯基水解。
TLC(MeCN∶MeOH∶H2O，4∶1∶1).
1H NMR(D2O)δ0.8-0.9(2d，6H)，2.10(m，1H)，3.00(m，2H9)，3.45(d，1H)，3.81(t，2H)，7.13(s，4H).
d)(S，S)-α，α′-双(-9芴基甲氧基羰基氨基)-1，4-苯二丙酸如前面对m-异构物所述，由上述氨基酸和9-芴基甲氧基羰基氯制备出标题化合物。
TLC(庚烷∶EtOAc∶AcOH，3∶6∶1)，Rf0.58。
HPLC(40-70%MeCN，在0.1%TFA中，10分钟)，RT 4.86分钟。
1H NMR(DMSO-d6)δ2.79-3.11(m，6H)，4.09-4.21(br.s，6H)，7.13-7.92(m，20H).
FAB-MS(M+H)697.
实施例3(S，S)-α，α′-二氨基-1，2-苯-二丙酸a)α，α′-双[(2R，5S)-2，5-二氢-3，6-二甲氧基-2-异丙基-5-吡嗪基]-O-甲苯将(R)-2，5-二氢-3，6-二甲氧基-2-异丙基吡嗪(3.50g，19.00mmol)溶于无水THF(8ml)中。将溶液冷却(-78℃)，并在氮气下滴加BuLi(13ml，19.50mmol，在己烷中，1.5M)。滴加(-78℃)亲电子的、在THF(5ml)中的α，α′-二氯-O-二甲苯。将其反应混合物加热到室温过夜。除去溶剂，用己烷/乙酸乙酯(4∶1)作洗脱液用闪蒸色谱法纯化粗产品。淡黄色晶体，3.512g(79%)。Mp.109-112℃。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ0.59(6H，d，J 6.7Hz，2xCH3)，0.94(6H，d，J 6.8 Hz，2xCH3)，2.13(2H，m，2xCH)，2.95，3.45(4H，m，2xCH2)，3.28(2H，t，J3.3Hz，2xCH)，3.62(6H，s，OCH3)，3.71(6H，s，OCH3)，4.26(2H，m，2xCH)，7.05(4H，m，4xCH).13C NMR(75MHz，CDCl3)δ16.38，13.93，30.96，36.49，52.10，52.20，57.14，59.98，125.86，130.41，136.75，162.85，163.61.
C26H38N4O4计算值C，66.35;H，ε.14.
测定值C，66.03;H，8.04.
b)二甲基(S，S)-α，α′-二氨基-1，2-苯-二丙酸酯把0.5M HCl(20ml，10.00mmol)和二噁烷(20ml)加入α，α′-双[(2R，5S)-2，5-二氢-3，6-二甲氧基-2-异丙基-5-吡嗪]-O-二甲苯(1.155g，2.45mmol)中。将这种混合物在室温下搅拌达7小时。在减压、水(15ml)和氯仿(加15ml)条件下除去大部分溶剂。除去氯仿层，用浓NH3水(pH10)将水层调至碱性。用氯仿(3×20ml)提取水，对合并的氯仿层进行干燥(MgSO4)并浓缩。采用球管对球管(bulb to bulb)蒸馏法除去缬氨酸甲基酯，(0.3mmHg，50℃)，1.5小时。残渣是淡黄色的油，0.55g(80%)。
1H NMR(200MHz，CDCl3)δ1.63(4H，s，NH2)，3.02(4H，m，2xCH2)，3.71(6H，s，CCH3)，3.74(2H，m，2xCH)，7.18(4H，m，4xCH).13C NMR(50 MHz，CDCl3)δ38.26，52.47，56.10，127.48，130.80，136.73，175.92.
C14H13N2O4计算值C，59.98;H，7.19.
测定值C，59.54;H，7.04.
c)(S，S)-α，α′-二氨基-1，2-苯-二丙酯·2HCl在50℃用6N HCl(20ml)处理二甲基(S，S)-α，α′-二氨基-1，2-苯-二丙酸酯(270mg，0.963mmol)达20小时。在真空中除去水，加苯并蒸发(2×20ml)，以留下无色的固体0.313g。
1H NMR(300 MHz，D2O)δ3.18(4H，m，2xCH2)，4.12(2H，m，CH)，4.64(6H，s，NH3)，7.23(4H，m，4xCH).13C NMR(75MHz，D2O)δ32.56，53.85，128.62，130.81，133.27，171.36.
d)(S，S)-α，α′-双(9-芴基甲氧基羰基氨基)-1，2-苯-二丙酸将(S，S)-α，α′-二氨基-1，2-二丙酸二氢氯化物(130mg，0.40mmol)悬浮在六甲基二硅氮烷(7ml)和三甲基硅烷基氯(0.5ml)中，并在氮气下回流过夜。在真空中除去溶剂，残余物溶于无水二氯甲烷(10ml)。冷却(0℃)其溶液，滴加9-芴基甲氧基羰基氯(260mg，1.00mmol)在无水二氯甲烷(5ml)中的溶液。1小时后移去冷浴，将反应混合物在氮气下搅拌过夜。加入1N HCl(5ml)洗涤残余物，干燥。
产率100mg(40%)。
1H NMR(200MHz，DMSO-d6)δ2.49-3.54(14H，m，4xCH2，4xCH，2xNH)，7.29-7.84(20H，m，20xCH).13C NMR(75MHz，DMSO-d6)δ33.41，46.94，54.75，66.14，120.46，125.64，126.79，127.48，128.07，130.21，136.42，141.02，144.05，156.37，173.64.
实施例4(S，S)-α，α′-二氨基-2，5-噻吩-二丙酸a)2，5-双｛[(2R，5S)-(-)-2，5-二氢-3，6-二甲氧基-2-异丙基吡嗪基]甲基｝噻吩将(R)-2，5-二氢-3，6-二甲氧基-2-异丙基吡嗪(5.00g，27.14mmol)溶于无水THF(15ml)中。冷却溶液(-78℃)，在氮气下滴加BuLi(19ml，30.4mmol，在己烷中1.5M)。十分钟后，滴加亲电子的、在THF(10ml)中的2，5-双(氯甲基)噻吩(2.50g，13.80mmol)。让反应混合物达到室温过夜(在氮气下)。真空中除去溶剂，用闪蒸色谱法(己烷/乙酸乙酯为4∶1)纯化粗产品。
产率4.87g(75%)白色晶体，2.3%Wrong非对映体(它可用闪蒸色谱法或从乙腈中重结晶除去)Mp.79℃(MeCN)。
C24H36N4O4S计算值C，60.47，H，7.61测定值C，60.45，H，7.681H NMR(300MHz，CDCl3)δ0.63(6H，d，J6.9Hz，CH3)，0.96(6H，d，J6.9Hz，CH3)，2.16(2H，m，CH)，3.58(2H，t，J3.5Hz，CH)，3.65(6H，s，OCH3)，3.71(6H，s，OCH3)，4.23(2H，dd，CH)，6.48(2H，s，H-3，H-4).13C NMR(75MHz，CDCl3)δ16.56，18.85，31.46，34.59，51.94，52.41，56.04，60.48，125.80，137.65，161.57，164.43.
b)二甲基(S，S)-α，α′-二氨基-2，5-噻吩二丙酸酯将2，5-双｛[(2R，5S)-(-)-2，5-二氢-3，6-二甲氧基-2-异丙基-5-吡噻基]甲基｝噻吩(1.007g，2.113mmol)悬浮于二噁烷(20ml)、HCl(0.7ml，8.5mmol，12M)和水(20ml)的混合物中。四小时后于室温下加乙醚(30ml)。除掉醚相，用浓NH3水(pH10)将水相调到碱性。再用氯仿(3×30ml)提取水相。合并的有机层经干燥(MgSO4)后，除去溶剂。采用球管对球管(bulb to bulb)蒸馏法除去缬氨酸甲酯(0.5mmHg，50℃，1.5h)产率0.555g(92%)，微黄色的油。
C12H16N2O4S计算值C，50.33;H，6.34测定值C，50.79;H，6.53.
1H NMR(300 MHz，CDCl3)δ1.60(4H，bs，NH2)，3.16(4H，m，CH2)，3.70(2H，m，CH)，3.73(6H，s，OCH3)，6.68(2H，s，H-3，H-4).13C NMR(75MHz，CDCl3)δ35.26，52.02，55.52，126.32，138.19，174.85.
c)(S，S)-α，α′-二氨基-2，5-噻吩-二丙酸·2HCl在70℃用6N HCl处理二甲基(S，S)-α，α′-二氨基-2，5-噻吩-二丙酸酯(531mg，1.854mmol)达20小时。蒸发溶液，余下的水与苯共沸(2×30ml)。浅黄色晶体，613mg(100%)1H NMR(300MHz，D2O)δ3.35(4H，d，J5.9，CH2)，4.16(2H，t，J5.8Hz，CH)，4.65(8H，s，NH3)，6.78(2H，s，H-3，H-4).13C NMR(75MHz，D2O)δ29.96，54.07，128.61，135.89，171.35.
d)(S，S)-α，α′-双(9-芴基甲氧基羰基氨基)-2，5-噻吩二丙酸将(S，S)-α，α′-二氨基-2，5-噻吩二丙酸二氢氯化物(590mg，1.78mmol)悬浮于六甲基二硅氮烷(15ml)和三甲基硅烷基氯(1ml)中。将混合物回流过夜，将其溶液减压蒸发，残渣溶于无水二氯甲烷(15ml)中。将溶液冷却到0℃，在氮氯下滴加9-芴基甲氧羰基氯(1.055g，4.08mmol)在二氯甲烷(5ml)中的溶液。1小时后移去冷浴，在室温下于氮气中搅拌混合物过夜。除去溶剂，并将该化合物溶于THF(5ml)中，再加1N HCl(5ml)。2小时后除去水相，并用氯仿(3×20ml)洗涤。合并的有机层经干燥(MgSO4)后，除去溶剂，用二氯甲烷/甲醇/乙酸(10∶1∶0.1)作洗脱剂采用闪蒸色谱法纯化产品。黄色晶体0.557g(44%)。Mp.249℃(分解)。
1H NMR(200MHz，DMSO-d6)δ2.90-4.20(14H，m，CH2x4，CHx4，NHx2)，6.69(2H，s，H-3，H-4)，7.20-8.00(16H，m，CHx16).13C NMR(50MHz，DMSO-d6)δ21.47，31.50，109.50，120.20，121.56，127.50，129.15，137.71，139.83，143.00，172.00.
实施例5(S，S)-α，α′-二氨基-顺-1，2-环丙烷-二丙酸a)顺-1，2-双(溴甲基)环丙烷缓慢地将溴(6.6g，41.16mmol)加入三苯基膦(10.8g，41.16mmol)在乙腈(70ml)中的冷(0℃)悬浮液中。移去冷浴，滴加顺-1，2-双(羟甲基)环丙烷(2.02g，19.6mmol)在乙腈(5ml)中的溶液。将其混合物在室温下搅拌1小时，滤去沉淀，将滤液在真空下浓缩，将残余物溶于醚(70ml)中，过滤、浓缩，再进行真空蒸馏(12毫巴，bp135-155℃)。
产率3.463g(71%)。
1H NMR(CDCl3)δ0.44(q，J＝5.8 Hz，1H)1.18(m，1H)，1.66(m，2H)，3.50(m，4H)13C NMR(CDCl3)δ16.66，22.68，33.46b)顺-1，2-双[(2R，5S)-2，5-二氢-3，6-二乙氧基-2-异丙基-5-吡嗪基]甲基-环丙烷缓慢地将正丁基锂在己烷(1.6N，5.483ml，8.774mmol)中的溶液加入(2R)-2，5-二氢-3，6-二乙氧基-2-异丙基吡嗪(1.862g，8.774mmol)在THF(30ml)中的冷(-78℃)溶液中，继续搅拌30分钟。在此期间，缓慢地加入顺-1，2-双(溴甲基)环丙烷在无水THF(10ml)中的溶液，让其溶液达到室温过夜。通过加入pH7磷酸盐缓冲液(30ml)使该反应中止，用醚(每次30ml)两次提取该混合物。合并的有机层经干燥(MgSO4)再蒸发至干，产品用闪蒸色谱法(己烷/乙醚，8/1)分离。
产率0.609g，28%。
1H NMR(CDCl3)δ-0.15(q，J＝5.85Hz，1H)，0.5(m，1H)，0.65(d，6H)，0.99(d，6H)，1.22(dt，12H)，1.51(m，2H)，1.92(m，2H)，2.23(m，2H)，3.83(m，2H)，3.98-4.19(m，12H)13C NMR(CDCl3)δ10.51，10.90，11.08，14.37，16.55，17.03，19.02，19.12，31.41，31.59，32.54，33.31，33.70，46.78，55.83，56.15，60.26，60.38，60.52，60.55，60.68，61.03，162.87，163.03，163.26，163.38.
c)二乙基(S，S)-α，α′-二氨基氨基-顺-1，2-环丙烷二丙酸酯将HCl(1N，3.51ml)加到顺-1，2-双[(2R，5S)-2，5-二氢-3，6-二乙氧基-2-异丙基-5-吡嗪]甲基-环丙烷(430mg，0.876mmol)在二噁烷(3.5ml)中的溶液中。将其混合物在室温下搅拌1小时，接着在真空下除去二噁烷。在加入1.5ml浓氨水后，用氯仿(每次15ml)两次提取残余物，合并的提取物经干燥(MgSO4)、蒸发后，再通过真空蒸馏(55℃，0.03毫巴)除去缬氨酸酯。油状残余物由纯的标题化合物组成。
产率238mg，99.7%。
1H NMR(CDCl3/D2O)δ-0.15(q，1H)，0.68(m，1H)，0.79(m，2H)，1.22(t，J7.2Hz，6H)，1.36(m，2H)，1.78(m，2H)，3.41(m，2H)，4.10(q，J7.2Hz，4H).13C NMR(CDCl3/D2O)δ10.72，11.37，11.44，13.88，33.74，54.56，54.79，60.36，60.38，175.39，175.672.
d)二乙基(S，S)-α，α′-双(9芴基甲基氧羰基氨基)-顺-1，2-环丙烷二丙酸酯在室温下依次将Fmoc-氯(678mg，2.622mmol)和1N NaHCO3溶液(3ml)加到二乙基(S，S)-α，α′-二氨基氨基-顺-1，2-环丙烷-二丙酸酯(238mg，0.874mmol)在二噁烷(4ml)中的溶液中。搅拌30分钟后除去二噁烷，接着用氯仿(30ml)提取，蒸发除去CHCl3后的残余物经闪蒸色谱法纯化(己烷/乙酸乙酯，4/1至2/1)得到标题化合物产率483mg，77.1%。
1H NMR(CDCl3)δ-0.10(br s，1H)，0.77(br s，3H)，1.28(t，6H)，1.56(m，2H)，2.03(m，2H)，4.23(m，6H)，4.41(m，6H)，5.46(m，2H)，7.25-7.77(m，16H)13C NMR(CDCl3)δ11.05，11.24，14.13，31.77，31.82，47.16，54.11，54.28，61.49，66.93，119.93，125.01，126.99，127.65，141.26，143.72，143.86，155.69，172.11，172.28.
FAB-MSMH+717.4e)(S，S)-α，α′-双(9-芴基甲基氧羰基氨基)-顺-1，2-环丙烷-二丙酸将二乙基(S，S)-α，α′-双(9-芴基甲氧基羰基氨基)-顺-1，2-环丙烷-二丙酸酯(497mg，0.693mmol)在二噁烷(5ml)中的溶液与6N HCl(3ml)一起加热到90℃达26小时。在真空中除去二噁烷，并用氯仿(每次20ml)两次提取含水残余物。干燥(MgSO4)后蒸去溶剂，用闪蒸色谱法纯化此残余物(己烷/乙酸乙酯/乙酸，10/10/1)，含该产物的馏分经集中、真空中浓缩得到很小的体积，冷冻获得标题化合物，产率280mg，61.2%。
1H NMR(DMSO-d6/D2O)δ-0.04(m，1H)，0.56(m，1H)，0.82(m，2H)，1.41(m，1H)，1.60(m，1H)，1.74(m，1H)，1.88(m，1H)，3.97(m，2H)，4.25(m，6H)，7.27-7.88(m，16H).13C NMR(DMSO-d6/D2O)δ10.88，12.35，13.13，30.15，30.59，47.02，54.84，66.02，120.43，125.63，127.44，128.02，136.68，141.04，144.10，144.15，156.43，156.49，174.00，174.12.
FAB-MSMH+661.3实施例6(S，S)-α，α′-二氨基-顺-1，2-环丁烷-二丙酸a)顺-1，2-双(溴甲基)环丁烷将溴(1.623g，10.16mmol)缓慢地加到三苯基膦(2.664g，10.16mmol)在乙腈(15ml)中的冷(0℃)悬浮液中。移去冷浴，滴加顺-1，2-双(羟甲基)环丁烷(562mg，4.838mmol)在乙腈(5ml)中的溶液。该混合物在室温下搅拌1小时，接着在真空下除去溶剂，加醚(30ml)研碎残渣，过滤除去沉淀，滤液经浓缩后再真空蒸馏(Kugelrohr，0.3毫巴，bp110℃)
产率628mg，53.6%。
1H NMR(CDCl3)δ1.71(s，2H)，2.10(s，2H)，2.82(s，2H)，3.44(m，2H)，3.58(m，2H)13C NMR(CDCl3)δ23.72，33.69，39.45b)顺-1，2-双[(2R，5S)-2，5-二氢-3，6-二乙氧基-2-异丙基-5-二氢吡嗪基]甲基-环丁烷将正丁基锂在己烷中的溶液(1.6N，4.92ml，7.87mmol)缓慢加到(2R)-2，5-二氢-3，6-二甲氧基-2-异丙基吡嗪(1.449g，7.865mmol)在THF(30ml)中的冷(-78℃)溶液中，再搅拌30分钟。在此期间后，缓慢加入顺-1，2-双-(溴甲基)环丁烷(906mg，3.745mmol)在无水THF(4ml)中的溶液，让溶液达到室温过夜。通过加入pH7磷酸盐缓冲液(30ml)中止该反应，再用醚(每次30ml)两次提取混合物。合并的有机层经干燥(MgSO4)后再蒸发至干，用闪蒸色谱法(己烷/乙醚，8/1)分离该产品。
产率517mg，30%。
1H NMR(CDCl3)δ0.60(d，6H)，0.98(d，6H)，1.63(m，4H)，1.85(m，4H)，2.17(m，2H)，2.45(m，2H)，3.57-3.67(m，12H)，3.80-3.94(m，4H).13C NMR(CDCl3)δ16.35，16.40，19.02，24.84，25.54，31.30，31.36，33.87，34.22，34.72，34.81，51.96，52.04，52.16，54.22，54.75，60.23，60.36，162.73，163.20，164.02，164.19c)二乙基(S，S)-α，α′-二氨基氨基-顺-1，2-环丁烷-二丙酸酯将HCl(1N，4.61ml)加入顺-1，2-双[(2R，5S)-2，5-二氢-3，6-二乙氧基-2-异丙基-5-二氢吡嗪]甲基-环丁烷(517mg，1.152mmol)在二噁烷(5ml)中的溶液中，混合物在室温下搅拌1小时，接着真空下除去二噁烷。在加1.5ml浓氨水后，用氯仿(每次15ml)两次提取其残余物，合并的提取物经干燥(MgSO4)、蒸发后再通过真空蒸馏(55℃，0.03毫巴)除去缬氨酸酯，油状残余物由纯的标题化合物组成。
产率293mg，98.5%。
1H NMR(CDCl3)δ1.36(br s，4H)，1.50(m，4H)，1.74(m，2H)，1.91(m，2H)，2.43(m，2H)，3.24(m，2H)，3.59(m，6H)13C NMR(CDCl3)δ24.02，24.80，33.54，33.86，35.07，35.67，51.56，51.68，52.47，53.03，176.25，176.59d)二乙基(S，S)-α，α′-双(9-芴基甲基氧羰基氨基)-顺-1，2-环丁烷二丙酸酯依次将Fmoc-氯(880mg，3.402mmol)和1N NaHCO3溶液(3ml)在室温下加到二乙基(S，S)-α，α′-二氨基氨基-顺-1，2-环丁烷-二丙酸酯(293mg，1.134mmol)在二噁烷(4ml)中的溶液中。在搅拌30分钟后除去二噁烷，并用氯仿(30ml)提取，其后用闪蒸色谱纯化(己烷/乙酸乙酯1/1至2/1)蒸去CHCl3后留下的残余物，得到标题化合物。
产率572mg，71.8%。
1H NMR(CDCl3)δ1.77(m，4H)，2.00(m，6H)，2.25(m，2H)，3.74(m，6H)，4.10-4.50(m，6H)，5.10-5.20(m，2H)，7.27-7.77(m，16H)13C NMR(CDCl3)δ24.38，24.95，33.01，33.18，33.68，33.78，47.15，52.19，52.30，52.40，52.65，66.93，119.92，125.01，126.98，127.65，141.25，143.67，143.79，155.63，155.91，172.84，173.16e)(S，S)-α，α′-双(9-芴基甲基氧羰基氨基)-顺-1，2-环丁烷-二丙酸二乙基(S，S)-α，α′-双(9-芴基甲氧基羰基氨基)-顺-1，2-环丁烷-二丙酸酯(572mg，0.874mmol)在二噁烷(5ml)中的溶液与6N HCl(3ml)一起加热到65℃达20小时。真空下除去二噁烷，用氯仿(每次20ml)二次提取含水残余物，干燥(MgSO4)后蒸去溶剂，再用闪蒸色谱法(己烷/乙酸乙酯/乙酸，10/10/1)纯化残余物。将含产物的馏份沉淀后，在真空下浓缩得到小的体积，冷冻得到白色粉末的标题化合物。
产率316mg，57.5%。
1H NMR(DMSO-d6/D2O)δ1.4-2.0(m，6H)，2.40(m，2H)，3.6(br，2H)，3.82(m，2H)，4.25(m，6H)，7.26-7.90(m，16H)13C NMR(DMSO-d6/D2O)δ23.58，24.77，31.00，32.12，33.62，46.98，51.84，53.08，65.83，120.37，125.55，127.36，127.94，141.00，144.01，144.05，144.11，156.27，156.43，174.13，174.55.
实施例7(S，S)-α，α′-二氨基-反-1，4-环己烷-二乙酸a)反-1，4-双(1S，4R)-3，6-二甲氧基-4-异丙基-2，5-二氢吡嗪基)-环己烷将1.6M n-BuLi(9.6ml，15.3mmol)滴加到反式-1，4-双[(2R，5S)-2，5-二氢-3，6-二甲氧基-2-异丙基-5-吡嗪基环己烷在THF(48ml)中的溶液中。1小时后，滴加1，4-反-二溴环己烷(1.82g，7.5mmol)在THF(5ml)中的溶液。让混合物达到室温过夜，并用1M磷酸盐缓冲液(pH＝7)中止反应。用乙醚(100ml)和水(20ml)稀释其混合物，并分离成层。用醚(2×150ml)两次提取含水层，合并的有机层经干燥(MgSO4)、过滤、浓缩，再用闪蒸色谱法纯化(二氧化硅胶，己烷∶醚＝12∶1)。由合并馏分得到的产物经MeOH(100ml)重结晶。
产率2.774g(6.18mmol，82.4%)1H NMR(300MHz，CDCl3)δ＝3.91(t，2H，J＝3.6Hz)，3.86(q，2H，J＝3.0Hz)，3.69(s，6H)，3.68(s，6H)，2.67(d sept，2H，J＝3.0，6.9Hz)，1.78-1.54(m，8H)，1.05(d，6H，J＝6.9Hz)，0.97(m，2H)，0.66(d，6H);13C NMR(75MHz，CDCl3)δ＝163.23，163.15，60.30，59.95，52.24，41.30，31.40，28.91，26.17，19.03，16.38.
FAB-MS m/z 449(M++1).
C24H40N4O4(448.60).计算值C，64.26;H，8.98;N，12.49.
测定值C，64.20;H，9.04;N，12.37.
b)二甲基(S，S)-α，α′-二氨基-反-1，4-环己烷-二乙酸将步骤(a)得到的化合物(1.00g，2.23mmol)溶于二噁烷(17.8ml)中，再加0.5M HCl(17.8ml，8.92mmol)，其混合物在室温下搅拌12小时。用抽气真空下除去二噁烷，用水稀释残余物，再用醚(3×30ml)提取。将合并的CHCl3-层干燥(MgSO4)、过滤和浓缩，残余物转移到Kugelrohr装置中，在25-50℃于0.1托下除去缬氨酸甲酯。
产率530mg(2.05mmol，92%)。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ＝3.68(9s，6H)，3.26(d，2H，J＝5.1Hz)，1.72-1.54(m，6H)，1.26-1.19(m，2H)，1.13-1.06(m，2H);13C NMR(75MHz，CDCl3)δ＝175.83，59.22，51.74，41.64，29.10，27.17.
c((S，S)-α，α′-二氨基-反-1，4-环己烷-二乙酸上述化合物(442mg，1.71mmol)在6N HCl(10ml)中的溶液在50℃加热14小时。在其混合物达到室温以后，在旋转蒸汽上(rotavap)蒸去挥发性化合物，残余物溶于水中(不完全)。加入乙醇，混合物置于冰箱中过夜。然后过滤沉淀，用醚洗涤，再干燥。
产率378mg(1.25mmol，72.9%)1H NMR(300MHz，D2O，DCl)δ＝3.63(m，2H)，1.68-1.43(m，6H)，1.00(dd，2H)，0.89(dd，2H).13C NMR(75MHz，D2O/DCl)δ＝170.77，56.96，37.30，26.90，26.71.
FAB-MS m/z 231(M+-72);
C10H22N2O4(258.31).
d)(S，S)-α，α′-双(9-芴基甲基氧羰基氨基)-反-1，4-环己烷-二乙酸将FmocCl(1.43g，5.54mmol)在二噁烷(3ml)中的溶液，接着是1M NaOH(8.31ml，8.31mmol)依次加入到由步骤(c)得到的氨基酸(420mg，1.38mmol)在水(4ml)和二噁烷(4ml)中的溶液中，其混合物搅拌过夜。得到的浆体用乙醚(2×30ml)提取。含水层用6M HCl酸化，再用CHCl3提取(3×30ml)。CHCl3-相经浓缩后用闪蒸色谱法纯化(二氧化硅凝胶，己烷∶乙酸乙酯∶乙酸＝10∶10∶1)产率648mg(0.96mmol，69.5%0。
1H NMR(300MHz，DMSO)δ＝7.87(d，4H，J＝7.5Hz)，7.73(d，4H，J＝7.5Hz)，7.41(t，4H，J＝7.5Hz)，7.33(t，4H，J＝7.5Hz)，4.30-4.20(m，6H)，3.86(t，2H)，1.75-155(m，6H)，1.25-0.95(m，4H).13C(DMSO)δ＝173.60，156.64，144.29，144.17，141.10，128.02，127.45，125.77，120.48，66.05，59.35，47.10，29.14，27.90，21.51.
FAB-MS m/z 677(M++1).
C40H40N2O8(676.76).计算值C，70.99;H，5.96;N，4.14.
测定值C，68.9;H，6.08;N，3.99.
实施例8(S，S)-α，α′-双(9-芴基甲氧基羰基氨基)-1，4-苯二乙酸a)(S，S)-β，β′-二氧-β，β′-双(4-苯甲基-2-氧-3-噁唑烷基)-1，4-二乙基苯将(4S)-4-苯甲基-2-噁唑烷酮(1.086g，6.13mmol)和三苯基甲烷(指示剂)(2.5mg)在无水THF(10ml)中的溶液在氩气下于-78℃搅拌，并用1.6M nBuLi(3.83ml，6.13mmol)进行滴加处理，直到橙色不变。在加nBuLi时，其溶液保持在-65℃到-78℃。在再冷却到-78℃之后，溶液用1，4-苯二乙酰氯(0.75g，3.25mmol)处理2分钟以上。将得到的混合物加热到25℃，并用10ml饱和碳酸氢钠水溶液处理，在25℃搅拌30分钟，将混合物用三份二氯甲烷提取。将二氯甲烷提取物合并，用5%碳酸钠水溶液洗涤，用盐水洗涤，干燥(MgSO4)和蒸发。粗产物用闪蒸色谱法纯化，用己烷∶乙酸乙酯＝1∶2洗脱。
产率(白色固体)698mg(45%)。
1H NMR(200MHz，CDCl3)δ2.77(dd，J9.4，13.3Hz，CHHPh)，3.28(dd，J3.2，13.3Hz，CHHPh)，4.18-4.22(m，CH2O)，4.31(s，CH2CO)，4.64-4.72(m，CHN)，7.35-7.13(m，14H，芳香族).13C NMR(50MHz，CDCl3)δ37.7，41.2，55.2，66.0，126.9，128.5，129.0，132.1，134.7，152.9，b)(S，S，S，S)-α，α′-二叠氮基-β，β′-二氧-β，β′-双(4-苯甲基-2-氧-3-噁唑烷基)-1，4-二乙基苯将(S，S)-β，β′-二氧-β，β′-双(4-苯甲基-2-氧-3-噁唑烷基)-1，4-二乙基苯(1，4g，2.73mmol)在无水THF(25ml)中的预冷却(-78℃)溶液，通过套管加入到0.5M双(三甲基硅烷基)酰胺钾(12ml，6.01mmol)在甲苯(用无水THF(30ml)稀释)中的预冷却(-78℃)溶液中。30分钟后，生成的烯醇酚钾溶液通过套管用溶于无水THF(15ml)的2，4，6-三异丙基苯磺酰叠氮化物(trisylazide)(2.02g，6.55mmol)-78℃溶液处理。在该溶液搅拌2分钟后，加冰乙酸(0.983g，16.98mmol)中止其反应。将浆体立刻用水浴加热到25℃，并在该温度搅拌1.5小时。然后让反应浆体在200ml盐水和250ml乙酸乙酯之间分配，水相用100ml乙酸乙酯洗涤两次。合并的有机提取物用烯碳酸氢钠水溶液洗涤，置于硫酸钠上干燥，并真空浓缩。粗产物用闪蒸色谱法纯化，此时第一次用己烷∶乙酸乙酯＝2∶1，然后用乙酸乙酯进行洗脱。该产物再用闪蒸色谱法纯化，此时第一次用己烷∶乙酸乙酯＝2∶，然后用己烷∶乙酸乙酯＝1∶2进行洗脱。
产率(浅黄玻璃状泡沫体)698mg(43%)。
1H NMR(200MHz，CDCl3)δ2.88(dd，J9.4，13.3Hz，CHHPh)，3.41(dd，J3.2，13.3Hz，CHHPh)，4.17-4.20(m，CH2O)，4.64-4.73(m，CHN)，6.13(s，CHN3)，7.21-7.42(m，10H，芳香族)，7.50(s，4H，芳香族).13C NMR(50MHz，CDCl3)δ37.9，55.8，63.1，66.6，127.2，128.7，128.9，129.0，133.7，134.1，152.0，168.2.
c)(S，S)-α，α′-二叠氮基-1，4-苯二乙酸在0℃将LiOH·H2O(0.222g，5.29mmol)在水(8ml)中的溶液滴加到(S，S，S，S)-α，α′-二叠氮-β，β′-二氧-β，β′-双(4-苯甲基-2-氧-3-噁唑烷基)-1，4-二乙基苯(0.683g，1.15mmol)在THF(16ml)中的溶液中。该溶液在0℃搅拌1小时，加入稀碳酸钠水溶液，再用乙酸乙酯提取出噁唑烷酮。有机提取物用稀的碳酸钠水溶液洗涤两次，合并的含水提取物加硫酸氢钾水溶液进行酸化，再用乙酸乙酯(2X)提取其产物，其溶液置于硫酸钠上干燥并蒸发，残余物在下步使用时无须进一步纯化。
产率206mg(65%)
1H NMR(200MHz，CDCl3/DMSO-d6)δ4.93(s，CH)，7.40(s，Ph).13C NMR(50MHz，CDCl3/DMSO-d6)δ67.5，126.6，134.0，170.1.
d)(S，S)-α，α′-二氨基-1，4-苯二乙酸将10%Pd/C(70mg)加入到(S，S)-α，α′-二叠氮-1，4-苯二乙酸(180mg，0.65mmol)在乙醇∶乙酸＝8∶1(12ml)中的溶液中。得到的反应浆体在15psi H2条件下氢化4小时。然后反应浆体经过硅藻土过滤，硅藻土滤饼用几份乙醇洗涤。真空中除去溶剂，再通过与甲苯共沸蒸馏除去乙酸。在乙酸乙酯中沉淀白色固体，过滤与真空干燥。产率99mg(68%)，1H NMR(200MHz，D2O)δ5.16(s，CH)，7.48(s，芳族化合物)。
e)(S，S)-α，α′-双(9-芴基甲氧基羰基氨基)-1，4-苯二乙酸将α，α′-二氨基-1，4-苯二乙酸(45mg，0.2mmol)在六甲基二硅氮烷(5ml)和三甲基氯硅烷(0.5ml)的混合物中的悬浮液在氢气下于100℃搅拌过夜。冷却反应混合物，再真空除去过量的硅烷化试剂。残余物再溶于无水的二氯甲烷(5ml)中，并在冰/水浴中冷却。添加9-芴基甲氧基羰基氯(109mg，0.42mmol)在无水二氯甲烷(2ml)中的溶液，该反应混合物在氩气下搅拌3小时，蒸去二氯甲烷后，将其残余物溶于THF(4ml)和水(0.5ml)的混合物中。将混合物搅拌30分钟后蒸发。取残余物放在乙酸乙酯中，并用水洗涤几次。有机相经干燥(MgSO4)后，过滤与蒸发。粗产物用闪蒸色谱法纯化，用乙酸乙酯∶乙酸＝95∶5洗脱。
产率(浅黄色固体)48mg(40%)。
1H NMR(200MHz，DMSO-d6)δ4.20-4.50(m，CH and CH2)，4.88(s，CHN)，7.20-8.0(m，20H，aromatics).13C NMR(50MHz，DMSO-d6)δ46.8，65.5，77.7，119.9，127.0，127.8，128.1，128.5，136.7，140.5，143.7，155.9，172.8.
实施例9肽的合成(pGlu-Glu-Asp)2-[(m)-Xyl](Lys)2用Labortec肽合成器合成该肽。将Fmoc-Lys(Boc)·Sasrin聚合物(1.0g，0.6mmol;Bachem A.G.;取代0.6mmol/g)装入100ml反应瓶中，再将Fmoc-[(m)-Xyl](160mg，0.23mmol)、DCC(290mg，1.4mmol)和HOBt(211mg，1.4mmol)在DMF(20ml)中的溶液加入到该聚合物中，让反应进行9小时，补加DCC(1.4mmol)和HOBt(1.4mmol)，再让反应进行2小时，然后用CH2Cl2、30%MeOH在CH2Cl2中的溶液和DMF洗涤该聚合物。用10%Ac2O在DMF中的溶液使聚合物上的游离氨基烷基化(一小时3次;阴性Kaiser试验)。
余一的合成使用Fmoc-Asp(OtBu)-Opfp(1.33g，2.3mmol)、Fmoc-Glu(OtBu)-Opfp(1.35g，2.3mmol)和pGlu-五氯苯基酯(0.86g，2.3mmol)采用标准程序进行。每个偶合步骤都加HOBt(3.50mg，2.3mmol)，进行1小时。通过阴性Kaiser试验可确定偶合完成情况。在与Fmoc-氨基酸偶合之后用DMF洗涤聚合物，用20%哌啶在DMF中的溶液分裂保护基团，将聚合物再次用DMF洗涤。在最后偶合完成之后，用MeOH/CH2Cl2和CH2Cl2洗涤聚合物。干的聚合物-肽的重量是1g。用TFA∶CH2Cl21∶1从聚合物中分裂出肽，溶液冷冻干燥，残余物溶于水，过滤(0.45μ)和滤液冷冻干燥。为进一步纯化，将100mg这种产物溶于水(0.5ml)中，并用2.1×1.5cm Beckman Ultrasphere OSO和溶液A0.1%TFA水溶液、B0.1%TFA MeCN∶H2O(40∶60)溶液进行制备性HPLC。梯度是0-15%B，120分钟，流速5ml/分，在将所收集的均匀馏分冷冻干燥后得到19mg纯肽(＞95%)。
实施例10肽的固相合成主要根据芴甲氧基羰基(Fmoc)-聚酰胺合成路线的原理(Atherton和Sheppard，Solid phase peptide synthesisa practical approach.Oxford IRL Press at Oxforcl Clniversity Press，1989)进行固相肽的合成，使用从市场上可采购到的合成树脂;手工或用半自动化仪器(Labortec Reptidl Synthesizer 5P 650)进行批量合成时，这些树脂是带有酸不稳定的(Wang，J.Am.Chem.Soc.，95，1328-1333，1973)或酸高度不稳定的交联剂(Merger等人，Tetrahedron Letters 29，4005-4008，1988)的聚苯乙烯。用LKB Biolynx 4170 Automatcd Peptide Synthesizer可以全自动方式在流动树脂上(Atherton等人，J.Chem.Soc.Chem.Commun.，1151-2，1981)组配肽。购买的合成树脂已含有所要的被保护C-端Fmoc-氨基酸残基。采用二环己基碳化二亚胺(DCC)/1-羟基苯并二唑(HOBt)(Koenig和Geigtr，Chem.Ber.103，2034-2040，1070)活化或采用偶合剂PyBOP(Coste等人，Tetrahedron Lett.，31，205-208，1990)，用侧链被保护的Fmoc-氨基酸五氟苯基酯(Kisfaludy和Schoen，Synthesis，325-327，1983)获得不同程度的伸长链。赖氨酸侧链氨基用叔丁基氧羰基保护，谷氨酸和天冬氨酸的侧链羧基以叔-丁酯保护。
带有所需的N-去保护的C-端残基的合成树脂，用半当量Fmoc受保护的二氨基二羧酸借助DCC和HOBt而进行酰化。完成反应之后洗去过量的试剂，然后再一次用DCC/HOBt处理肽树脂，以便固定可能仍保持游离状态的羧基。在这个步骤之后，用甲醇洗涤树脂，使任何羧基失活，使之不能与和树脂结合的氨基键合。最后将过量的氨量通过酰化封住。然后肽的合成如通常方式继续下去。
在所需序列完成固相组配以后，使用加有适宜清除剂(King等人，Int.J.PeptidlProtein Res，36，255-268，1990)的三氟乙酸，利用伴随的侧链去保护过程而从合成树脂中分裂出肽。蒸发之后，用乙醚沉淀分离出肽，并干燥。然后用制备性反相高效液体色谱法进行纯化。
表1对通式结构(Pyr-Glu-Asp)2-桥连残基-(Lys-OH)2的肽的分析数据桥残基类型aHPLC方法b纯度cFAB-MS(保留时间) (%) [M+H]+1,2-苯二丙酸酯 0-30-20(20) 98 1219.11,3-苯二丙酸酯 0-30-20(19) 96 1219.81,4-苯二丙酸酯 10-40-20(18) 95 12192,5-硫苯二丙酸酯 0-30-20(18) 98 1225.3顺-1,2-环丙烷二丙酸酯 0-30-20(15) 100 1183.5顺-1,2-环丁烷二丙酸酯反-1,4-环己烷二丙酸酯 0-30-20(14) 99 1197.81,4-苯二乙酸酯a指实施例b该方法是在整个时间里以移动相B在A中的梯度表示的，例如10-40-20系指在10开始的梯度和在20分钟以40%B完成的梯度。移动相A)0.1%TFA B)0.1%TFA在40%MeCN中。柱Vydac TP54，C18，0.46×25μm，5μm柱，100
孔。流速1ml/分。
c系指HPLC色谱峰的积分(λ＝215nm)。
表2具有通式结构(Pyr-Glu-Asp)2-桥连残基-(Lys-OH)2的肽的氨基酸分析数据桥连残基类型aAsp测定值 Glu测定值 Lys测定值(理论) (理论) (理论)1,2-苯二丙酸酯1,3-苯二丙酸酯1,4-苯二丙酸酯 1.0(1) 2.16(2) 0.93(1)2,5-硫苯二丙酸酯顺-1,2-环丙烷二丙酸酯顺-1,2-环丁烷二丙酸酯反-1,4-环己烷二丙酸酯 1.0(1) 2.12(2) 0.81(1)1,4-苯二乙酸酯a系指实施例
权利要求
1.含有两个单链血调节肽的化合物，所述肽由二价桥基团-A-连接在一起，该桥基团在末端连接到在每个所述肽的等效位置中非末端氨基酸的Cα原子上，其中连接到基团-A-上的Cα原子的原来侧链没有，所述二价桥基团-A-是式中每个y独立地是0、1或2；每个z独立地是0或1；每个Y独立地是O、S或NR，R代表氢或与C连接的有机基团，B代表碳环或杂环，其杂环任意地含一或二个杂原子和任意地由-ORA、-NRARA、-COORA或卤原子进行一次取代、二次或三次取代的杂环；每个RA独立地代表氢原子、烷基、链烷酰基、烷氧基烷基，其中每个基团也可羟基化。
2.根据权利要求1所述的肽化合物，其中所述的二价桥基团-A-是-CH2CH2BzCH2CH2-其中Bz代表由-ORA、-NRARA、-COORA基团或卤素原子任选地作一次取代、二次或三次取代的苯环，RA如权利要求1所定义。
3.根据权利要求1或2之任一权利要求所述的肽化合物，其特征在于所述单链血调节肽具有化学式Ⅰ其中Ra代表
式中n和m独立地代表0或1;p、q和r独立地代表1或2;s代表3或4;R1和R2两者都是氢原子或一起代表氧基;R3和R4两者都是氢原子或一起代表C-C键;R5是氢或酰基;R6和R7独立地代表羟基或氨基，但最好是羟基，R8代表氢;C2-6烷基;C7-20芳烷基，它可以带一个或多个羟基、氨基或甲氧基取代基;或在代谢上不稳定的S-保护基;R9代表氢或甲基;R10代表羟基或氨基，氨基酸谷氨酸的残基，或具有N-端谷氨酸单元的肽。
4.根据权利要求3所述的肽化合物，其中在化学式Ⅰ的肽链中n代表O。
5.根据权利要求3或4之任一权利要求所述的肽化合物，其中化学式Ⅰ的肽链中m代表O。
6.根据权利要求3-5之任一权利要求所述的肽化合物，其中所述桥基团-A-连接到化学式Ⅰ的氨基酸Rd的Cα原子上。
7.根据权利要求3-6之任一权利要求要求所述具有化学式Ⅱ的肽化合物
其中-A-如权利要求1所限定，Ra、Rb、Rc、Re、Rf和n都如权利要求3所限定。
8.根据权利要求1-7之任一权利要求所述的肽化合物，其化学式如下
其中-A-如权利要求1所限定。
9.一种含如权利要求1-8之任一权利要求所述的肽化合物以及药物载体或赋形剂的药物组合物。
10.根据权利要求1-8之任一权利要求所述的肽化合物应用于刺激细胞分裂。
11.根据权利要求1-8之任一权利要求所述的肽化合物应用于刺激骨髓细胞生成或骨髓的再生。
12.根据权利要求1-8之任一权利要求所述的肽化合物用于生产刺激细胞分裂的药物。
13.根据权利要求12所述的在生产刺激骨髓细胞生成或骨髓再生的药物中的应用。
14.根据权利要求1-8之任一权利要求所述肽化合物刺激细胞分裂方面的应用。
15.根据权利要求14所述在刺激骨髓细胞生成或骨髓再生方面的应用。
16.刺激病人中细胞分裂的方法，所述方法包括给所述病人施用根据权利要求9所述的有效量组合物。
17.根据权利要求16所述方法，其特征在于刺激骨髓生成或骨髓细胞的分裂。
18.生产权利要求1-8之任一权利要求所述的肽化合物的方法，其中包括使部分或全部被保护的肽化合物的衍生物去保护。
19.生产权利要求1-8之任一权利要求所述的肽化合物的方法，所述方法包括a)将双-内酰亚胺金属取代随后将其烷基化生成双内酰亚胺双肽醚，b)使步骤(a)的双-内酰亚胺双肽醚水解生成桥连的α，α′-二氨基酸，c)将余下的氨基酸加入肽链中，d)使任何被保护的基团去保护。
20.具有下述化学式的桥连α，α′-二氨基酸
其中-A-如权利要求1所限定。
21.具有下述化学式的双-内酰亚胺双肽醚
其中-A-如权利要求1所限定。
全文摘要
本发明公开了双肽化合物，其中两个肽链通过二价桥基团-A-连接到非末端氨基酸的C
文档编号C07D333/24GK1085911SQ9310840
公开日1994年4月27日 申请日期1993年6月2日 优先权日1992年6月2日
发明者K·安德海姆 申请人:哈夫恩伦·尼卡姆德公司