专利名称：一锅法液相合成胸腺五肽的工艺的制作方法
技术领域：
本发明属生物化学领域，特别涉及一种活性肽类物质的制备工艺方法。
背景技术：
胸腺中含有许多与免疫活性相关的活性肽类物质，其粗提物中含有15种以上的活性肽。胸腺生成素II(ThymopoietinII)是其中一种重要的活性成份。该活性肽由49个氨基酸构成，分子量为5562道尔顿，该分子的32-36位残基片段是胸腺生成II的活性片段，具有原分子的各种活性，被称为胸腺五肽(TP-5)。胸腺五肽分子结构简单(TP-5，Arg-Lys-Asp-Val-Tyr)，很容易用肽的化学合成法合成。TP-5已于1985年在意大利上市，商品名为Timunox，在美国也有数家药厂正在研究开发。国内海南省中和药业有限公司生产的注射用“胸腺五肽”冻干粉针剂已在国内销售。该药对癌症病人免疫功能恢复有明显疗效；可辅助手术，放疗、化疗方案得以很好完成，且可防治感染等并发症。对乙型肝炎的治疗、重大外科手术及严重感染、自身免疫性疾病也有很好的效果。目前TP-5的合成方法大体分为液相合成法和固相合成法两种。
跟本发明最相近的现有技术是液相法合成胸腺五肽。该方法以叔丁氧羰基(tBoc)保护的氨基酸衍生物为原料，经二肽合成——三肽合成——四肽合成——五肽合成——粗品生成的合成过程，合成过程要经过脱保护——偶联——纯化——重结晶的循环过程，即合成肽的中间产物都需要纯化和再重结晶。所说的脱保护是以氢氟酸(HF)脱除保护基，所说的纯化是以C18反相高效液相色谱(C18RP-HPLC)纯化产物。
现有的液相法合成胸腺五肽，由于在纯化过程中使用乙腈作溶剂，用量大，成本高；由于多次循环进行耗时多的纯化和重结晶过程，使得合成胸腺五肽的工艺时间太长；由于HF的高危险性，最后一步的HF切割肽与树脂键和脱除保护基需在特殊的装置中完成，使工艺过程和所用设备繁杂。

发明内容
本发明要解决的技术问题是简化工艺、减少工时、降低成本、安全操作，制备高活性、高纯度的胸腺五肽产品。
本发明要解决的技术问题是通过改变工艺过程实现的。即发展了一种新工艺——一锅法合成胸腺五肽(TP-5)。该工艺从原理上是介于tBoc和Fmoc之间的一种液相法，以三氟甲磺酸(TFMSA)系统脱除保护基，并以离子交换法完成产品纯化。
具体的工艺内容是，以氨基酸衍生物为原料，过程有二肽合成——三肽合成——四肽合成——五肽合成——粗品生成；其特征在于，肽合成过程所加的偶联原料按各肽合成顺序是酪氨酸衍生物和叔丁氧羰基缬氨酸(BOC-Val-OH)或者酪氨酸衍生物和芴甲氧羰基缬氨酸(Fmoc-Val-OH)、芴甲氧羰基天冬氨酸或叔丁氧羰基天冬氨酸、(Fmoc-Asp-OH或BOC-Asp-OH)、芴甲氧羰基赖氨酸(Fmoc-Lys-OH)、芴甲氧羰基精氨酸(Fmoc-Arg-OH)；各肽合成过程包括偶联—酸碱洗脱—除水干燥—脱保护基的过程；所说的偶联是在三氯甲烷溶解的酪氨酸或合成过程得到的经脱保护基的短肽中加入偶联原料进行偶联反应；所说的酸碱洗脱是将经偶联过程得到的反应液用碳酸钠溶液、水、柠檬酸溶液萃取洗，且每种溶液洗2～5次，收集有机相；所说的除水干燥是将有机相加无水硫酸镁除水，减压蒸馏除去有机溶剂，得固体再真空干燥；所说的脱保护基是将除水干燥后得到的样品溶于三氯甲烷，加入三氟乙酸(TFA)溶液或哌啶/三氯甲烷溶液，搅拌脱除BOC保护基或Fmoc保护基；所说的粗品生成是合成五肽后，脱BOC保护基或Fmoc保护基，加入三氟甲磺酸/三氟乙酸(TMFSA/TFA)、苯甲硫醚或加入三氟甲磺酸硅烷酯/三氟乙酸、苯甲硫醚脱除剩余保护基，乙醚沉淀，制得粗品。
前述的酪氨酸衍生物可以是酪氨酸苄酯盐酸盐(H-Tyr-Obzl·HCl)，合成二肽或合成三肽既可以采用叔丁氧羰基(Boc)系统，也可以采用芴甲氧羰基(Fmoc)系统。即合成的二肽是Boc-Val-Tyr(Bzl)Obzl或者是Fmoc-Val-Tyr(Bzl)-Obzl；合成的三肽是Fmoc-Asp(Obut)-Val-Tyr(Bzl)-Obzl或者是Boc-Asp(OBzl)-Val-Tyr(Bzl)-OBzl。这样做有利于提高产率。
前述的酸碱洗脱中，用于萃取洗的碳酸钠溶液、柠檬酸溶液浓度可以是3％至10％。
在粗品生成过程的脱保护中，是以三氟甲磺酸-巯基茴香醚(TFMSA-thioanisole)系统脱除保护基，或以三氟甲磺酸硅烷酯-巯基茴香醚(TMSOTf-thioanisole)系统脱除保护基。与背景技术相比，这是一个创新的方法。
与背景技术不同的是，只对最后产品进行纯化处理。纯化过程是以弱酸性和强酸性离子交换树脂纯化TP-5粗品，以稀氨水洗脱产物；或以弱碱性和强碱性离子交换树脂纯化TP-5，以醋酸进行洗脱。经纯化处理后，产品的纯度更高。
本发明由于中间过程不需要耗时较长的纯化和重结晶过程，使工艺简单快速；由于不使用乙腈溶剂，生产成本大大降低；由于不使用HF而使操作安全；产品的质量也达到国内药检标准，纯度达95％以上。
具体实施例方式
实施例1 二肽(Boc-Val-Tyr(Bzl)-Obzl)的合成称取H-Tyr(Bzl)-OBzl·HCL(M.W 397.9，1.99克，5毫摩尔)，加入三氯甲烷15毫升左右于25-30℃下，搅拌、溶解。用N-甲基吗啡啉(NMM)调pH到7至8。向其中加入1.3倍过量的Boc-Val-OH(M.W217.27，1.41克，6.5毫摩尔)，BOP试剂(M.W442.5，2.87克，6.5毫摩尔)，HOBt(M.W153.15，0.99克，6.5毫摩尔)，搅拌、进行偶联反应2小时。用薄层层析(TLC)、硫酸铈显色，监测反应完成情况。
反应液经酸碱洗脱、除水干燥处理后，得Boc-Val-Tyr(Bzl)-OBzl2.51克，收率89.66％。
实施例2 三肽(Fmoc-Asp(Obut)-Val-Tyr(Bzl)-Obzl)的合成取Boc-Val-Tyr(Bzl)-OBzl2.51克，用4毫升三氯甲烷溶解，经脱保护基处理脱去Boc保护基。产物用三氯甲烷溶解，NMM调pH至7-8。向其中加入1.3倍过量的Fmoc-Asp(OBut)-OH 2.4克，BOP试剂2.57克，HOBt0.89克，NMM 640微升，于室温搅拌、进行偶联反应2小时。用TLC、硫酸铈显色，监测反应完成情况。
反应液经酸碱洗脱、除水干燥处理后，得Fmoc-Asp(Obut)-Val-Tyr(Bzl)-OBzl，85％收率。
实施例3 四肽(Fmoc-Lys(Boc)-Asp(Obut)-Val-Tyr(Bzl)-Obzl)的合成取Fmoc-Asp(Obut)-Val-Tyr(Bzl)-OBzl用10至15毫升三氯甲烷溶解，经脱保护基处理脱除Fmoc保护基。产物用三氯甲烷溶解，加入1.3倍过量的Fmoc-Lys-(Boc)-OH，BOP，HOBt，NMM，于室温搅拌、进行偶联反应2小时。用TLC、硫酸铈显色，监测反应完成情况。
反应液经酸碱洗脱、除水干燥处理后，得Fmoc-Lys(Boc)-Asp(Obut)-Val-Tyr(Bzl)-OBzl，90％收率。
实施例4 五肽(Fmoc-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Asp(Obut)-Val-Tyr(Bzl)-Obzl)的合成取Fmoc-Lys(Boc)-Asp(Obut)-Val-Tyr(Bzl)-OBzl用15毫升左右三氯甲烷溶解，经脱保护基处理脱除Fmoc保护基。产物用三氯甲烷溶解，加入1.3倍过量的Fmoc-Arg(Pbf)-OH，BOP试剂，HOBt，NMM，于室温搅拌、进行偶联反应2小时。用TLC、硫酸铈显色，监测反应完成情况。
反应液经经酸碱洗脱、除水干燥处理后，得Fmoc-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Asp(Obut)-Val-Tyr(Bzl)-OBzl，80％收率。
实施例5 粗品(H-Arg-Lys-Asp-Val-Tyr-OH)的生成①脱Fmoc保护基将Fmoc-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Asp(Obut)-Val-Tyr(Bzl)-OBzl经脱保护基处理脱去Fmoc保护基。
②脱剩余的保护基向已脱Fmoc保护基的五肽中加入适量的1M TFMSA/TFA、苯甲硫醚，于冰浴中，搅拌、反应2小时，脱除剩余保护基。反应液用预冷的乙醚沉淀，离心、真空干燥，得H-Arg-Lys-Asp-Val-Tyr-OH粗品，95％收率。
用三氟甲磺酸硅烷酯替代三氟甲磺酸(TFMSA)脱剩余的保护基，方法与效果是一样的。
实施例6 纯化处理采用离子交换层析的方法对粗品进行纯化。纯化分离是根据TP-5在不同pH条件下，所带电荷不同，TP-5与树脂的吸附能力不同，采用pH梯度进行洗脱，收集样品峰。
具体实验条件纯化仪器P.E公司BioCAD 700E型纯 化 柱POROS CM 4.6mm×100mm溶剂系统A相 水，pH＝5.5B相 氨水，pH＝11.0梯度洗脱，B相由0％到100％。
实施例7 脱Boc保护基将样品用适量的三氯甲烷溶解，加入TFA溶液，于室温下搅拌、反应1小时，脱除Boc保护基。将反应液减压蒸馏除过量的TFA、有机溶剂，得黄色固体，真空干燥。
实施例8 脱Fmoc保护基将样品用适量的三氯甲烷溶解，加入20％哌啶/三氯甲烷溶液，于室温下搅拌、反应1小时，脱除Fmoc保护基。将反应液减压蒸馏除过量的哌啶、有机溶剂得黄色油状物。用石油醚洗2次(2×25ml)，得固体。
权利要求
1.一种一锅法液相合成胸腺五肽的工艺，以氨基酸衍生物为原料，过程有二肽合成——三肽合成——四肽合成——五肽合成——粗品生成；其特征在于，肽合成过程所加的偶联原料按各肽合成顺序是酪氨酸衍生物和叔丁氧羰基缬氨酸或者酪氨酸衍生物和芴甲氧羰基缬氨酸、芴甲氧羰基天冬氨酸或叔丁氧羰基天冬氨酸、芴甲氧羰基赖氨酸、芴甲氧羰基精氨酸；各肽合成过程包括偶联—酸碱洗脱—除水干燥—脱保护基的过程；所说的偶联是在三氯甲烷溶解的酪氨酸或合成过程得到的经脱保护基的短肽中加入偶联原料进行偶联反应；所说的酸碱洗脱是将经偶联过程得到的反应液用碳酸钠溶液、水、柠檬酸溶液萃取洗，且每种溶液洗2～5次，收集有机相；所说的除水干燥是将有机相加无水硫酸镁除水，减压蒸馏除去有机溶剂，得固体再真空干燥；所说的脱保护基是将除水干燥后得到的样品溶于三氯甲烷，加入三氟乙酸溶液或哌啶/三氯甲烷溶液，搅拌脱除BOC保护基或Fmoc保护基；所说的粗品生成是合成五肽后，脱BOC保护基或Fmoc保护基，加入三氟甲磺酸/三氟乙酸、苯甲硫醚或三氟甲磺酸硅烷酯/三氟乙酸、苯甲硫醚脱除剩余保护基，乙醚沉淀，制得粗品。
2.按照权利要求1所述的一锅法液相合成胸腺五肽的工艺，其特征在于，原料中的酪氨酸衍生物是酪氨酸苄酯盐酸盐，合成的二肽是Boc-Val-Tyr(Bzl)Obzl或者是Fmoc-Val-Tyr(Bzl)-Obzl；合成的三肽是Fmoc-Asp(Obut)-Val-Tyr(Bzl)-Obzl或者是Boc-Asp(OBzl)-Val-Tyr(Bzl)-OBzl。
3.按照权利要求1或2所述的一锅法液相合成胸腺五肽的工艺，其特征在于，在粗品生成后，进行纯化处理，以弱酸性和强酸性离子交换树脂纯化粗品，以稀氨水洗脱产物；或以弱碱性和强碱性离子交换树脂纯化粗品，以醋酸进行洗脱。
全文摘要
本发明的一锅法液相合成胸腺五肽的工艺属生物化学领域。以氨基酸衍生物为原料，过程有二肽合成—三肽合成—四肽合成—五肽合成—粗品生成；各肽合成过程包括偶联—酸碱洗脱—除水干燥—脱保护基；其中包括合成二肽Boc－Val－Tyr(Bzl)OBzl或Fmoc－Val－Tyr(Bzl)－OBzl，三肽Fmoc－Asp(Obut)－Val－Tyr(Bzl)－O或Boc－Asp(OBzl)－Val－Tyr(Bzl)－Obzl；粗品生成时以TFMSA系统脱除保护基，最后以离子交换法进行一次产品纯化。本发明工艺简单快速；生产成本低；操作安全；产品的质量也达到国内药检标准，纯度达95％以上。
文档编号C07K14/66GK1442428SQ0311127
公开日2003年9月17日 申请日期2003年3月24日 优先权日2003年3月24日
发明者李惟, 石玉华, 齐岩峰 申请人:吉林大学